专利名称：时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
背景技术：
目前的免疫层析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微球或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微球虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且Stock位移较小，会对检测产生较大的影响。时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一种非同位素荧光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。本发明将时间分辨荧光乳胶微球标记和免疫层析两大技术结合，得到时间分辨荧光免疫层析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay，TRF-LFIA)，幵发出能够精确定量的快速免疫层析检测试纸条。同时，本发明对于传统的免疫层析膜组合方式进行了改进，将原有的四层甚至五层膜系统改变成三层膜系统。传统的免疫层析膜组合方式包括样品垫、滤血膜、结合垫、分离膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫等四到五层(四层则没有滤血功能或者将滤血功能与样品垫功能组合)。GE 公司旗下Whatman开发了具有五合一功能的膜Fusi0n5，集合了上述五种膜的功能，但 Fusion5由于孔径较大，抗体难以固定，需要制备特殊的Stone用于固定抗体，生产工艺较为复杂，仪器设备要求较高，开发的免疫层析试剂只能用于定性检测。本发明利用FUsi0n5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，而且有效的降低了产品的批内差和批间差，提高了检测灵敏度，极具实用价值。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种新型的、能快速定量检测的时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用。本发明一方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，该试纸条包括 Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。其中，Fusi0n5膜上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，T线接上包被抗体或抗原，C线包被亲和素或链霉亲和素。所述时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有针对待测抗原的单抗或者多抗的荧光微球，或者检测微球为表面包被有针对待测抗体的抗原的荧光微球；质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。所述荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物； 最优的，该铕螯合物可为Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Wien。所述生物素标记蛋白可以是任何一种不影响生物素/链霉生物素与亲和素的结合，并可被生物素标记的蛋白。较优的，所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 lOOOnm。硝酸纤维素膜上，T线上包被的抗体为针对待测抗原的单抗或多抗，或者为针对待测抗体的抗原的单抗或多抗；T线上包被的抗原为待测抗原的竞争性抗原。优选的，所述时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。本发明第二方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制备方法， 包括以下步骤(1)质控微球制备1)用生物素标记蛋白；幻采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球。(2)检测微球制备采用针对待测抗原的单抗或多抗、或者采用针对待测抗体的抗原，包被醛基修饰的荧光微球。(3)空白大卡粘贴在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜左右两端分别粘贴吸水纸和Fusi0n5膜。(4)喷膜将质控微球和检测微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion膜的微球区；T线溶液和C线溶液稀释，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线。(5)干燥及切条将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。较优的，步骤中用到的释放缓冲液含有10 40%蔗糖、3 10%海藻糖、 0. 5 N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、0. 2 0. 5%庆大霉素。较优的，步骤中检测微球终浓度0. 5 2mg/ml，质控微球终浓度0. 05 0. 2mg/ml ；T线抗原或则抗体终浓度0. 5 2mg/ml，亲和素或链霉亲和终浓度0. 5 ^iig/ ml ；C、T线喷膜液量为0. 5 2 μ 1/cm,微球喷膜量为2 8 μ 1/cm。较优的，步骤(5)中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37°C烘干6 M小时。本发明第三方面公开了一种时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的应用。本发明的试纸条可通过双抗体夹心法或竞争法原理测定生物分子，适用于所有的采用双抗体夹心法模式或竞争法模式的免疫层析检测。双抗体夹心法待测样品通过层析作用与包被有抗体的时间分辨荧光纳米微球(检测微球)结合，在毛细作用下，依次通过Fusion、硝酸纤维素膜，并与硝酸纤维素膜T 线上固定的另一抗体结合，形成双抗体免疫夹心复合物。在层析过程中，质控微球(表面包被有生物素，混合在检测微球中)也随着样品的移动而前进，并在硝酸纤维素膜C线位置被固定的亲和素捕获，在缓冲液冲洗下，未反应的微球继续移动到吸水垫位置。T线位置捕获的微球量与待测样品中的抗原浓度成正相关，而C线位置捕获的质控微球通常是固定的。 通过时间分辨荧光读条仪对T、C线信号进行扫描，根据T线信号与待测抗原浓度成正相关， 获得待测样品中待测抗原浓度。竞争法待测样品中的抗原分子通过层析作用与过量的标记有抗体的时间分辨荧光纳米微球(检测微球)结合，在毛细作用下，依次通过Fusion、硝酸纤维素膜，未结合抗原的检测微球与硝酸纤维素膜T线上固定的竞争抗原结合，形成抗原抗体复合物。在层析过程中，质控微球(表面包被有生物素，混合在检测微球中)也随着样品的移动而前进，并在硝酸纤维素膜C线位置被固定的亲和素捕获，在缓冲液冲洗下，未反应的微球继续移动到吸水垫位置。T线位置捕获的微球量与待测样品中的抗原浓度成负相关，而C线位置捕获的质控微球通常是固定的。通过时间分辨荧光读条仪对T、C线信号进行扫描，根据T线信号与待测抗原浓度成负相关，获得待测样品中待测抗原浓度。本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内精密度可达10%左右，批间精密度可达15 %，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/dL 甘油三酯、10mg/dL胆红素对本试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。
图1 本发明试纸条结构示意图(1.塑料底板2.Fusi0n5膜3.硝酸纤维素膜 4.吸水纸5.加样区6.微球区7. T线区8. C线区)图2 :CRP试纸条检测标准曲线图3 新喋呤试纸条检测标准曲线
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。实施例1生物素标记Y-球蛋白(BGG)包被的质控微球的制备(1)生物素标记的BGG的制备用0. IM NaCNBH3 将 BGG (购自 Pel-Freez Biological)配制成 10mg/ml 溶液，采用DMSO( 二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS (N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商 SIGMA，产品号:B3295)溶液至 16. 17ang/ml，按照 Img 抗体加入 5. 4ul Biotin-X-X-NHS 的量将Biotin-X-X-NHS液加入到BGG溶液中，混合均勻并在4°C下放置过夜。采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记抗体透析缓冲液(0. IM Tris,0. 3MNaCl, 0. 005MEDTA-Na-2H20, pH8. 0)。透析完毕，BCA法测定蛋白浓度。(2)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的发光微球向IOmg醛基修饰的荧光微球[博阳生物科技(上海)有限公司]中加入6.4μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg上述(1)中透析得到的生物素标记蛋白以及16 μ 1的 NaCNBH3(25mg/ml,0. 05M pH6. 0 的 MES 缓冲液配制，现配现用)，补加 0. IM pH6. OMES 至总体积为400 μ 1，37°避光孵育48h。加入40μ 1的Gly溶液(75mg/ml，0. 05M pH6. 0的 MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250 μ 1 N, 0-双三甲硅基乙酰胺QOOmg/ml， 0. 05M pH6. O的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4°C 13000g离心30分钟。弃上清，用Iml pH6. O的MES缓冲液再洗两次。用Iml 0. 05M pH8. O的HEPES缓冲液 (50mM HEPES,300mM NaCl, 25mMEDTA-Na-2H20,1.6% N, O-双三甲硅基乙酰胺(BSA), 0. 1% Dextran,0. 1% Tween-20,0. 3745% TritonX-405,0. 01%庆大霉素，0· 05% Proclin)悬浮 (其终浓度为10mg/ml)。(3)质控微球工作液配制根据工作需要，采用0. 05M pH8. O的HEPES缓冲液将(2)中悬液稀释到相应浓度， 分装保存。实施例2生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)包被的质控微球的制备(1)生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)的制备用0. IM NaCNBH3将小牛血清白蛋白(购自EQUITECH-BIO INC)配制成10mg/ml溶液，采用DMSO ( 二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS (N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商SIGMA，产品号:B3295)溶液至 16. 17ang/ml，按照 Img 抗体加入 13. 5ulBiotin-X-X_NHS 的量将Biotin-X-X-NHS液加入到小牛血清白蛋白溶液中，混合均勻并在4°C下放置过夜。 采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记抗体透析缓冲液(0. IM Tris, 0. 3M NaCl,0. 005M EDTA-Na_2H20，pH 8. 0)。透析完毕，BCA 法测定蛋白浓度。 (2)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球包被方法与实例1中O)同。(3)质控微球工作液配制配制方法与实例1中(3)同。同理，还可以采用生物素标记的其他蛋白包被荧光微球来制备质控微球。实施例3 C反应蛋白(CRP)时间分辨荧光免疫试纸条1.试纸条成分的制备(1)质控微球的制备质控微球的制备方法参照实施例1或实施例2。(2)检测微球的制备向IOmg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6. 4 μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg C反应蛋白单克隆抗体(博阳生物科技(上海)有限公司) 以及16 μ 1的NaCNBH3(25mg/ml,0. 05M ρΗ6· O的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0. IM pH6. OMES至总体积为400 μ 1，37°避光孵育48h。加入40 μ 1的Gly溶液(75mg/ml,0. 05M PH6.0的MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应浊。加250 μ 1 N，O-双三甲硅基乙酰胺 (200mg/ml，0. 05Μ pH6. O的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4°C 13000g离心30分钟。弃上清，用Iml pH6. O的MES缓冲液再洗两次。用Iml 0. 05M pH8. O的HEPES 缓冲液(5OmM HEPES,300mMNaCl,25mM EDTA-Na-2H20,1. 6% N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)， 0. 1% Dextran,0. 1 % Tween-20,0. 3745% TritonX-405,0. 01%庆大霉素，O. 05% Proclin)悬浮(其终浓度为10mg/ml)。(3)微球溶液的配制用释放缓冲液(含有20%蔗糖、5%海藻糖、0.5% N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、 0. 3%庆大霉素)将质控微球和检测微球配制成微球混合液，质控微球终浓度为0. 2mg/ml, 检测微球终浓度为lmg/ml。(4)检测线(T线)溶液的配制用IOmM PB溶液将CRP单克隆抗体稀释成lmg/ml。(5)质控线(C线)溶液的配制用IOmM PB溶液将亲和素稀释成0. 5mg/ml。2.试纸条的制备(1)空白大卡粘贴按照附图1的膜组合方式，在带有背胶的塑料底板上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素膜左右两端分别粘贴吸水纸和Fusi0n5膜。⑵喷膜分别在图1中T线7、C线8位置喷上T、C线溶液，T、C线喷膜液量为Ιμ /cm;在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为4 μ 1/cm。(3)烘干将步骤O)中喷好试剂的大卡在恒温烘箱中37°C烘干M小时。(4)切条及装卡将烘干的CRP大卡切割成4mm宽度的纸条，装配到塑料壳中，形成C反应蛋白检测板。3.试纸条的定量检测(1)标准曲线绘制在制备好的CRP试纸条(批号2009032 加样区中加入不同浓度的CRP抗原标准品(取六个不同的浓度，分别为O、1、10、20、100、200mg/L，每个浓度设5个重复)，滴加上样缓冲液(PBS，含有1.6% N, O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，O. 1 % Tween20，防腐剂)，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号，实验结果及分析见表1 表1 CRP标准品检测结果
权利要求
1.一种时间分辨荧光免疫定量检测试纸条，其特征在于，包括Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，检测线上包被抗体或抗原，质控线上包被亲和素或链霉亲和素。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有针对待测抗原的单抗或多抗的荧光微球，或者检测微球为表面包被有针对待测抗体的抗原的荧光微球；质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。
3.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为 100 lOOOnm。
4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述检测线上包被抗体为针对待测抗原的单抗或多抗，或者为针对待测抗体的抗原的单抗或多抗；检测线上包被抗原为待测抗原的竞争性抗原。
5.一种如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其制备步骤如下(1)质控微球制备a)用生物素标记蛋白；b)采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；(2)检测微球制备采用针对待测抗原的单抗或多抗，或者采用针对待测抗体的抗原， 包被醛基修饰的荧光微球；(3)空白大卡粘贴将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，Fusion膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；(4)喷膜将质控微球和检测微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到Fusion 膜的微球区；T线溶液和C线溶液稀释，分别喷到硝酸纤维素膜的T线和C线；(5)干燥及切条。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤中释放缓冲液组成为10 40%蔗糖、3 10%海藻糖、0. 5 N，0-双三甲硅基乙酰胺、0. 2 0. 5%庆大霉素。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)稀释后检测微球终浓度为 0. 5 2mg/ml，质控微球终浓度0. 05 0. 2mg/ml ；T线抗原或抗体终浓度0. 5 2mg/ml， 亲和素或链霉亲和素终浓度0. 5 2mg/ml ；C、T线喷膜液量为0. 5 2 μ 1/cm,微球喷膜量为 2 8μ 1/cm。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中烘干条件为37°C烘干6 24小时。
9.如权利要求1所述的试纸条的应用，其特征在于，该试纸条用于采用双抗体夹心法模式或竞争法模式的免疫层析的定量检测。
全文摘要
本发明公开了一种快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用。该试纸条由Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分组成，通过双抗体夹心法或竞争法原理，利用时间分辨荧光微球作为免疫标记物，对待测抗原或抗体进行准确快速的定量检测。
文档编号G01N33/533GK102192983SQ20111013014
公开日2011年9月21日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者吴茜, 王海蛟, 石晓强, 赵卫国, 马顺华 申请人:博阳生物科技(上海)有限公司