专利名称：一种检测h5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒。
背景技术：
H5亚型禽流感病毒为OIE规定的需申报的禽流感病毒，各国在进出口动物检疫和国内疫情普查过程中非常重视。在各国的家禽及其产品的进出口贸易活动中对H5亚型禽流感有严格的监管措施，在进出口家禽、野鸟中一旦检出，会造成恶劣的国际影响。另外，从2004年开始，日本、韩国、泰国、越南等亚洲国家和地区全面爆发H5亚型高致病性禽流感病毒。因此，立项进行H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR定性检测能力验证， 确保监测体系的核心一技术能力问题得到认证保障，具有非常重要的现实意义。目前禽流感病毒荧光RT-PCR快速检测技术已在国家质检总局系统、农业部属的各地动物防疫站、全国所有禽肉出口集团公司的养殖场、禽肉加工场、各地的疾病预防控制中心，包括澳门民政总署化验所等多个行业部门的实验室推广应用，取得明显的经济和社会效益。在美国、加拿大等国家也都纷纷采用了荧光RT-PCR方法检测禽流感。对于H5亚型禽流感病毒核酸检测，主要为普通RT-PCR、实时荧光RT-PCR和 NASBA，这些方法灵敏、快速、准确，已经在实际的检测工作中发挥了重要作用；另一方面，由于这些方法均为应对当前疫情而紧急开发出来，不同部门依据的方法不同，所用试剂也不尽相同，这样很可能出现针对同样的样品出现不同的结果。目前我国已经发布的标准有GB/ T 19438. 2-2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》和GB/T19439-2004《H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法》。OIE推荐使用的检测方法为普通RT-PCR、实时荧光RT-PCR 和 NASBA。H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR快速检测的实验能力是衡量家禽传染病诊断实验室检测高致病性禽流感病毒结果准确性的重要标志。因此，建立检测H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒能够考察实验室对H5亚型禽流感病毒的检测能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒。该试剂盒主要在动物检疫专业的测量审核领域使用，用于比对实验室检测H5亚型禽流感病毒能力的试剂盒，即该试剂盒能用于评价考核实验室是否能正确检测H5亚型禽流感病毒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种检测H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒，保存于-20°C，该试剂盒是由以下样品组成
A 含2 X 101°拷贝/mL目的核酸片段的溶液； B 含IO9拷贝/mL目的核酸片段的溶液； C 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液；D 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液； E 含IO6拷贝/mL目的核酸片段的溶液； F 含IO5拷贝/mL目的核酸片段的溶液； G 不含目的核酸片段的溶液；
其中，所述目的核酸片段为H5亚型禽流感病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；所述溶液优选为70%乙醇溶液。本发明所述测量审核用试剂盒的使用方法
1.各个参试实验室可选择国际、国家和行业标准方法或其他非标方法，进行H5亚型禽流感病毒核酸的检测验证；
2.试剂盒说明书
2. 1保存温度-20°C ； 2.2有效期12个月；
2. 3使用方法使用前颠倒混勻管内液体，然后再提取RNA进行测试分析。2. 4循环条件设置
第一阶段，反转录42 V 30 min； 第二阶段，预变性92 0C 3 min；
第三阶段，92 V 10 s ；45 V 30 s ；72 V 1 min ;5 个循环；
第四阶段，92 V 10 s;60 V 30 s ;40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收
集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。2. 5相对参考Ct值以2. 4中的循环参数为准，含2 X 101°拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为7. 63，含IO9拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为 12. 73，含IO8拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为15. 23，含IO7拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为19. 58，含IO6拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考 Ct值约为21. 84，含IO5拷贝/mL目的核酸片段溶液的相对参考Ct值约为27. 76，不含目的核酸片段溶液的相对参考Ct值为>40。3.结果评价
如果未检测到本试剂盒中的特定RNA序列，则说明该参试实验室检测技术有问题；如果能检测到本试剂盒中的特定目的核酸片段，并且检测的Ct值与标定的Ct值采用两样本均数显著性检验一 t检验进行统计分析无显著差异，则证明该参试实验室检测技术水平优良；如果能检测到本试剂盒中的特定目的核酸片段，但是检测的Ct值与标定的Ct值采用两样本均数显著性检验一 t检验进行统计分析有显著差异，则证明该参试实验室检测技术水平不够规范和稳定，需要改进。本发明创新性本试剂盒为H5亚型禽流感病毒核酸的检测提供一组通过随机组合的测量审核样品，用定性评价的方式对参试机构的测试该病毒核酸检测的敏感性、特异性及检测方法的准确性提供一个测评基准工具。此试剂盒对于评价参试机构对H5亚型禽流感病毒核酸的检测能力具有很好参考价值，对提升相关机构的检测能力有很强的促进作用。本试剂盒中的H5亚型禽流感病毒核酸按照标准物质的要求进行制备，采用了协作标定、均勻性和稳定性检验等，调制了适用于测量审核的最佳样品浓度，通过实验证明采用了 70%乙醇溶液作为性价比最高，又能有效保护和分散RNA核酸的分散保护剂。制备了动物检疫病毒核酸测量审核样品，并将其定量。下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施例方式北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心动物实验室制备样品，使用的禽流感病毒株为A/Duck/HB/ (H5N1)，该病毒对禽类具有高致病性，由本实验室分离保存。实施例1 样品的制备
1禽流感病毒A/Duck/HB/ (H5N1) HA基因的扩增与克隆
在序列比对的基础上，设计以下3条引物
AIH5F:5' -AAA ATG GAG AGA ATA GTG CTT-3' (SEQ ID No. 2)
AIH5R1:5' -CTA CAA TCT GAA CTC AAY AAA T_3，(SEQ ID No. 3)
AIH5R2:5' -TTT AAC TAC AAT CTG AAC TCA CA-3' (SEQ ID No. 4)
这3对引物可扩增含有禽流感病毒HA基因完整的阅读框，约1. 7KB。将禽流感病毒A/Duck/HB/ (H5N1)鸡胚尿囊液纯化后，应用TRIZOL提取试剂进行RNA的提取。然后应用安发玛西亚公司的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads (Cat. No. 27-9259-01)按表1配方配成RT-PCR反应液，加入提取的RNA，用ABI9700PCR扩增仪进行 RT-PCR 扩增。表1 RT-PCR反应体系
组分数量无RNA酶的灭菌纯化水37 μ LRT-PCRbeads1粒AIH5F (25 μ M)IuLAIH5R1 (25 μ Μ)IuLAIH5R2 (25 μ Μ)IuL模板10 μ L
RT-PCR 循环参数为 42°C /lh ；94°C /3min ；94°C /40 sec, 53°C /40 sec, 72°C /2min，30 个循环，最后72°C/8 min0 RT-PCR完毕，用0.8%琼脂糖凝胶电泳的方法检测扩增产物。上述引物扩增出约1.7KB的片段。采用 Promega 公司的 Wizard PCR Preps DNA Purification System (Cat#A7170 、Lot#11356102)试剂盒纯化上述PCR产物中的目的核酸片段。再用1.0%琼脂糖凝胶电泳的方法对纯化的扩增产物进行粗略定量。用!Iomega公司的PGEM — T Easy Vertor System II (Cat# A1380、Lot#8689;3)试剂盒按照试剂盒说明将目的片段与T载体相连接后，连接反应体系见表2。表2连接反应体系
组分体积2X buffer5μ LΤ—vectorIuLPCRproductΧμ LT4DNALigaseIuL补加去离子水至10 μ L连接反应的条件为4°C过夜，如不立即进行后续步骤，连接产物保存在4°C。2转化与鉴定。按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的说明书要求，将上述连接产物转化入JM109感受态细胞，然后将转化的感受态细胞涂于含有X-Gal和IPTG的琼脂平板，37°C培养12-16小时。从平板上长出的蓝色、白色菌落中随机挑取3-4个白色菌落，提取质粒，用H5亚型 RT-PCR反应液检测，扩增阳性的为合格的克隆菌落。将挑取经鉴定为阳性的菌落，用IOOml 液体LB培养基培养，37°C摇床振荡培养12-16小时。3质粒纯化及序列分析
用 Promega 公司的 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Cat#A7100 、Lot#10454011)试剂盒进行质粒的提纯，用1. 0%琼脂糖凝胶电泳的方法对提纯的质粒进行纯度检测。将阳性质粒送上海生工生物工程有限公司进行双向测序。获得序列后进行拼接，得到的序列为序列表中的SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。4质粒线性化和体外转录
对质粒的序列进行分析后，结果表明目的片段中不含有PvuII位点，而载体含有2个 PvuII位点，因此完全酶切后，可以切出含T7启动子和全长目的片段的DNA片段。因此选用该酶对质粒进行线性化。用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7 (Cat# P1300、Lot#125575)试剂盒进行体外转录；体外转录体系见表3。反应条件为37°C温浴5小时。表3 T7体外转录体系
权利要求
1.一种检测H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由以下样品组成A 含2 X 101°拷贝/mL目的核酸片段的溶液； B 含IO9拷贝/mL目的核酸片段的溶液； C 含IO8拷贝/mL目的核酸片段的溶液； D 含IO7拷贝/mL目的核酸片段的溶液； E 含IO6拷贝/mL目的核酸片段的溶液； F 含IO5拷贝/mL目的核酸片段的溶液； G 不含目的核酸片段的溶液；其中，所述目的核酸片段为H5亚型禽流感病毒体外转录的RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述溶液为70%乙醇溶液。
全文摘要
本发明公开了一种检测H5亚型禽流感病毒的测量审核用试剂盒。该试剂盒含有H5亚型禽流感病毒的特定核酸样品，为H5亚型禽流感病毒核酸的检测提供一组通过随机组合的测量审核样品，用定性评价的方式对参试机构的测试该病毒核酸检测的敏感性、特异性及检测方法的准确性提供一个测评基准工具。
文档编号G01N21/64GK102230033SQ201110178719
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者刘来福, 张伟, 张利峰, 段向英, 谷强, 高志强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局