专利名称：一种精浆果糖浓度检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，涉及一种体外诊断用试剂盒及其检测方法， 具体地说是一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒及应用。
背景技术：
精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源，直接参与精子的获能和受精。在男性不育等相关诊断与研究中，果糖浓度的测定一直占有很重要的地位。果糖的浓度可以反映精囊的分泌功能，先天性精囊缺如或患有精囊腺炎时，果糖的含量明显降低；不完全射精或射精过频时，果糖的含量亦降低。另外，果糖结合其它指标如α-糖苷酶等的检测，还可用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症和输精管、精囊发育不良引起的无精症。研究表明，睾酮的水平影响精囊果糖的分泌，雄激素不足可造成果糖含量降低，因此果糖含量还能间接反映睾丸间质细胞分泌睾酮的功能。目前，检测果糖的化学比色法主要有化合物显色法和酶法；化合物显色法主要有吲哚法和间苯二酚法，这两者的试剂成本较低，但都需用到浓盐酸，挥发性强、危险性大、 对操作者和环境均有危害，而且样本还需去蛋白处理、孵育温度高达60°C以上，致使临床使用很不方便；酶法主要有三种方法，其中一种需用到己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，检测灵敏度高，但是对这些酶的纯度要求很高，不能有任何污染，另外己糖激酶的底物特异性不是很高，葡萄糖，山梨糖、麦芽糖、半乳糖等都可干扰该反应，造成检测结果偏高；另外一种涉及到山梨醇脱氢酶，反应只有一步，但是该酶可将山梨糖可逆地转化成果糖，样品还需要离心和加热等预处理步骤；最后一种也就是本法所涉及的果糖脱氢酶，该酶底物特异性强，同时可避免样品的离心、加热或去蛋白等步骤，反应速度快，结果准确性高。但是有一点，以上所有的方法均为手工或半自动操作，加样程序多，所用试剂量大，试剂成本高，试剂和样品混勻一定的时间后，通过分光光度计逐一比色测定，然后根据公式计算出结果，同一标本一次只能检测一项，耗费了大量的时间和人力，而且人为操作误差也比较大。现在，临床生化检验基本上都实现了自动化分析。全自动生化仪就是将原始手工操作过程中的取样、混勻、温育、检测、结果计算、判断、显示和打印结果及清洗等步骤全部或者部分自动运行，由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在各级医院、防疫站、计划生育服务站得到了广泛的使用，配合使用可大大提高常规生化检验的效率及收益。 遗憾的是，截止到目前，无论是国外还是国内，对于精浆果糖项目的检测，除了早期的科研成果外，尚没有一种可与全自动生化仪相配套的、商品化的检测试剂盒问世，因此，建立一种与全自动生化仪相配套使用的精浆果糖浓度定量检测试剂盒及检测方法就显得尤为迫切和重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，填补市场上的空缺，提供一种与全自动生化仪相配套使用的精浆果糖浓度定量检测试剂盒。本发明的另一目的在于提供所述精浆果糖浓度定量检测试剂盒在检测精浆果糖浓度中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标准液，其中，1) Rl试剂包括以下含量的组份ρΗ4· 5-5. 0 缓冲液 150-300 μ mol/L ；显色剂50-70 μ mol/L;电子受体285-300 μ mol/L ；防腐剂0.01-0.1%;2)R2试剂包括以下含量的组份ρΗ4· 5-5. 0 缓冲液 150-300 μ mol/L ；果糖脱氢酶2. 5_6.0U/ml;防腐剂0.01-0.1%;3)果糖标准液包括以下含量的组份ρΗ4· 5-5. 0 缓冲液 150-300 μ mol/L ；果糖20_60mmol/L ；防腐剂0.01-0.1%;其中所述缓冲液为pH4. 5-5. 0的McIlvaine' s缓冲液、Walpole' s缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述显色剂为噻唑蓝、碘硝基四唑紫或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐； 所述电子受体为吩嗪二甲酯硫酸盐或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐；所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素或ProCl in系列防腐剂中的任意一种。精浆果糖浓度定量检测试剂盒在检测精浆果糖浓度中的应用。精浆果糖浓度定量检测试剂盒在检测精浆果糖浓度中的应用，包括以下步骤1)样品制备新鲜精液液化后通过3000 5000rpm离心10 20min，所获得的上清液即是；2)在全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Fru ；样品试剂比1 30;试剂比R1 R2 = 1 4 ；主波长560-590nm ；检测方法速率法；定标方法单点定标或两点定标；反应方向上升；反应时间180-270秒；检测时间90-120秒；3)定标操作用果糖标准液进行定标，仪器会根据果糖标准液的浓度及其每分钟吸光度变化率，得出一个果糖浓度和吸光度变化率之间的关系式单点定标Y = AX ；或两点定标Y = ΑΧ+Β,
其中，单点定标的常数A或两点定标的常数A、B在定标结束后自动给出，Y代表果糖标准液的浓度，X代表果糖标准液的每分钟吸光度变化率；4)样本检测将1)中制备好的样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测；测试结束后，仪器根据定标得出的浓度和吸光度变化率之间的关系式自动计算出样本中果糖的浓度。本发明提供的一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标准液；所述Rl试剂为含显色剂、电子受体和防腐剂的PH4. 5-5. 0的缓冲溶液；所述R2试剂为含果糖脱氢酶和防腐剂的PH4. 5-5. 0的缓冲溶液；所述果糖标准液为含果糖和防腐剂的 ρΗ4· 5-5. 0缓冲溶液。所述Rl试剂中，pH4. 5-5. 0的缓冲液用于为反应提供适宜的酸性反应条件；所述 Il色齐U为1SP坐蓝(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)，含量为50-70 μ mol/L，该范围是与果糖反应的有效结合量，在反应中起生成有色物质的作用；另外，显色剂还可以是碘硝基四唑紫(Iodonitrotetrazolium purple, INT)、铁氰化钾(Potassium ferricynate)；电子受体为吩嗪二甲酯硫酸盐(Phenazine Methosulfate, PMS)，含量为285-300 μ mol/L，该范围是果糖脱氢酶的有效电子传递量，用作果糖脱氢酶催化反应中的电子受体；另外，电子受体还可以是1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酉旨盐(l-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, 1-methoxyPMS) 所述R2试剂中，果糖脱氢酶(Fructose Dehydrogenase, FDH)的含量为 2. 5-6. OU/ ml，低于果糖脱氢酶的下限2.5U/ml时，每分钟吸光度的变化率很小，吸光度变化率的微量波动即会导致结果的很大变动，考虑到试剂成本以及试剂发挥作用的最优性，选择果糖脱氢酶的上限为6. 0U/ml时，在2. 5-6. 0U/ml范围内，果糖脱氢酶的浓度越高，反应速度越快， 每分钟吸光度的变化率也越大；所述防腐剂为叠氮钠，含量为0.01-0. 1%，该范围在有效杀菌的同时不会对反应起任何副作用，可延长试剂盒的有效期；还可以是其它具有防腐作用的庆大霉素和 ftOClin系列防腐剂中的任意一种等，但不可以是硫柳汞，其对果糖脱氢酶有一定的抑制作用。上述的检测方法，所述步骤1)中，所制备的精浆样本可于分离当天检测，也可于-20°C以下冻存备用，至少可保存2周以上，但应避免反复冻融；所述步骤2)中，样本试剂比应根据全自动生化仪的参数而定，应考虑到仪器的最小加样量，比色皿的反应液体积范围等；所述步骤幻中，定标模式可以自行选择，可以选用单点定标，即单用一个果糖标准液进行定标；也可以选用两点定标，即用蒸馏水作为一个浓度点，果糖标准液作为另外一个浓度点进行定标；所述步骤4)中，当样本中果糖的浓度过高，超出试剂盒的线性范围时，应用生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数即可；本发明的检测方法是速率法，所述的Rl试剂、R2试剂为含显色剂MTT、电子受体 PMS、果糖脱氢酶FDH和防腐剂的PH4. 5-5. 0的Mcllvaine' s缓冲溶液，检测原理是，
D-果糖+MTT+PMS果糖脱_ > 5-酮基-D-果糖+MTT甲臢果糖脱氢酶催化样本中的果糖，在MTT和PMS的共同作用下，反应生成有色复合物MTT甲臢，该复合物在560-590nm波长处有最大吸收峰，通过监测其在560-590nm波长处的每分钟吸光度变化率，进而检测出样本中的果糖浓度。与现有技术相比，突出的技术效果在于1、本试剂盒采用速率法检测精浆样本中果糖的浓度，仅采用2种液体试剂，与手工检测的终点法相比，所用试剂的种类和用量都明显减少，避开了具有强烈腐蚀性和挥发性的浓盐酸的使用，反应温度也不需要再达到60°C以上；2、采用本试剂盒及检测方法，样本制备好后不需再去蛋白，也不需要预稀释，检测过程中不再需要单独做空白管、标准管，简化了操作步骤，降低了人为误差；另外，与现有的己糖激酶法检测试剂盒相比，果糖脱氢酶对底物果糖的专一性催化作用，使得检测结果更加准确和特异；3、本发明实现了从手工或半自动向全自动检测方法的转变，填补了市场上的空缺，采用全自动生化仪进行自动化、规模化的检测，释放了大量的人力，节约了大量的耗材， 对反应时间、反应过程的准确控制和监测，显著提高了检测结果的准确性和可靠性；4、采用本发明可以在检测同一份样本果糖浓度的同时，还可以与全自动生化仪相配套的精浆Y-L-谷氨酰基转肽酶、α-糖苷酶、果糖试剂盒联合使用，并同时检测这些项目，检测结束后，可以以报告的形式打印出同一份样本所测项目的所有结果，可满足医院男性不育相关科室、人类精子库、计划生育研究所等机构对精液质量、精子筛选的需要，以及对于男性不育症的辅助诊断等，大大提高了精液常规生化分析的效率和收益，非常适于常规检测和推广。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1本实施例中的一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标准液，分别按以下成分和用量配制1) Rl 试剂:pH4. 5McIlvaine' s 缓冲液噻唑蓝(MTT)吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)叠氮钠2) R2 试剂pH4. 5McIlvaine' s 缓冲液果糖脱氢酶(FDH)叠氮钠3)果糖标准液pH4. 5McIlvaine' s 缓冲液果糖
150ymol/L ； 54 μ mol/L ； 294μ mol/L ； 0. 1% ；
150 μ mol/L ； 2. 5U/ml ； 0. 08% ；
150 μ mol/L ； 20mmol/L ；
庆大霉素0.05%;上述试剂全部溶解后，分装入瓶，制成液体双试剂和果糖标准液，于2_8°C避光保存备用。实施例2本实施例中的一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标准液，分别按以下成分和用量配制DRl试剂
pH4. 8McIIvaine‘s缓冲液200ymol/L ；
碘硝基四唑紫60 μ mol/L ；
1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐 285 μ mol/L;
庆大霉素0. 1% ；
2) R2试剂
pH4. 8McIIvaine‘s缓冲液200 μ mol/L ；
果糖脱氢酶4. OU/ml ；
叠氮钠0. 05% ；
3)果糖标准液
pH4. 8McIIvaine‘S缓冲液200 μ mol/L ；
果糖40mmol/L ；
ProClinl500. 02% ；
上述试剂全部溶解后，分装入瓶，制成液体双试剂和果糖标准液，于2-8°C避光保存备用。
实施例3
本实施例中的一种精浆果糖:浓度定量检测试剂盒，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标
准液，分别按以下成分和用量配制DRl试剂
pH5. Offalpole'S缓冲液300 μ mol/L ；
碘硝基四唑紫70 μ mol/L ；
1-甲氧基-5-甲1基酚嗪硫酸甲酯盐300 μ mol/L ；
ProClinl500. 05% ；
2) R2试剂
pH5. Offalpole'S缓冲液300 μ mol/L ；
果糖脱氢酶(FDH)6. OU/ml ；
ProClin3000. 02% ；
3)果糖标准液
pH5. OMcIlvaine‘S缓冲液300 μ mol/L ；
果糖60mmol/L ；
叠氮钠0. 1% ；
上述试剂全部溶解后，分装入瓶，制成液体双试剂和果糖标准液，于2-8°C避光保存备用。
实施例4利用实施例1中的试剂盒检测精浆中果糖浓度的方法，具体操作步骤如下1)样品制备新鲜精液液化后通过5000rpm离心lOmin，所获得的上清液即是；2)在Olympus AU400全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Fru;样品量10μ1;Rl试剂和R2试剂用量比为4 1 ；Rl试剂量:240 μ 1 ；R2试剂量:60 μ 1 ；检测方法速率法；定标模式ΑΒ (单点定标)；主波长570nm;反应方向上升；主读数点1:20;主读数点2:25;3)定标操作:用20mmol/L果糖标准液进行定标，仪器会根据果糖标准液的浓度和每分钟吸光度的变化率，得出一个果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式Y = AX ；其中，常数A 在定标结束后自动给出，Y代表果糖标准液的浓度，X代表果糖标准液的每分钟吸光度变化率；例如，用20mmol/L果糖标准液进行定标，测得的每分钟吸光度变化率为0. 0068， 则通过定标关系式Y = AX，仪器自动计算出A = 2941. 18，也即，由定标操作得出的果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式为Y = 2941. 18X ；4)样本检测将1)中制备好的样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，仪器根据定标关系式自动计算出样本中果糖的浓度，即果糖浓度Y(mmol/L) = 2941. 18X，其中，X代表样本的每分钟吸光度变化率，在全自动生化仪上自动测定给出。例如，全自动生化仪测得某份精浆中的果糖的每分钟吸光度变化率为0. 0096，则该份精浆中果糖浓度 Y = 2941. 18X0. 0096 = 28. 24mmol/L实施例5利用实施例2中的试剂盒检测精浆中果糖浓度的方法，具体操作步骤如下1)样品制备新鲜精液液化后通过3000rpm离心20min，所获得的上清液即是；2)在Olympus AU640全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Fru;样品量8μ1;Rl试剂和R2试剂用量比为4 1 ；Rl试剂量:192 μ 1 ；R2试剂量:48 μ 1 ；检测方法速率法；定标模式AA (两点定标)；
主波长570nm;反应方向上升；主读数点1:18;主读数点2:24;3)定标操作用蒸馏水Ommol/L和40mmol/L果糖标准液进行定标，仪器会根据各自的浓度和吸光度值，得出一个果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式Y = AX+B ；其中，常数A、B 在定标结束后自动给出，Y代表果糖标准液中果糖的浓度，X代表果糖标准液的每分钟吸光
度变化率。例如，用蒸馏水和果糖标准液进行定标操作后，测定的每分钟吸光度变化率分别为0. 0003和0. 0098，则通过定标关系式Y = AX+B,仪器自动计算出A = 4210. 5，B ="I.沈32，也即，由定标操作得出的果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式为Y = 4210. 5X-1. 2632。4)样本检测将1)中制备好的样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，仪器根据定标关系式自动计算出样本中果糖的浓度，即果糖浓度Y(mmol/L) = 4210. 5X-1. 2632，其中，X为样本的每分钟吸光度变化率，在全自动生化仪上自动测定给出；例如，某份精浆样本用生理盐水稀释2倍后，全自动生化仪测得的果糖的每分钟吸光度变化率为0.0105，则该份精浆中果糖的浓度Y = 2X (4210.5X0.0105-1.2632)= 85.9mmol/L。实施例6利用实施例3中的试剂盒检测精浆中果糖浓度的方法，具体操作步骤如下1)样品制备新鲜精液液化后通过4000rpm离心15min，所获得的上清液即是；2)在劳拉!^aith-IOOO全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下检测项目Fru;样品量11μ1;Rl试剂和R2试剂用量比为4 1 ；Rl试剂量:264 μ 1 ； R2试剂量:66μ 1 ；检测方法速率法；定标模式单点定标；主波长578nm;反应方向上升；主读数点1:25;主读数点2:30;3)定标操作用60mmol/L果糖标准液进行定标，仪器会根据果糖标准液的浓度和每分钟吸光度的变化率，得出一个果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式Y = AX ；其中，常数A 在定标结束后自动给出，Y代表果糖标准液的浓度，X代表果糖标准液的每分钟吸光度变化率；例如，用60mmol/L果糖标准液进行定标，测定的每分钟吸光度变化率为0. 0155， 则通过定标关系式Y = AX，仪器自动计算出A = 3870. 97，也即，由定标操作得出的果糖浓度和每分钟吸光度变化率之间的关系式为Y = 3870. 97X ；4)样本检测将1)中制备好的样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，仪器根据定标关系式自动计算出样本中果糖的浓度，即果糖浓度Y (mmol/L) = 3870. 97X，其中，X为样本的每分钟吸光度变化率，在全自动生化仪上自动测定给出。例如，全自动生化仪测得某份精浆中的果糖的每分钟吸光度变化率为0. 0184，则该份精浆中果糖浓度 Y = 3870. 97X0. 0184 = 71. 23mmol/L实施例7在实施例1和实施例4的基础上进行批内和批间精密度的检测(即本发明的试剂盒的检测结果的重现性)选择果糖浓度低、高值的混合精浆样本各1份，准备5个批次的检测试剂盒，每个批次试剂盒测同一个浓度精浆样本8次，共有40个数据，从5个批次中每一样本重复测定8 次的结果算出批内精密度，从所有40个结果计算出批间精密度，结果均以变异系数的百分数即CV%表示。其中，CV%=标准差/平均值X100%，该系数越小，表明同一份样本重复检测结果的离散程度越小，即检测结果的重现性越好。结果与手工或半自动检测的结果比较见表1，说明使用该试剂盒检测精浆果糖浓度的方法重复性好。表1手工、半自动和全自动检测的精密度结果比较
权利要求
1.一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，其特征在于，包括Rl试剂、R2试剂和果糖标准液，其中，DRl试剂包括以下含量的组份 pH4. 5-5. 0 缓冲液150-300 μ mol/L ；显色剂50-70 μ mol/L;电子受体285-300 μ mol/L ；防腐剂0.01-0.1%;2)R2试剂包括以下含量的组份pH4. 5-5. 0 缓冲液150-300 μ mol/L ；果糖脱氢酶2. 5-6. OU/ml ；防腐剂0.01-0.1%;3)果糖标准液包括以下含量的组份pH4. 5-5. 0 缓冲液150-300 μ mol/L ；果糖20-60mmol/L ；防腐剂0.01-0.1%;其中所述缓冲液为PH4. 5-5. 0的McIlvaine' s缓冲液、Walpole' s缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述显色剂为噻唑蓝、碘硝基四唑紫或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐； 所述电子受体为吩嗪二甲酯硫酸盐或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐； 所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素或ftx)Clin系列防腐剂中的任意一种。
2.权利要求1所述的精浆果糖浓度定量检测试剂盒在检测精浆果糖浓度中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤1)样品制备新鲜精液液化后通过3000 5000rpm离心10 20min，所获得的上清液即是；2)在全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下 检测项目=Fru ；样品试剂比1 30; 试剂比R1 R2 = 1 4 ； 主波长560-590nm ； 检测方法速率法； 定标方法单点定标或两点定标； 反应方向上升； 反应时间180-270秒； 检测时间:90-120秒；3)定标操作用果糖标准液进行定标，仪器会根据果糖标准液的浓度及其每分钟吸光度变化率，得出一个果糖浓度和吸光度变化率之间的关系式单点定标=Y = AX ；或两点定标=Y = AX+B,其中，单点定标的常数A或两点定标的常数A、B在定标结束后自动给出，Y代表果糖标准液的浓度，X代表果糖标准液的每分钟吸光度变化率；4)样本检测将1)中制备好的样本和Rl试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测；测试结束后，仪器根据定标得出的浓度和吸光度变化率之间的关系式自动计算出样本中果糖的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种精浆果糖浓度定量检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和果糖标准液，其中，R1试剂包括pH4.5-5.0缓冲液150-300μmol/L；显色剂50-70μmol/L；电子受体285-300μmol/L；防腐剂0.01-0.1％；R2试剂包括以下含量的组份pH4.5-5.0缓冲液150-300μmol/L；果糖脱氢酶2.5-6.0U/ml；防腐剂0.01-0.1％；果糖标准液包括以下含量的组份pH4.5-5.0缓冲液150-300μmol/L；果糖20-60mmol/L；防腐剂0.01-0.1％。本发明还公开了精浆果糖浓度定量检测试剂盒在检测精浆果糖浓度中的应用。本发明的样本不需去蛋白，采用速率法检测，避开了浓盐酸的使用，反应温度也不需达到60℃以上，采用对果糖有专一性催化作用的酶，使检测结果更加准确和特异，使用全自动生化仪进行自动化、规模化的检测，大大提高了检测效率。
文档编号G01N21/31GK102323230SQ20111023367
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者陆金春, 陈晓慧, 高建 申请人:南京欣迪生物药业工程有限责任公司