专利名称：一种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法
技术领域：
本发明属于蜂蜜中转基因成分检测技术领域，具体涉及一种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法。
背景技术：
食品安全历来是各国政府、媒体、消费者所共同关注的敏感问题。针对转基因食品安全性的争论从始至今从未停息，也没有任何公认结论。蜂蜜因含有蜜源植物花粉而成为与转基因植物相关的特殊产品。蜂蜜中花粉主要来源于蜂群采集，另外一些蜂农为使蜂蜜具有了不同的香型和风味人为地添加。如果这些花粉来自转基因作物，则蜂蜜中可能含有转基因成分。蜂蜜是我国传统大宗出口农副产品，产量、出口量始终稳居于世界各国前列。欧 盟、日韩等国是我国蜂蜜重要的出口市场，对转基因产品的限制政策，可能成为继抗生素残留、农药残留问题后新的技术壁垒。本项研究以油菜蜜、棉花蜜为研究对象开展蜂蜜中转基因成分快速检测研究，正是为突破发达国家可能设置的新的技术壁垒作好技术上的应对准备；另一方面，近年来市场上产自美国、阿根廷、巴西等国的进口蜂蜜也越来越常见，这些国家是主要的转基因作物种植区。我们也可以设置相关技术壁垒，以保护我国的经济利益和消费者权益。
发明内容
本发明的目的建立起转基因棉花和油菜花粉的典型特征图谱，通过镜检可以快速简便地初步判断蜂蜜中含有转基因作物花粉的可能性，也可以用于蜂蜜品种判断，特别是做出是否含有棉花蜜、油菜蜜的初步判断。本发明的目的是这样实现的，所述的一种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，依序包括如下步骤
(I)采用负压抽滤法和离心法分离蜂蜜样品中的花粉；
a)负压抽滤法分离花粉将蜂蜜样品稀释后负压抽滤后，用蒸馏水冲洗滤膜以除去糖分。将滤膜置于50mL离心管中，加入5mL蒸馏水在漩涡振荡器上激烈振荡I分钟，取出滤膜。3000 rpm离心30min,弃上清液，留0. 5mL备用；
b)离心法抽提花粉将蜂蜜样品稀释、离心后，弃去上清液，加适量蒸馏水重新震荡悬浮，再次离心30分钟，弃去上清液，如此重复两次。最后剩下0. 5mL花粉溶液备用。(2)制作花粉样品显微观察玻片
a)油胶的制备称取动物明胶Ig置于50mL小烧杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小时，待其溶化后加入7mL甘油，加热并轻轻搅拌，尽量少产生气泡，至完全均匀后冷却备用；
b)乙酸酐硫酸混合液的配置将27mL乙酸酐置于50mL小烧杯中，搅拌中缓缓加入3mL浓硫酸,搅拌均勻备用；
c)G.Erdtman乙酸酐分解法将制备好的花粉先用2mL乙酸浸泡l_2h, 3000rpm离心IOmin,弃去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 1)混合液5mL,水浴煮沸2_3分钟，3000rpm离心10分钟，弃上层溶液；加入5mL蒸懼水振荡使花粉重新悬浮,3000rpm离心IOmin,弃上层溶液。重复两次，剩下少量处理后花粉溶液备用；
d)制片方法将一小滴热水浴溶化的甘油胶滴在预先烤热的载玻片上，用移液器移取IOuL花粉溶液或经乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油胶上，然后将盖玻片在酒精灯上烤热后迅速盖上。要求400倍显微镜下每个视野4-8个花粉为宜。待甘油胶冷凝后用加拿大树胶封边,可制成永久片。(3)花粉的测量
使用经过校准的目镜测微尺的Leica DMLS型光学显微镜测量自然状态下的花粉和经过乙酸酐分解法除去原生质的花粉，每种花粉分别测定30个随机样本求平均值。( 4 )标准图谱的摄制 拍摄棉花和油菜花粉的标准图谱。 (5)蜜源植物判别
在400倍显微镜下观察已制好的花粉片，连续选择不少于40个不同视野，观察记录占主要比例的1-5种花粉，总花粉数在150-300之间较为适宜。所述的蜂蜜样品如有结晶，应先在40°C水浴中完全融化。所述的负压抽滤法分离花粉，样品稀释比例为I :10 ;离心法抽提花粉样品稀释比例为I : 10后，离心转速为3000 rpm，时间为30分钟。所述的乙酸酐硫酸混合液的配置比例为9:1。所述的花粉的测量使用的是经过校准的目镜测微尺的Leica DMLS型光学显微镜，分别测量自然状态下的花粉和经过乙酸酐分解法除去原生质的花粉，每种花粉取随机30个重复求平均值。所述的标准图谱的制作使用的是Leica DMLS型光学显微镜500万像素数码相机和KEYENCE公司VHX-600E 5400万像素3CXD超景深三维显微系统，分别拍摄棉花和油菜花粉。所述的蜜源植物花粉的观察选用放大400倍的显微镜下进行，连续选择不少于40个不同视野。所述的检样中分离的花粉，对照建立的标准图谱，未发现典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含转基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果镜检发现存在典型或疑似棉花、油菜花粉，则需进一步确定。
图I棉花自然形态花粉三维图像。图2棉花自然形态花粉图像。图3乙酸酐分解后棉花花粉形态。图4棉花花粉细网状纹理。图5普通显微镜下棉花花粉图像(具圆形散孔，无孔盖)。图6自然油菜花粉形态。图I粗网状雕纹。
图8乙酸酐分解后油菜花粉形态图。图9普通显微镜下油菜花粉图像。图10南瓜花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的显微照片(加厚凸起的孔盖)。图11西葫芦花粉(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的显微照片(加厚凸起的孔盖)。图12洋槐花粉及局部放大的颗粒状雕纹。图13鸭脚木花粉(2)和乙酸酐分解后花粉(I、3)的显微照片。图14苕条花粉(I)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的显微照片。图15苹果花粉[(1、2)和乙酸酐分解后花粉(3)的显微照片。
图16中国李花粉[(1)和乙酸酐分解后花粉(2、3)的显微照片。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。I.材料与仪器
I.I材料
棉花蜜样品来自池州高岭乡驻架村采样点；油菜蜜样品来自庐江县刘守乡等采样点；
1.2仪器
MILLIPORE MILLIFLEX PLUS过滤系统；台式高速冷冻离心机(BECKMAN 64R)；
KEYENCE公司VHX-600E 5400万像素3CCD超景深三维显微系统；Leica DMLS型光学显微镜。2.方法
2.I花粉的分离(如有结晶应先在40°C水浴中完全融化)；
2. I. I负压抽滤法分离花粉
将样品I :10稀释后负压抽滤后，用蒸馏水冲洗滤膜以除去糖分。将滤膜置于50mL离心管中，加入5mL蒸馏水在漩涡振荡器上激烈振荡I分钟，取出滤膜。3000 rpm离心30min,弃上清液，留0. 5mL备用；
2. I. 2离心法抽提花粉
将样品I :10稀释后，3000 rpm离心30分钟，弃去上清液，加适量蒸馏水重新震荡悬浮，再次离心30分钟，弃去上清液，如此重复两次。最后剩下0. 5mL花粉溶液备用；
2. 2制片
2. 2. I油胶的制备
称取动物明胶Ig置于50 mL小烧杯中,加入6 mL蒸懼水浸泡2小时,待其溶化后加入7mL甘油，加热并轻轻搅拌，尽量少产生气泡，至完全均匀后冷却备用；
2.2. 2乙酸酐硫酸(9 1)混合液的配置
将27mL乙酸酐置于50 mL小烧杯中，搅拌中缓缓加入3mL浓硫酸，搅拌均匀备用；
2.2. 3 G. Erdtman乙酸酐分解法
将制备好的花粉先用2mL乙酸浸泡l-2h, 3000rpm离心IOmin,弃去乙酸,再加入乙酸酐硫酸(9 I)混合液5mL，水浴煮沸2-3分钟，3000rpm离心10分钟，弃上层溶液；加入5mL蒸馏水振荡使花粉重新悬浮，3000rpm离心lOmin，弃上层溶液。重复两次，剩下少量处理后花粉溶液备用；2.2. 4制片方法
将一小滴热水浴溶化的甘油胶滴在预先烤热的载玻片上，用移液器移取IOy L花粉溶液或经乙酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油胶上，然后将盖玻片在酒精灯上烤热后迅速盖上。要求400倍显微镜下每个视野4-8个花粉为宜。待甘油胶冷凝后用加拿大树胶封边,可制成永久片；
2.3花粉测量
使用具经过校准的目镜测微尺的Leica DMLS型光学显微镜测量自然状态下的花粉和经过乙酸酐分解法除去原生质的花粉，每种花粉分别测定30个随机样本求平均值；
表I自然状态花粉测量数据表
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表2.经乙酸酐分解法处理的花粉测量数据表
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2.4标准图谱的摄制
使用Leica DMLS型光学显微镜500万像素数码相机和KEYENCE公司VHX-600E 5400万像素3CCD超景深三维显微系统分别拍摄棉花和油菜花粉；
2.5蜜源植物判别
在400倍显微镜下观察已制好的花粉片，连续选择不少于40个不同视野，观察记录占主要比例的1-5种花粉，总花粉数在150-300之间较为适宜；
当检样中分离的花粉，对照建立的标准图谱，未发现典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含转基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果镜检发现存在典型或疑似棉花、油菜花粉，则需进一步确定。3.结果与分析
3.I花粉分离方法比较
因蜂蜜中杂质颗粒较多，过滤超过50mL就会非常缓慢和困难，收集花粉量较少。离心法抽提花粉相对较为方便易行，并易于获取较大量花粉；
3.2经乙酸酐处理，会造成花粉变形、测量值会因此产生较大变化。大小应以自然状态为准。原先饱满的花粉粒变得中心塌陷变形，可能是部分内容物溢出造成的；3.3经乙酸酐分解后，花粉表面结构纹饰更加清晰。图3显示无盖散孔更加清晰易于分辨，是棉花花粉重要形态特征；图8清晰显示油菜花粉花粉壁层次清晰、外厚内薄的特占.
3.4显微观测花粉时普通光学显微镜能分别观测到不同焦距平面的清晰图像(如图5)，但无法看到如图I这样立体图像。花粉直径越大这种情况越明显；
3.5.棉花花粉基本特征
球形或近球形，直径100 y m左右，密布8-11 y m长刺状雕纹、除刺外尚具细网状纹理；具8-16个圆形散孔，无孔盖；
3.6油菜花粉基本特征
近球形或球形，呈草绿色，直径28 y m左右，大多具三沟、也有部分具四沟，外壁厚约2.5um,内层薄，层次明显，表面具粗网状雕纹；
表3与棉花、油菜花粉近似蜜源植物花粉特征比较
权利要求
1.一种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，依序包括如下步骤 (1)采用负压抽滤法和离心法分离蜂蜜样品中的花粉 a)负压抽滤法分离花粉将蜂蜜样品稀释后负压抽滤后，用蒸馏水冲洗滤膜以除去糖分； 将滤膜置于50mL离心管中，加入5mL蒸馏水在漩涡振荡器上激烈振荡I分钟，取出滤膜；3000 rpm离心30min,弃上清液，留O. 5mL备用； b)离心法抽提花粉将蜂蜜样品稀释、离心后，弃去上清液，加适量蒸馏水重新震荡悬浮，再次离心30分钟，弃去上清液，如此重复两次；最后剩下O. 5mL花粉溶液备用；(2)制作花粉样品显微观察玻片 a)油胶的制备称取动物明胶Ig置于50mL小烧杯中，加入6 mL蒸懼水浸泡2小时，待其溶化后加入7mL甘油，加热并轻轻搅拌，尽量少产生气泡，至完全均匀后冷却备用； b)こ酸酐硫酸混合液的配置将27mLこ酸酐置于50mL小烧杯中，搅拌中缓缓加入3mL浓硫酸,搅拌均勻备用； c)G.Erdtmanこ酸酐分解法将制备好的花粉先用2mLこ酸浸泡l_2h, 3000rpm离心IOmin,弃去こ酸,再加入こ酸酐硫酸(9 1)混合液5mL,水浴煮沸2_3分钟，3000rpm离心10分钟，弃上层溶液；加入5mL蒸懼水振荡使花粉重新悬浮,3000rpm离心IOmin,弃上层溶液；重复两次，剩下少量处理后花粉溶液备用； d)制片方法将ー小滴热水浴溶化的甘油胶滴在预先烤热的载玻片上，用移液器移取10 μ L花粉溶液或经こ酸酐分解后的花粉溶液，小心滴在甘油胶上，然后将盖玻片在酒精灯上烤热后迅速盖上；要求400倍显微镜下每个视野4-8个花粉为宜；待甘油胶冷凝后用加拿大树胶封边,可制成永久片；(3)花粉的測量 使用经过校准的目镜测微尺的Leica DMLS型光学显微镜測量自然状态下的花粉和经过こ酸酐分解法除去原生质的花粉，每种花粉分别测定30个随机样本求平均值；(4)标准图谱的摄制 拍摄棉花和油菜花粉的标准图谱；(5)蜜源植物判别 在400倍显微镜下观察已制好的花粉片，连续选择不少于40个不同视野，观察记录占主要比例的1-5种花粉，总花粉数在150-300之间较为适宜。
2.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是蜂蜜样品如有结晶，应先在40°C水浴中完全融化。
3.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是负压抽滤法分离花粉，样品稀释比例为1:10 ;离心法抽提花粉样品稀释比例为I :10后，离心转速为3000 rpm,时间为30分钟。
4.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是こ酸酐硫酸混合液的配置比例为9:1。
5.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是花粉的測量使用的是经过校准的目镜测微尺的Leica DMLS型光学显微镜，分别测量自然状态下的花粉和经过こ酸酐分解法除去原生质的花粉，每种花粉取随机30个重复求平均值。
6.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是标准图谱的制作使用的是Leica DMLS型光学显微镜500万像素数码相机和KEYENCE公司VHX-600E 5400万像素3CXD超景深三维显微系统，分别拍摄棉花和油菜花粉。
7.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是蜜源植物花粉的观察是选用放大400倍的显微镜下进行，连续选择不少于40个不同视野。
8.如权利要求I所述的ー种鉴定蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉的形态学方法，其特征是当检样中分离的花粉，对照建立的标准图谱，未发现典型或疑似棉花、油菜花粉，可直接判定蜂蜜不含转基因成分或不含棉花、油菜蜜；如果镜检发现存在典型或疑似棉花、油菜花粉，则需进ー步确定。
全文摘要
本发明涉及一种蜂蜜中主要转基因蜜源植物花粉鉴定的形态学方法。该方法包括如下操作步骤(1)蜂蜜样品中花粉的分离；(2)制作花粉样品显微观察玻片；(3)花粉粒径测量；(4)花粉标准图谱的摄制；(5)蜜源植物的判别；本发明通过对棉花和油菜花粉显微形态的研究，建立标准花粉图谱，以显微镜检的方式快速排除不含上述作物花粉的蜂蜜，可用于快速甄别蜂蜜中是否还有转基因成分。
文档编号G01N21/84GK102830119SQ20111015815
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者余晓峰, 郑海松, 祝长青, 张霞, 姚剑, 孙娟娟, 宗凯 申请人:安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心