专利名称：一种基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别是一种基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法。
背景技术：
现行中药内在质量控制依旧主要采取部分指标性成分定性检测和/或含量测定的方法，然而中药所含化学成分复杂，目前绝大多数中药药效物质并不十分明确，这种模式既难以保证该类中药质量的一致性和稳定性，也难以关联或反映其临床使用的安全性和有效性。中药的“生物活性测定”已成为中药质量控制重点发展方法之一。由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》(2010年1月版.一部)附录收载。中药桔梗是临床最常用的祛痰药之一，当前的质量标准主要是测定单一指标桔梗皂苷D (C57H92O28)的含量，而桔梗的化学本底较为复杂，据报道单桔梗中的皂苷类成分就分离出39种以上，相当一部分都具有显著的镇咳祛痰等作用，此外黄酮类、酚类、挥发油类、 脂肪油、脂肪酸类等等也都是它的有效成分，所以单以桔梗皂苷D为其质量控制指标与药效的关联度不大，是不能完全达到桔梗内在质量控制目标的，因此，开拓新的桔梗内在质量控制方法势在必行。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明之目的就是提供一种基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法，可有效解决当前桔梗的质量控制，以保证桔梗临床用药的安全有效和在医药领域其他方面的合理应用问题。本发明解决的技术方案是，将生物活性测定法引入到中药质量控制和评价体系， 将药材经处理后，制备成样品与工作对照品，然后进行祛痰活性测定实验，测定给药后实验动物气管酚红排泌量，样品与工作对照品进行比较，计算效价，比较不同批次样品效价值， 其步骤是
1、样品(Pt)的制备将桔梗粉碎，用乙醇超声提取，得干燥物，用生理盐水按初始浓度， 以0. 5剂距进行倍比稀释成7组，成样品；
2、工作对照品(Ps)的制备将10批符合《中国药典》(一部)2010年版所收载桔梗项下质量要求的药材均勻充分混合之粉末为工作参照物，取10. 0g，按1中步骤制备成工作对照
P
m ；
3、制作标准曲线将酚红用碳酸氢钠溶液溶解，用分光光度计测定OD值，以酚红剂量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线；
4、桔梗祛痰活性的检测与线性范围的寻找以动物为实验对象分组给药后处死，取气管，置入生理盐水，离心取上清液，用分光光度计在546nm波长处测定OD值，根据酚红标准曲线计算气管分泌酚红含量并比较；
线性范围的寻找是以动物为实验对象，经酚红含量为纵坐标，给药剂量取对数后为横坐标作图，寻找线性范围；
5、桔梗祛痰效价的测定以动物为实验对象，进行给药并测定动物气管分泌酚红含量， 以酚红含量为指标，进行效价计算；
6、数据处理或效价计算依照《中国药典》2010版.二部附录XIV生物检定统计法对步骤5的数据进行处理，得出效价。本发明方法易操作，稳定可靠，测试准确，质量控制效果好，尤其对于成分多样、结构复杂、理化方法不能表征其含量、理化测定不能反映生物活性和疗效的中药能凸显其优越性，本发明以桔梗为研究对象，首次建立以药效为基础的桔梗质量生物活性测定方法，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关桔梗内在质量，完善现行质量控制和评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的思路和参考。
图1为本发明桔梗样品与工作对照品作用趋势比较图。图2为本发明桔梗样品与工作对照品作用关系图。
具体实施例方式以下结合具体情况本发明的具体实施方式
作详细说明。本发明在具体实施中，是由以下步骤实现的
1、样品的制备，方法是
①将桔梗粉碎成粉末，过50目筛，成桔梗粉末；
②对所制桔梗粉在烘箱中<60°C下干燥至含水量< 396，置于棕色瓶中密闭保存；
③取干燥的桔梗粉碎粉末10.0g，置入容器内(如锥形瓶)，加入10倍重量的质量浓度为75%的乙醇(简称75%乙醇，以下同)，室温超声提取30min，过滤(如用滤纸过滤)去残渣， 回收乙醇并干燥，计算收率后密封保存干燥物，使用时，再用生理盐水配成相当于含生药 IOOmg /ml的初始浓度溶液，并按0. 5剂距进行倍比稀释成7组，稀释的方法是，第一次加入初始浓度溶液的1倍体积的生理盐水，稀释成第一次的稀释液，第一次的稀释液取出一半， 成第一组稀释液，留下的一半稀释液再加入同体积的生理盐水，稀释成第二次的稀释液，第二次的稀释液取出一半，成第二组稀释液，依次类推，连续7次，稀释成7组，成样品；
2、工作对照品的制备
将10批符合《中国药典》(一部)2010年版所收载桔梗项下质量要求的药材混合均勻粉碎成粉末，取IOg桔梗粉末按照步骤1中的步骤③，制备成工作对照品；
3、制作标准曲线
将酚红用质量浓度为5%碳酸氢钠溶液(简称5%碳酸氢钠溶液，以下同)溶解，依次配成每 Iml 含 0. 01 μ g，0. 1 μ g，0. 5 μ g，0. 7 μ g，1. 0 μ g，3. 0 μ g，5. 0 μ g，10. 0 μ g 酚红的酚红溶液，用分光光度计测定OD值，以酚红剂量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线；
4、桔梗祛痰活性的检测与线性范围的寻找
(1)桔梗祛痰活性的检测，取小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组(分组及给药见表1)， 每组10只，禁食不禁水8 12h，分别每组灌胃给药体积为0. aiil/10g，空白对照组给等容积生理盐水，给药30min后由腹腔注射0.5%酚红溶液0. 5 ml/只，30min后处死小鼠，仰位固定于蛙板上，解剖分离气管，剥去气管周围组织，用滤纸吸净其周围的血液，剪下自甲状软骨至气管分枝处的一段气管，作为取样，放入盛有3ml生理盐水的试管中，再加入5%碳酸氢钠溶液0. Iml离心lOmin，取上清液用分光光度计在546nm波长处测定OD值，根据酚红标准曲线计算气管分泌酚红含量并比较；
(2)线性范围的寻找，取小鼠150只，雌雄各半，随机分成15组，桔梗样品和工作对照品各分成7个组，另一组为空白对照组，按步骤3制作标准曲线，按步骤4的步骤(1)给药、取样与测定的方法操作并计算气管分泌酚红含量，以酚红含量为纵坐标，给药剂量取对数后为横坐标做曲线并寻找线性范围；
5、桔梗祛痰效价的测定，取小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，分别为样品高剂量组、 样品低剂量组、工作对照品高剂量组、工作对照品低剂量组，每组10只，根据桔梗祛痰活性的线性范围的寻找以及预实验，对样品与工作对照品分别选取线性好，且活性接近的一个高剂量与一个低剂量，按步骤4进行给药，并测定小鼠气管分泌酚红含量，以酚红含量为指标，进行效价计算。6、数据处理与效价计算，为方便计算，约定工作对照品(Ps)的效价为l.OU/mg生药，根据平行线测定原理采用量反应的平行线测定法(2 ·2)法，依照《中国药典》2010版.二部附录XIV生物检定统计法，进行样品(Pt)与对工作对照品(Ps)效价的对比检定，从而实现基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制。所述的《中国药典》2010版.二部附录XIV生物检定统计法进行样品(Pt)与对工作对照品(Ps)效价的对比检定时，要求
(1)工作对照品(Ps)和样品(Pt)相邻高低剂量组的比值ω要相等，r为1:0.8 1:0. 5,Iogr=I ；
(2)各剂量组的反应个数(m)应相等。(3)采用随机设计剂量组内不加因级限制，有关因子的各级随机分配到各剂量组。本设计类型的实验结果能分离不同剂量间所致变异。按照上述设计的试验方法进行试验，将测得的实验数据(本实验中是“酚红含量”) 列表如下
桔梗对小鼠气管段酚红分泌量的试验数据表
权利要求
1. 一种基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法，其特征在于，由以下步骤实现(1)、样品的制备，方法是①将桔梗粉碎成粉末，过50目筛，成桔梗粉末；②对所制桔梗粉在烘箱中<60°C下干燥至含水量< 396，置于棕色瓶中密闭保存；③取干燥的桔梗粉碎粉末10.0g，置入容器内，加入10倍重量的质量浓度为75%的乙醇，室温超声提取30min，过滤去残渣，回收乙醇并干燥，计算收率后密封保存干燥物，使用时，再用生理盐水配成相当于含生药IOOmg /ml的初始浓度溶液，并按0. 5剂距进行倍比稀释成7组，稀释的方法是，第一次加入初始浓度溶液的1倍体积的生理盐水，稀释成第一次的稀释液，第一次的稀释液取出一半，成第一组稀释液，留下的一半稀释液再加入同体积的生理盐水，稀释成第二次的稀释液，第二次的稀释液取出一半，成第二组稀释液，依次类推， 连续7次，稀释成7组，成样品；(2)、工作对照品的制备将10批符合《中国药典》(一部)2010年版所收载桔梗项下质量要求的药材混合均勻粉碎成粉末，取10. Og桔梗粉末按照步骤1中的步骤③，制备成工作对照品；(3)、制作标准曲线将酚红用质量浓度为5%碳酸氢钠溶液溶解，依次配成每Iml含0. 01 μ g，0. 1 μ g， 0. 5 μ g, 0. 7 μ g, 1. 0 μ g, 3. 0 μ g, 5. 0 μ g, 10. 0 μ g酚红的酚红溶液，用分光光度计测定OD 值，以酚红剂量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线；(4)、桔梗祛痰活性的检测与线性范围的寻找①桔梗祛痰活性的检测，取小鼠80只，雌雄各半，随机分成8组，每组10只，禁食不禁水8 12h，分别每组灌胃给药体积为0. aiil/10g，空白对照组给等容积生理盐水，给药 30min后由腹腔注射0.5%酚红溶液0. 5 ml/只，30min后处死小鼠，仰位固定于蛙板上， 解剖分离气管，剥去气管周围组织，用滤纸吸净其周围的血液，剪下自甲状软骨至气管分枝处的一段气管，作为取样，放入盛有3ml生理盐水的试管中，再加入5%碳酸氢钠溶液0. Iml 离心lOmin，取上清液用分光光度计在M6nm波长处测定OD值，根据酚红标准曲线计算气管分泌酚红含量并比较；②线性范围的寻找，取小鼠150只，雌雄各半，随机分成15组，桔梗样品和工作对照品各分成7个组，另一组为空白对照组，按步骤(3)制作标准曲线，按步骤(4)的步骤①的给药、取样与测定的操作方法操作，并计算气管分泌酚红含量，以酚红含量为纵坐标，给药剂量取对数后为横坐标做曲线并寻找线性范围；(5)、桔梗祛痰效价的测定，取小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，分别为样品高剂量组、样品低剂量组、工作对照品高剂量组、工作对照品低剂量组，每组10只，根据桔梗祛痰活性的线性范围的寻找以及预实验，对样品与工作对照品分别选取线性好，且活性接近的一个高剂量与一个低剂量，按步骤(4)的步骤①进行给药，并测定小鼠气管分泌酚红含量， 以酚红含量为指标，进行效价计算；(6)、数据处理与效价计算，为方便计算，约定工作对照品的效价为1.0U/mg生药，根据平行线测定原理采用量反应的平行线测定法(2 · 2)法，依照《中国药典》2010版.二部附录XIV生物检定统计法，进行样品与对工作对照品效价的对比检定。
2.根据权利要求1所述的基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法，其特征在于，所述的工作对照品(Ps)和样品(Pt)相邻高低剂量组的比值r要相等，r为1:0. 8 1:0.5 ；剂量组的反应个数m相等。
全文摘要
本发明涉及基于生物活性测定的中药桔梗的质量控制方法，有效解决桔梗的质量控制，保证桔梗临床用药安全有效的问题，方法是，将桔梗粉碎，乙醇超声提取，得干燥物，用生理盐水按初始浓度，以0.5剂距进行倍比稀释成7组，成样品；将桔梗按样品步骤制备成工作对照品；将酚红用碳酸氢钠溶液溶解，以酚红剂量为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线；以动物为实验对象分组给药后处死，取气管，置入生理盐水，离心取上清液，在546nm波长处测定OD值，根据酚红标准曲线计算气管分泌酚红含量并比较；以酚红含量为指标，进行效价计算；本发明易操作，稳定可靠，测试准确，质量控制效果好，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价提供新的思路和参考。
文档编号G01N21/31GK102419307SQ20111023768
公开日2012年4月18日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者刘孟奇, 吴宿慧, 李寒冰, 王保奇, 王灿, 马永洁, 高启龙, 齐向云 申请人:河南中医学院