专利名称：多孔硅微腔生物传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感领域，具体涉及到一种基于多孔硅微腔结构的多通道生物传感器、基于这种生物传感器的光学检测系统及这种生物传感器的制备方法。
背景技术：
生物物质检测技术对现代医疗技术的发展起着十分重要的作用，对生物分子类型、含量的准确测定是疾病诊断与治疗的依据，也是医药研制中至关重要的环节。目前，应用较为广泛的生物检测技术是对生物样品使用某种分子进行标记，然后通过测定标记物含量间接获得被标记生物物质浓度。该方法的缺点是会受到较大的背景噪声干扰，降低了信号的可靠性，而且待检生物分子活性也会受到影响。基于这样的原因，免标记的基于表面等离子体共振(SPR)的生物分子检测技术也得到了部分应用。但是这种方式的缺点在于，SPR生物分子检测仪属于大型仪器，制备成本高昂，操作复杂，需要培训专门的检验人员。对比上述传统检测方法，免标记生物传感器具有专一性强、分析速度快、操作简单、成本低廉、灵敏度高等诸多优点。其中，基于多孔硅微腔结构的生物传感器具有以下几个优点
一、采用光学方法检测，无须标记，通过对微腔的光谱信号进行分析可以迅速得到结
论；
二、多孔硅具有海绵状结构，比表面积大，这在特异性检测中增大检测的动态范围，更重要的是，考虑到sra利用生物分子与衰减场作用，且生物分子只在二维平面内与该衰减场作用，多孔硅微腔使用光子晶体的振荡场与生物分子作用，且多孔材料三维表面内均可以附着生物分子与振荡场作用，从而提高了检测灵敏度；
三、多孔硅薄膜折射率可通过改变其微观结构进行调节；
四、多孔硅表面化学性能易于调节，可使用各种生物分子进行修饰从而实现特异性检
测；
五、多孔硅薄膜易于集成成为传感器阵列，获得高通量检测。目前基于多孔硅微腔结构的生物传感器以硅基底为主，例如公开号为 CN101710118A为的中国发明专利公开了一种基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其缺点是这样的传感器利用效率较低，一个硅基底上只能制备一个传感器，传感器失效后连同硅基底要一同弃置。此外，为了提高检测准确性，常常需要进行多次检测，这同样会使用大量的传感器样品以及待测溶液，在一定程度上造成了浪费，并且在很多情况下，待测样品可供检测的量非常有限。
发明内容
针对上述缺陷，本发明的目的是提供一种多孔硅微腔生物传感器、基于这种传感器的光学检测系统以及这种生物传感器的制备方法，以解决现有技术的生物分子监测设备存在的成本高昂，操作复杂、检测准确性低的技术问题。为实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案
本发明首先提供一种多孔硅微腔生物传感器，包括上Bragg反射镜、下Bragg反射镜以及夹在所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜之间的缺陷曾，所述上Bragg反射镜和下 Bragg反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高多孔率层和低多孔率层，所述缺陷曾厚度为所述高多孔率层厚度的2倍。依照本发明较佳实施例所述的多孔硅微腔生物传感器，所述高多孔率层由80mA/ cm2的电流腐蚀而成，所述低多孔率层由20mA/cm2的电流腐蚀而成.
本发明再提供一种基于上述生物传感器的光学检测系统于，其包括卤素灯光源、复数个带有多孔硅微腔生物传感器的检测通道，计算机、光开关、光谱仪以及液流系统，所述卤素灯发出的光源经过分裂光纤进入所述检测通道，所述分裂光纤的明哥哥分支通过适配器与所述检测通道的每个分叉光纤相连，所述多孔硅微腔生物传感器的反射光由所述分叉光纤另一分支传输到所述光开关，所述光开关在所述电脑控制下切换光路，选择进入光谱仪的光信号，所述光谱仪将处理所述光信号后的数据传送到所述计算机，在所述计算机中运算显示检测结果。本发明再提供一种上述多孔硅微腔生物传感器的制备方法，该种制备方法包括以下步骤步骤1 基于P型硅片制备多孔硅微腔薄膜样品；步骤2 制备多孔硅微腔薄膜阵列；步骤3 根据检测需求对不用的传感通道进行相应生物化学修饰改性。依照本发明较佳实施例所述的制备方法，所述步骤1进一步包括步骤1. 1 沿晶向将硼双面抛光硅片切成2厘米乘以2厘米的方形样品，依次使用去离子水和95%分析纯酒精溶液冲洗硅片样品，然后用高纯氮气吹干样品备用；步骤1. 2 在聚四氟乙烯制成的腐蚀槽中腐蚀所述样品；步骤1. 3 咋计算机控制下控制电流密度和时间对样品进行腐蚀。依照本发明较佳实施例所述的制备方法，在所述步骤1. 2中以铝片作为阳极，钼丝作为阴极，腐蚀液由41. 2%的分析纯氢氟酸水溶液和95%的分析纯酒精以1 :1. 5的体积比混合而成。依照本发明较佳实施例所述的制备方法，所述步骤2进一步包括步骤2. 1:施加200mA/cm2的电流2秒，使多孔硅微腔结构从衬底剥离，制成多孔硅微传感器薄膜；步骤2. 2 将制得的多孔硅微腔传感器薄膜浸泡于DMSO纯溶液中5小时进行湿法氧化；步骤 2. 3 将氧化后的薄膜浸泡于足量DI水中10分钟，以去除残留的DSMO溶液；步骤2. 4 在清洗干净的玻璃基板上滴加一系列聚乙烯醇缩甲醛(Formvar)溶液液滴，溶剂是1，2- 二氯乙烷。然后将氧化后的多孔硅微腔薄膜迅速置于formvar溶液上，待1，2-二氯乙烷蒸发后， formvar就将多孔硅微腔薄膜牢牢粘于玻璃基底之上。由于采用了以上的技术方案，使得本发明相比于现有技术，具有如下的优点和积极效果
第一、本发明提供了一种多通道光学多孔硅微腔薄膜生物传感器制备方法，使用移植于玻璃基底上的多孔硅微腔薄膜作为传感器件，剩下的硅基底可以继续腐蚀制备多孔硅微腔薄膜，从而提高了硅片的使用效率，进一步降低了检测成本；
第二，本发明根据使用的液流腔设计，一次电化学腐蚀出的薄膜样品能够被分割成多个面积更小的传感器，这在不降低信号强度的前提下提高了传感器的使用效率。面积更小的传感器单元消耗的待测溶液量也更少，节省了待测溶液。第三、同一次腐蚀得到的传感器性能彼此接近，谐振峰位置一致，可以将其中一路作为参比通道，用于流过不含待测物质的纯缓冲溶液，进一步提高检测的可靠性，多通道检测使得在一次检测操作中能够获得多组实验数据，从而提高检测效率。第四、本发明提供的光学检测系统除了设置参比通道，多通道还可以用于同时检测不同的生物分子而不会互相干扰，从而提高检测效率。尤其是目前医学研究发现诊断疾病往往需要多种生物标记物(biomarker)的检测作为依据，需要综合多个生物标记物含量分析判断。可以使用本发明技术方案，对不同的检测通道进行不同的抗原、抗体分子修饰， 一次实验就可以检测多个生物标记物。当然，实施本发明内容的任何一个具体实施例，并不一定同时达到以上全部的技术效果。
图1是本发明提供的多孔硅微腔生物传感器结构示意图； 图2是液流腔的顶部视图3是本发明提供的多通道光学检测系统框图； 图4是实施本发明提供的制备方法的流程图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的几个优选实施例进行详细描述，但本发明并不仅仅限于这些实施例。本发明涵盖任何在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明了具体的细节，而对本领域技术人员来说没有这些细节的描述也可以完全理解本发明。另外，为了避免对本发明的实质造成不必要的混淆，并没有详细说明众所周知的方法、过程、流程、元件和电路等。如图1所示，如图1所示的多孔硅微腔传感器结构，它由上Bragg反射镜1、下 Bragg反射镜2以及它们所夹的缺陷层3组成。Bragg反射镜1、3均由五个周期的高多孔率层4、低多孔率层5构成。高多孔率层4由80mA/cm2的电流密度腐蚀而成，低多孔率层5 由20mA/cm2的电流密度腐蚀而成，缺陷层是高多孔率层4厚度的二倍。制好的微腔结构再施加200mA/cm2的腐蚀电流2秒使其从硅基底上脱离。暴露的硅基底可以再次按照上述方法进行腐蚀多孔硅微腔并取膜，提高了对硅片的利用率，从而进一步降低了检测成本。接下来将制好的微腔薄膜浸泡于DSMO中5小时后取出。接下来按图2所示制备液流腔。首先将formvar溶液滴于载玻片上，再将多孔硅微腔薄膜样品迅速置于其上，待溶剂1，2-二氯乙烷挥发后，薄膜便被粘于载玻片上。接下来要根据实际检测需求对多孔硅微腔薄膜进行化学修饰，嫁接相应的探针生物分子。修饰完毕后，将液流腔贴于多孔硅微腔薄膜之上，出入口 11作为待测溶液进出腔室的通道，而两个半圆形12为液流腔室，形成两个检测通道。由于本发明中腐蚀得到的多孔硅薄膜样品为圆形，故液流腔室也设计为圆形，从而提高传感器有效使用面积。其余检测通道可依此法进行制备。
如图3所示，本发明提供的图3学检测系统包括了其包括卤素灯光源31、复数个带有多孔硅微腔生物传感器351的检测通道35，计算机39、光开关37、光谱仪38以及液流系统36，由卤素灯31光源发出的光通过分裂光纤32同时进入各个检测通道35，其各个分支使用适配器33与分叉光纤34的一个分支相连，光由此可以传到多孔硅微腔生物传感器 351表面，其反射光同时由分叉光纤34收集并由分叉光纤34另一分支传入光开关，光开关 37根据计算机39端传来的信号切换光路，特定的时间段内只有一路光信号进入光谱仪38， 光谱仪38处理后的数据送入计算机39，并最后由计算机39进行运算显示检测结果。如图4所示，本发明提供一种制备上述多孔硅微腔生物传感器的方法，包括
5401基于ρ型硅片制备多孔硅微腔薄膜样品；
5402制备多孔硅微腔薄膜阵列；
5403并根据实际检测需求对不同的传感通道进行相应的生物化学修饰改性；
在完成之后，搭建多通道光学检测系统对多孔硅微腔薄膜传感器阵列进行信号检测。基于ρ型硅片制备多孔硅微腔薄膜样品又包含以下工序
首先，硅片切割；所使用硅片为P型掺杂元素为硼(100)双面抛光硅片。沿<110>晶向切成2厘米乘以2厘米的方形样品。依次使用去离子水和95%分析纯酒精溶液冲洗硅片样品，然后用高纯氮气吹干样品备用；
第二，腐蚀在聚四氟乙烯制成的腐蚀槽中进行。铝片作为阳极，钼丝作为阴极，腐蚀液由41. 2%的分析纯氢氟酸水溶液和95%的分析纯酒精以1 :1. 5的体积比混合而成。第三，腐蚀的电流密度与时间由计算机进行精确控制。多孔硅微腔结构由两个 Bragg反射镜层以及其所夹的缺陷层组成。其中的Bragg反射镜层由若干周期的高、低多孔率的多孔硅层交叠而成，电流参数由仿真和实验得出。这样电化学腐蚀得到的是垂直于硅片表面的一维光子晶体材料。夹在中间的缺陷层会在传感器反射率谱线中的高反射带中间引入一个极窄的谐振峰，它是结构灵敏参数，谐振峰对应的波长由缺陷层折射率影响。因此，当加入的被检测生物分子进入缺陷层中后，谐振峰会发生相应的移动，从而能够根据移动量的多少来判断所加入的生物分子浓度值。步骤S402制备多孔硅微腔薄膜阵列包含以下工序
1、施加200mA/cm2的电流2秒，这可以将多孔硅微腔结构最下面一层与硅基底交界处的硅全部腐蚀，从而使多孔硅微腔结构从衬底剥离，制成多孔硅微腔薄膜；
2、将制得的多孔硅微腔薄膜浸泡于DMSO纯溶液中5小时进行湿法氧化。这是由于制得的多孔硅表面有大量的硅氢键，硅氢键疏水且不稳定，从而会导致生物分子水溶液不易渗入以及谐振峰随时间发生漂移。而当硅表面氧化后，表面亲水而且非常稳定，生物分子溶液易进入孔内到达缺陷层。通常的高温氧化办法不适用于多孔硅薄膜，这里采用湿法氧化的办法，在DMSO中浸润5小时后，实验表明，认为多孔硅表面基本被氧化，硅氢键由硅氧键代替；
3、将氧化后的薄膜浸泡于足量DI水中10分钟，以去除残留的DSMO溶液；
4、在清洗干净的玻璃基板上按一定顺序滴加一系列0.25%聚乙烯醇缩甲醛(formvar) 溶液液滴，溶剂是1，2- 二氯乙烷。然后将氧化后的多孔硅微腔薄膜迅速置于formvar溶液上。待1，2- 二氯乙烷蒸发后，formvar就将多孔硅微腔薄膜牢牢粘于玻璃基底之上；
之后，执行步骤S403，根据实际检测需要再对多孔硅传感器进行化学修饰。
在制备完成后，将液流腔贴于多孔硅微腔薄膜上，并将液体出入通道与液流系统相连，再连接多通道光学系统。使用分裂多模光纤将光源白光分成多路，各分光路使用适配器与分叉光纤一个分支相连，分叉光纤一方面将入射白光传输到传感器表面，另一方面采集传感器反射回来的光信号，并通过分叉光纤的另一分支输入光路切换开关。光路切换开关以一定的频率对光路进行切换，在某一特定的时间片内其输出为一个特定的光路，光开关的输出作为光纤光谱仪的输入，对光信号进行实时采集分析，并通过电脑将结果进行显示。以下简要说明本发明的两个应用例。应用例一
本应用例是使用多通道的多孔硅微腔生物传感器检测M碱基对DNA单链分子，其包
括
首先，按照具体实施方式
中描述的方法制取多孔硅微腔样品； 之后，按照具体实施方式
中描述的方法将多孔硅微腔从硅基底取下进行湿法氧化，并使用formvar贴于载玻片上；
最后，在多孔硅微腔内连接DNA探针分子，其具体包括步骤为 1.在多孔硅微腔薄膜表面滴加50 μ L浓度为21的APTES溶液。静置20分钟后用DI 水冲洗并用氮气吹干，置于100°C环境中烘烤10分钟取出。2.在样品表面按顺序滴加100 μ L的2. 5%的戊二醛溶液，1 μ L的5mol/L的氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)和Imol/L的NaOH溶液。在上述混合液中浸泡2小时。3.将传感器样品HEPES缓冲液冲洗并再次浸泡于其中1小时。之后再用缓冲液冲洗样品表面并用氮气吹干。4. DNA探针分子的连接应在上一步醛基化的30分钟内进行。将多孔硅微腔样品浸泡于氨基修饰的DNA探针分子缓冲液中。之后重复步骤3。5.接下来传感器样品在3mol/L乙醇胺(ethanolamine)中浸泡2小时。之后重复
步骤3 ο6.将液流腔贴于处理完毕的多孔硅微腔之上，并将进液与出液口与液流系统相连。7.检测DNA，连接外部多路光学检测系统，调节蠕动泵缓慢将待测DNA缓冲液泵入液流腔内，待其全部充满即停止，静置1小时后，再泵入足量缓冲液进行冲洗未连接DNA样品。此过程全程由光谱仪动态记录。同时，液流腔所分的两部分一部分作为检测通道，另一部分作为对照通道，整个检测过程中只通入缓冲液。应用例二
在本应用例中，使用多通道的多孔硅微腔生物传感器检测大肠杆菌(E-Coli)胞外亲密素(Intimin-IBD)
首先，按照具体实施方式
中描述的方法制取多孔硅微腔样品； 之后，按照具体实施方式
中描述的方法将多孔硅微腔从硅基底取下进行湿法氧化，并使用formvar贴于载玻片上；
然后，在多孔硅微腔内连接转位紧密素抗体(translocation intiminreceptor-intimin binding domain, Tir-IBD),具体包括步骤为
1.在多孔硅微腔薄膜表面滴加50 μ L浓度为21的APTES溶液。静置20分钟后用DI 水冲洗并用氮气吹干，置于100°C环境中烘烤10分钟取出。2.将样品浸于20mM的HEPES缓冲液中，再滴加50 μ L的2. 5%的戊二醛溶液。静置30分钟后取出，使用HEPES缓冲液冲洗，并用氮气吹干。3.在传感器样品表面滴加50 μ L的Tri-IBD溶液，静置1小时。再将样品浸泡于 HEPES缓冲液中20分钟。之后用氮气吹干。4.滴加5(^1^农度为1!1101/1的817(^1^ methyl ester，静置1小时。再将样品浸泡于HEPES缓冲液中20分钟。之后用氮气吹干。5.将液流腔贴于处理完毕的多孔硅微腔之上，并将进液与出液口与液流系统相连。6.检测htimin-IBD。连接外部多路光学检测系统，调节蠕动泵缓慢将待测 Intimin-IBD缓冲液泵入液流腔内，待其全部充满即停止，静置1小时后，再泵入足量缓冲液进行冲洗未连接的htimin-IBD样品。此过程全程由光谱仪动态记录。同时，液流腔所分的两部分一部分作为检测通道，另一部分作为对照通道，整个检测过程中只通入缓冲液。本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式
。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
权利要求
1.一种多孔硅微腔生物传感器，其特征在于，包括上Bragg反射镜、下Bragg反射镜以及夹在所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜之间的缺陷曾，所述上Bragg反射镜和下 Bragg反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高多孔率层和低多孔率层，所述缺陷曾厚度为所述高多孔率层厚度的2倍。
2.如权利要求1所述的多孔硅微腔生物传感器，其特征在于，所述高多孔率层由80mA/ cm2的电流腐蚀而成，所述低多孔率层由20mA/cm2的电流腐蚀而成.一种光学检测系统，其特征在于，包括商素灯光源、复数个带有多孔硅微腔生物传感器的检测通道，计算机、光开关、光谱仪以及液流系统，所述卤素灯发出的光源经过分裂光纤进入所述检测通道，所述分裂光纤的明哥哥分支通过适配器与所述检测通道的每个分叉光纤相连，所述多孔硅微腔生物传感器的反射光由所述分叉光纤另一分支传输到所述光开关，所述光开关在所述电脑控制下切换光路，选择进入光谱仪的光信号，所述光谱仪将处理所述光信号后的数据传送到所述计算机，在所述计算机中运算显示检测结果。
3.如权利要求3所述的光学检测系统，其特征在于，所述多孔硅微腔生物传感器包括上Bragg反射镜、下Bragg反射镜以及夹在所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜之间的缺陷曾，所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高多孔率层和低多孔率层，所述缺陷曾厚度为所述高多孔率层厚度的2倍。
4.一种多孔硅微腔生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1 基于P型硅片制备多孔硅微腔薄膜样品；步骤2 制备多孔硅微腔薄膜阵列；步骤3 :根据检测需求对不用的传感通道进行相应生物化学修饰改性。
5.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1进一步包括步骤1. 1 沿晶向将硼双面抛光硅片切成2厘米乘以2厘米的方形样品，依次使用去离子水和95%分析纯酒精溶液冲洗硅片样品，然后用高纯氮气吹干样品备用；步骤1. 2 在聚四氟乙烯制成的腐蚀槽中腐蚀所述样品；步骤1. 3 咋计算机控制下控制电流密度和时间对样品进行腐蚀。
6.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1.2中以铝片作为阳极，钼丝作为阴极，腐蚀液由41. 2%的分析纯氢氟酸水溶液和95%的分析纯酒精以1 :1. 5的体积比混合而成。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2进一步包括步骤2. 1 施加200mA/cm2的电流2秒，使多孔硅微腔结构从衬底剥离，制成多孔硅微传感器薄膜；步骤2. 2 将制得的多孔硅微腔传感器薄膜浸泡于DMSO纯溶液中5小时进行湿法氧化；步骤2. 3 将氧化后的薄膜浸泡于足量DI水中10分钟，以去除残留的DSMO溶液；步骤2. 4 在清洗干净的玻璃基板上滴加一系列聚乙烯醇缩甲醛(Formvar)溶液液滴， 溶剂是1，2-二氯乙烷。
8.然后将氧化后的多孔硅微腔薄膜迅速置于formvar溶液上，待1，2-二氯乙烷蒸发后，formvar就将多孔硅微腔薄膜牢牢粘于玻璃基底之上。
全文摘要
本发明提供一种多孔硅微腔生物传感器、这种生物传感器的制备方法以及基于这种传感器的光学检测系统，所述多孔硅微腔生物传感器包括上Bragg反射镜、下Bragg反射镜以及夹在所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜之间的缺陷曾，所述上Bragg反射镜和下Bragg反射镜分别包括五个周期循环交替排列的高多孔率层和低多孔率层，所述缺陷曾厚度为所述高多孔率层厚度的2倍。本发明具有检测效率高、结构简单、检测精确等优点。
文档编号G01N21/41GK102313717SQ20111021965
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者吴超, 祝永新, 荣国光 申请人:上海交通大学