专利名称：一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法
技术领域：
本发明属于生物技术及植物检疫领域；更具体地，本发明涉及一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法。
背景技术：
ELISA和多种PCR是目前病毒检测的主要方法。然而，目前国内缺乏大多数检疫性病毒的抗体(实际检测中多从国外高价购买)。同时，基于抗体的ELISA检测方法灵敏度有限。另一方面，PCR检测技术受RNA提取质量、模本DNA含量、引物和PCR条件等多因素影响，在实际检测过程中可能存在较高的假阳性或假阴性风险。此外，通常的ELISA和PCR方法都仅针对一种病毒的检测，尽管有报道利用多重PCR同时检测多重病毒，但本申请人在实际应用中发现三重以上PCR检测方法受待检病毒种类、检测样品、引物和PCR条件等多重因素的影响，检测结果重复性很差、难以推广应用。液相芯片(Liquid chip)是在液态悬浮体系中进行生物分子互作反应的一类新型生物芯片技术，又称为多功能悬浮点阵(Multi-analyte suspension array，MASA)、 Flexible multi-analyte profiling(xMAP)或流式荧光技术等。液相芯片体系是由许多大小均一的圆形微球为主要基质所构成，通常微球由聚苯乙烯制成。目前开发的液相芯片技术和检测装置如 Luminex 100/200, Bio-Rad VersArray ChipRe ader)。液相芯片技术已被应用于病原体、细胞因子、肿瘤标志物和激素等的诊断检测。目前，国内外还未见利用液相芯片技术对植物病毒进行高通量检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法。在本发明的第一方面，提供一种同时检测番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)和南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的方法，该方法包括(1)提供已包被抗体的微球，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄环斑病毒的捕获抗体，微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体；将待测样品与已包被抗体的微球混合，从而使待测样品中的番茄环斑病毒和/或南芥菜花叶病毒与捕获抗体及微球形成“病毒-捕获抗体-微球”复合物；所述的微球1和微球2具有不同的微球识别信号；(2)将步骤(1)形成的复合物与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体和抗南芥菜花叶病毒的检测抗体混合，从而形成“检测抗体-病毒-捕获抗体-微球”复合物；(3)检测( 形成的复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物，从而确定待测样品中番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的存在与否以及存在的量；附加条件是待测样品、已包被抗体的微球、检测抗体的混合，可依次进行，也可同时进行。
在另一优选例中，所述的捕获抗体是多克隆抗体。在另一优选例中，所述的捕获抗体的包被浓度是40士20 (较佳地，40士 10) μ g/
mLo在另一优选例中，所述的检测抗体是单克隆抗体；并且，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10士5 μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是 6 + 3 μ g/mL0在另一优选例中，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10 士 3yg/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6 士 2 μ g/mL。在另一优选例中，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10 士 2μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6士 1 μ g/mL。在另一优选例中，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10士 1 μ g/mL;或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6 士0. 5 μ g/mL。在另一优选例中，所述的可检测标记物是生物素，步骤O)中还包括加入链亲和素-藻红蛋白。在另一优选例中，所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体的质量比是(0.3-0. 4) 1 ；或所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是(0. 2-0. 3) 1。在另一优选例中，所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体的质量比是0.35 1 ；或所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是 0. 25 1。在另一优选例中，所述已包被抗体的微球中，每种微球的量为(6-10) X IO4个/mL。在另一优选例中，所述已包被抗体的微球中，每种微球的数量为(7-9)父104个/ mL ；更佳地为8 X IO4个/mL。在另一优选例中，两种微球是等量混合的。在另一优选例中，所述的微球1与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体的体积比是1 3;所述的微球2与带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的体积比是 1 2。在本发明的另一方面，提供一种用于同时检测番茄环斑病毒(ToRSV)和南芥菜花叶病毒(ArMV)的液相芯片，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄环斑病毒的捕获抗体，微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体。在另一优选例中，所述的捕获抗体是多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种用于检测番茄环斑病毒(ToRSV)和南芥菜花叶病毒(ArMV)的试剂盒，其包括(a)所述的已包被抗体的微球；(b)带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体，其浓度是10士5μ g/mL(较佳地是10 士 3 μ g/mL ；更佳地是10 士 2 μ g/mL ；进一步更佳地是10 士 1 μ g/mL)；以及(c)带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体，其浓度是6士3 μ g/ mL (较佳地是6 士 2 μ g/mL ；更佳地是6 士 1 μ g/mL ；进一步更佳地是6 士 0. 5 μ g/mL)。在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的可检测标记物是生物素，且该试剂盒还包括链亲和素-藻红蛋白。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括标准品和/或对照品。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括杂交液，洗涤液等。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，将针对两种植物病毒的捕获抗体分别固定在不同微球 (Beads)上，并且本发明人还根据病毒自身因素以及混合体系的特点，优化了检测抗体、微球以及标志物(标记物)等的用量、比例，建立了液相芯片检测方法，从而大大提高了病毒检测的敏感性和准确率，最大限度降低了背景信号的产生。基于此完成了本发明。术语如本文所用，“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于固定于微球上的、特异性抗一种病毒或病毒蛋白的抗体。作为本发明的优选方式，所述的捕获抗体是抗病毒的多克隆抗体。如本文所用，“检测抗体”、“第二抗体”、与“二抗”可互换使用，都是指特异性抗一种病毒或病毒蛋白的抗体。对于同一种病毒而言，相应的捕获抗体和检测抗体是不同的，并且可同时结合于所述的病毒或病毒蛋白上的不同表位。作为本发明的优选方式，所述的检测抗体是抗病毒的单克隆抗体。如本文所用，所述的“微球识别信号”是指位于微球上的，用于区别不同的捕获抗体的识别信号。为了方便起见，对于固定有同一种捕获抗体的微球，微球识别信号优选是相同的。优选的，所述的微球识别信号是荧光信号，并且，对于固定有不同种捕获抗体的微球， 荧光的色彩是不同的，对于固定有同种捕获抗体的微球，荧光的色彩优选是相同的。如本文所用，所述的“可检测标记物”是指与检测抗体结合或耦联的、用于显示 (或作为显示标志的)检测抗体与相应的病毒或病毒蛋白发生结合的信号。在本发明的优选方式中，所述的可检测标记物是生物素，该生物素作为显示标志， 当与链霉菌亲和素偶联的藻红蛋白(链亲和素-藻红蛋白，又称为PE标记的链亲和素， SA-R-PE)结合后，通过激光激发产生荧光信号。基本原理本发明的基本原理是双抗夹心法结合液相芯片技术。双抗夹心法常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与带标记的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。对上述双抗夹心法进行改进的是将所述的一抗固定于携带特定可检测信号的微球上，制备液相蛋白芯片，通过采用液相蛋白芯片进行检测的原理是使单个微球通过检测通道，并使用两种激光同时对微球上的微球识别信号和可检测信号进行检测。一种激光激发的是微球上的微球识别信号，根据微球上的不同种识别信号，可以将微球分类，从而将各个不同的结合反应区分开来。另一种激光激发的是可检测信号，目的是确定微球上结合的可检测信号的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此，通过两种激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量。
本发明优化了各试剂用量和条件参数，以在检测多于一种病毒时提交效率和准确性。抗体包被微球所述的液相芯片包括2种不同的微球，所述的微球上固定有不同的捕获抗体，其中，所述的捕获抗体为抗番茄环斑病毒的抗体和抗南芥菜花叶病毒的抗体。本发明中，将捕获抗体固定在微球上的详细操作程序可用常规方法，例如按照 Luminex公司的产品说明书或网站www. luminexcorp. com中所述的方法进行偶连，从而得到不同微球与相应捕获抗体形成的耦连物。所述的不同的微球是具有不同微球识别信号的微球，由于带有不同的微球识别信号，使不同微球之间可被区分。在本发明的优选方式中，所述的微球识别信号为荧光信号， 并且，微球上的荧光信号因固定于微球上的相应的捕获抗体的不同而不同。本发明所述的微球可以采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。并且，所述的微球的平均直径为1-100 μ m ；更优选的，所述的微球的平均直径为2-50 μ m，更优选的，所述的微球的平均直径为2-10μπι。在另一优选例中，本发明所用的微球是一种直径 5. 5-5. 6 μ m，以不同荧光标记的微球。在本发明的一种优选方式中，在一个反应体系中(如约20 μ L体系)，每一种固定有不同的捕获抗体的微球的用量为(6-10) X IO4个/mL;更优选的为(7_9) X IO4个/mL ；最优选地是8 X IO4个/mL。检测方法为了同时地检测所述的病毒，本发明人对采用所述液相芯片的检测方法进行了优化，以保证能够从样品中精确地检出病毒的存在情况以及存在量，提高检出率。本发明人在深入研究后发现，针对同时检测番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)和南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的情况，在利用液相芯片进行检测时，最为关键的影响因素是检测抗体的工作浓度，微球和检测抗体的比例。本发明中，每一种检测抗体分别抗一种相应的植物病毒，且对应于相应的捕获抗体。在本发明的优选方式中，在利用检测抗体进行检测时，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10士5μ g/mL ；较佳地是10士3μ g/mL ；更佳地是10士2 μ g/mL ；最佳地是10士 1 μ g/mL。所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6士3 μ g/mL;较佳地是 6 士 2 μ g/mL ；更佳地是 6 士 1 μ g/mL ；最佳地是 6 士0. 5 μ g/mL。在本发明的优选方式中，在利用检测抗体进行检测时，所述的微球1与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体的体积比是1 3;所述的微球2与带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的体积比是1 2。可选用多种可检测信号来标记所述的检测抗体。比如，所述的可检测信号选自 FITC、CY3、CY5、藻蓝蛋白、Alexa Fluor Dyes、BODIPY Dyes、俄勒冈绿染料(Oregon Green Dyes)、得克萨斯红染料(Texas Red Dye)，或若丹明(Rhodamine)。在本发明的一种优选方式中，采用生物素作为可检测标记物。生物素的标记方法是本领域技术人员熟知的。对应于可检测标记物的检测物质为能够与可检测标记物相结合并能够报告所述结合的分子(报告分子)。当采用生物素来标记检测抗体时，可采用链亲和素-藻红蛋白作为报告分子。作为本发明的优选方式，所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体的质量比是(0.3-0.4) 1;较佳地为是0.35 1。所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是(0.2-0.3) 1;较佳地为0.25 1。本发明中，可用所述的液相芯片进行检测的样品包括任何提取自植物的提取物 (可以是液态或固态)，或由植物加工成的各类物质。为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置阳性病毒对照和阴性对照。此外， 为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的病毒的标准品。对照或标准品的设置方法采用常规的方法。在本发明的实施例中，运用优化的试验条件，得出同时检测ArMV和ToRSV的最佳工作条件。ArMV单抗工作浓度为6 μ g/mL，单抗与藻红蛋白的质量比为1 0. 25，单抗与微球的体积比为2 1 ;ToRSV最优反应条件为二抗工作浓度为10yg/mL，二抗与藻红蛋白的质量比为1 0.35，二抗与微球的体积比为3 1，液相芯片每次使用的样本量为10yL，检测过程为一个半小时。而ELISA检测至少需要50yL，检测时间为数小时以上。并且，多次试验得出结论液相芯片的检测灵敏度普遍高于ELISA 5-10倍。试剂盒本发明的液相(蛋白)芯片检测试剂盒可以将液相芯片技术与免疫学方法相结合，对两种植物病毒进行同时进行精准、快速地定量分析。本发明的用于检测两种植物病毒的试剂盒包括以下组分第一容器，以及装于该容器中的本发明所述的已包被捕获抗体的微球。在本发明的优选方式中，所述的试剂盒还包括第二容器，以及装于该容器中的带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体，其浓度是10士5 μ g/mL ；较佳地是 10士3 μ g/mL ；更佳地是 10士2 μ g/mL ；最佳地是 10士 1 μ g/mL。。在本发明的优选方式中，所述的试剂盒还包括第三容器，以及装于该容器中的带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体，其浓度是6士3 μ g/mL;较佳地是 6 士 2 μ g/mL ；更佳地是 6 士 1 μ g/mL ；最佳地是 6 士0. 5 μ g/mL。在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包括标准品、或对照品。其它用于进行杂交或酶联检测所需的试剂也可被包含在本发明的试剂盒中。本发明的试剂盒中还可包含使用说明书，以指导人们按照正确的流程、条件、剂量来实施检测。本发明的主要优点在于第一，本发明建立了双重液相芯片方法，可以同时对某一个体样品中的番茄环斑病毒(ToRSV)和南芥菜花叶病毒(ArMV)进行定性和定量分析，所需的样本量低，准确率高。第二，由于对微球带有的捕获抗体、相应的检测抗体、标记物的量进行配比设计， 从而使得两种植物病毒均可灵敏地被检测。并且，最大限度降低了不同分析物在杂交时存在的非特异性的结合，从而大大降低了背景信号的产生。同时也节省了大量时间与资金。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法聚苯乙烯荧光微球(ArMV编号为37，ToRSV编号为19，每种均带有独特的荧光光谱)购自Luminex。链霉菌亲和素(链亲和素)_藻红蛋白(SA-R-PE)购自hvitrogen公司。抗ArMV、 ToRSV的单抗和多抗均购自中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所。以多抗作为捕获抗体，以单抗作为检测抗体。番茄环斑病毒(I10RSV)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot irus，TRSV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus, TBRV)和草莓潜隐环斑病毒(Strawberry latent ringspot virus, SLRSV)阳性对照购自美国阿格迪(Agdia)公司。样本状态为带毒烟草叶片冻干粉，于4°C冰箱保存。阴性对照池(pool)的制备方法确定为阴性的植物叶片，包括豌豆、苋菜、西瓜、大豆、辣椒、黄瓜、芹菜、番茄等共8 份，每份取IOOmg,按照1 (叶片)10(缓冲液)加入0. OlM PB缓冲液(0. 94g Na2HPO4,0. 45g KH2PO4定容至1L)研磨混勻为pool，然后分装，备用。微球的准备微球直径为5. 6 μ m，表面带有羧基，以共价结合生物分子。首先，将4°C保存的微球放置于室温20 30min，涡旋微球O !Min为宜)，按需要量(如包被的微球量可做 200次检测，每次检测需要2000个微球，则需要4X IO5个微球。微球的商品包装规格为 1. 25 XlOVmL,则这次包被需要微球为32 μ L)吸取荧光微球加入到1. 5毫升的离心管中， 130001~/1^11离心細^1去除保护液，用三蒸水洗涤后，用40(^1^ 0. IM ρΗ 6. 2磷酸缓冲液重悬微球。加入 10 μ L 50mg/mLSulfo-NHS 和 10μ L 50mg/mL EDC，混勻后 37°C作用 20min。 离心去上清，待用。微球的包被将待包被的微球GX IO5个微球)用900 μ L 0. 05Μ MES重新悬浮，离心去上清， 洗涤微球两次。用400 μ L 0. 05Μ MES重悬微球，加入提纯的抗ToRSV多抗和(或)抗ArMV 多抗(各自浓度均是40 μ g/mL)，混勻后37°C作用2 3h (期间，每隔15min涡旋混勻一次)。离心去上清，加入 900 μ L PBS-TBN (含有 0.05% Tween-20、0. 1 % BSA、0. 05%叠氮钠的0.01M PBS)重悬微球，混勻后离心去上清，洗涤微球两次。加入200 μ L PBS-TBN重悬微球。用血细胞计数器进行计数。微球上单位面积的量是KT9IgG/微球。液相蛋白芯片单一病毒检测程序取10 μ L样本，向其中加入对应的包被好多抗的微球20 μ L(工作浓度为8Χ IO4个 /mL,涡旋微球数秒)，37°C避光振荡作用30min。加入20μ L生物素标记的检测抗体(初定8μ g/mL)与链亲和素-藻红蛋白 (SA-R-PE, lmg/mL)的混合物，质量比初定为检测抗体链亲和素-藻红蛋白=1 0. 3， 37°C避光震荡作用45min。
加入100 μ L终止液，将悬液转移至96孔可拆卸酶标反应板，通过 Bio-plexTM200system仪器检测荧光强度值(median fluorescence intensity，MFI)，并用 Bio-Plex Manager5. O 软件分析数据。检测2种病毒的Plex检测体系建立优化得出同时检测ArMV和I10RSV最佳的反应体系，两种微球分别包被上抗ArMV 病毒和抗ToRSV病毒的多克隆抗体，等量混合(每种4X IO4个/mL)，不同工作浓度、不同体积的两种检测抗体(均为生物素标记的)同时加入到一个反应体系中，再向其中加入链亲和素-藻红蛋白(SA-R-PE)，进行测定。其它条件同前述方法。最佳试验条件的确定反复试验后，本发明人筛选出3个对实验影响较显著的因素，每个因素分为三个等级(表1)，检测的抗原浓度一定(抗原按1 100倍稀释)。按照表1的实验交叉反应， 分别测出不同的荧光强度值。实验重复3次。表1、因素变化表
权利要求
1.一种同时检测番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus)和南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus)的方法，其特征在于，该方法包括(1)提供已包被抗体的微球，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄环斑病毒的捕获抗体，微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体；将待测样品与已包被抗体的微球混合，从而使待测样品中的番茄环斑病毒和/或南芥菜花叶病毒与捕获抗体及微球形成“病毒-捕获抗体-微球”复合物；所述的微球1和微球2具有不同的微球识别信号；(2)将步骤(1)形成的复合物与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体和抗南芥菜花叶病毒的检测抗体混合，从而形成“检测抗体-病毒-捕获抗体-微球”复合物；(3)检测( 形成的复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物，从而确定待测样品中番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的存在与否以及存在的量；附加条件是待测样品、已包被抗体的微球、检测抗体的混合，可依次进行，也可同时进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获抗体是多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测抗体是单克隆抗体；并且，所述的抗番茄环斑病毒的检测抗体的浓度是10士5μ g/mL ；或者所述的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的浓度是6 士 3yg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物是生物素，步骤O)中还包括加入链亲和素-藻红蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的链亲和素-藻红蛋白与抗番茄环斑病毒的检测抗体的质量比是(0.3-0.4) 1 ；或所述的链亲和素-藻红蛋白与抗南芥菜花叶病毒的检测抗体的质量比是(0.2-0.3) 1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已包被抗体的微球中，每种微球的量为 (6-10) X IO4 个 /mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微球1与带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体的体积比是1 3;所述的微球2与带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的体积比是1 2。
8.一种用于同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的液相芯片，其特征在于，其包括微球1和微球2，微球1上固定有抗番茄环斑病毒的捕获抗体，微球2上固定有抗南芥菜花叶病毒的捕获抗体。
9.一种用于检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的试剂盒，其特征在于，其包括(a)权利要求7所述的已包被抗体的微球；(b)带有可检测标记物的抗番茄环斑病毒的检测抗体，其浓度是10士 5μ g/mL ；以及(c)带有可检测标记物的抗南芥菜花叶病毒的检测抗体，其浓度是6士3μ g/mL。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测标记物是生物素，且该试剂盒还包括链亲和素-藻红蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种同时检测番茄环斑病毒和南芥菜花叶病毒的方法。本发明人将针对两种植物病毒的捕获抗体分别固定在不同微球上，并且还根据病毒自身因素以及混合体系的特点，优化了检测抗体、微球以及标记物等的用量、比例，建立了液相芯片检测方法，从而大大提高了病毒检测的敏感性和准确率，最大限度降低了背景信号的产生。
文档编号G01N33/577GK102253212SQ201110168930
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者于翠, 代欢欢, 张舒亚, 杨翠云 申请人:上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心