专利名称：玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，尤其涉及一种玻碳电极免疫检测玉米赤霉烯酮的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(zearalenone)，简称^N，又称F_2毒素，首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮是由镰刀菌属的一些种产生的次生代谢产物，其产毒菌株分布广泛，主要污染玉米，小麦，大米，大麦，小米和燕麦等谷物。ZEN为白色晶体，溶于氯仿、二氯甲烷、乙腈、醇类和苯，微溶于石油醚和正己烷，几乎不溶于水，但溶于碱性水溶液。食物及动物饲料中的玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物的雌激素过多综合征，并导致不孕、流产、死胎等，对猪、牛和羊影响较大，给畜牧业带来很大的经济损失。目前，大部分国家对食品、谷物、饲料当中的ZEN含量都作了十分严格的规定，例如澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50 μ g/kg，意大利规定在谷物和谷类产品当中^N的含量不能超过100 μ g/kg，而在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200 μ g/kg，而根据 2011年最新出台的《GB 2761-2011食品中真菌毒素限量》要求谷物及其制品中，ZEN含量应低于60 μ g/kg。玉米赤霉烯酮的定量检测通常包括色谱检测法和免疫学方法。色谱检测法包括薄层色谱、气相色谱(GC)、高压液相色谱(HPLC)等。但就常规检测而言，上述方法价格昂贵、 操作繁琐，对于实际应用限制较大。就免疫学检测方法而言，有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金试纸条等，均具有成本低，简单易操作的优势。但是在实际检测中，普通ELISA方法还需要酶标仪、电脑等检测设备，不方便现场检测；而对于免疫胶体金试纸条，则存在灵敏度不及ELISA的劣势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种玻碳电极免疫检测玉米赤霉烯酮的方法。本发明的方法可以快速检测出待测样品中含有的ZEN的量；同时，本发明的方法检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高；本发明的方法采用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率；本发明的方法相比传统的ELISA方法还具有仪器便携，利于现场检测的特点。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括具体步骤如下 步骤一，将ZEN半抗原通过活泼酯法与OVA偶联，得到偶联物^N-OVA ； 步骤二，对待侧样品进行萃取，得到萃取液；
步骤三，将^N-OVA包被在酶标反应板上，封闭后分别加入已知的不同浓度的ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，孵育；
3步骤四，孵育后加入ALP标记的二抗，之后再加入底物缓冲液和终止液，进行氧化峰电流测定，得到结果；
步骤五，根据已知不同浓度ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液的氧化峰电流值，制作标准曲线，再根据待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液的氧化峰电流值，通过标准曲线得到待测样品萃取液中的ZEN浓度。优选的，步骤二中，所述萃取方法为取0. 3g待测样品，加入3ml体积分数为70% 甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min ；上清液通过快速定性滤纸过滤，稀释5倍后， 得萃取液。优选的，步骤四中，所述底物缓冲液的配制方法为0. Imol 二乙醇胺溶于IL水中，再加入0. OOlmol的MgCl2，调节pH至9. 8，再加入0. Olmol WpNPP即可；所述终止液的配制方法为2molNa0H溶于IL水中。优选的，步骤四中，所述氧化峰电流测定是将所述加入底物缓冲液和终止液后的酶标反应板孔内的溶液转入5ml 2mol/L BR缓冲液内以微分脉冲伏安法进行电化学检测， 记录氧化峰电流值。优选的，所述BR缓冲液的配制方法为向IOOml水中加入磷酸、醋酸、硼酸，使磷酸、醋酸、硼酸的终浓度均为0. 04mol/L ；使用0. 2mo/L的NaOH调节pH至3. 0。本发明的方法采用酶联免疫间接竞争结合法，以玉米赤霉烯酮的偶联物^N- OVA (抗原)包被酶标板，与单克隆抗体、待测物进行间接竞争，以酶标二抗标记，再相继加入底物液和终止液，通过微分脉冲伏安(DPV)法进行电化学检测，根据氧化峰电流来判定待测物抗原浓度。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明检测对象单一且针对性强， 准确率高；检测速度快，所需时间短，不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测， 便于基层推广和运用；能快速、简便、及时地检测玉米赤霉烯酮。
图1为本发明实施原理示意图；其中a为不加入含有 N样品的示意图，b为加入含有ZEN样品的示意图2为本发明实施例96孔板检测示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。术语“ ^N”是玉米赤霉烯酮毒素的简称，“OVA”是卵清白蛋白的简称，“ PBS”是磷酸盐缓冲溶液的简称，“NHS”是N-羟基丁二酰亚胺的简称，“DCC”是二环己基碳二亚胺的简称，“PBST”是添加了 Tween-20的磷酸盐缓冲(PBS)溶液的简称，“pNPP”是对硝基苯磷酸的简称，“ALP”是碱性磷酸酶的简称，“BR”是Britton-Robinson Buffer Solution (伯瑞坦-罗比森缓冲溶液)的简称。
本发明的基本原理阐述如下本发明采用酶联免疫(ELISA)和电化学相结合的方法，可实现现场检测的便携性和较高的灵敏度。由于伏安检测仪体积小，重量轻，可以随身携带，因此用于大量样品的常规定量检测具有方便快捷、成本低廉、灵敏度高的特点，为玉米赤霉烯酮的快速高效检测提供了有效途径。其中，酶联免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键、范德华力和疏水区域的综合作用，因此具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，非常适合于复杂基质中痕量组分的分离或检测。将一定比例的偶联抗原包被于酶标板上，与抗体和待测物进行间接竞争性结合，再通过酶标二抗与抗原抗体复合物结合，结合量通过催化底物液反应以电化学的方式进行定量检测。其中，电化学传感器就是将感受的物理量、化学量等信息按一定规律转换成便于测量和传输的电信号的装置。它由固定化的生物敏感材料作为识别元件，经过理化换能器产生间断的或连续的信号，再由接受装置放大或直接收集处理。因为换能器产生的信号强度与被分析物浓度成比例，因此电化学传感器在一定程度上能精确定量被测物。本发明采用基于对硝基苯磷酸(pNPP) —碱性磷酸酶(ALP)体系的电化学免疫传感方法，检测谷物中的玉米赤霉烯酮。其主要方案是以间接竞争ELISA为基础，以ALP为二抗的标记酶，以PNPP为底物，由于AIiMIKpNPP的产物为对硝基苯酚(PNP)，所以使用伏安法记录PNP的氧化峰电流，从而建立检测玉米赤霉烯酮的标准曲线，并检测了实际样品中的玉米赤霉烯酮含量。
实施例1、抗原的制备，玉米赤霉烯酮包被抗原(ZEN - OVA)的制备
取0. 33ml (3mg/ml) ZEN,混合于1. 2ml吡啶中，加入^ig 0-羧甲基羟胺，室温搅拌反应 24h0真空干燥后，加入蒸馏水，并使其溶解，调整pH至8.0。未反应的ZEN用苯抽提除去(3ml苯，共抽提3次)，除去苯相，保留水相。水相调pH至3.0，用乙酸乙酯抽提(IOml乙酸乙酯，共抽提4次)，抽出酯相，弃水相。酯相用无水硫酸钠滤过后吹干。吹干后的结晶物溶于0. 5ml碱性氧化铝处理过的二氧六环中。称取IOmgOVA溶于0. 7ml 0. 05mol/L(pH7. 2) 的PBS溶液中，将两溶液于4°C缓慢混合。ImgNHS和^iigDCC溶于0. 2ml 二氧六环中，并缓慢滴加此溶液。将混合后的溶液放置室温搅拌反应16h。调pH至6.0，通风橱中吹干，缓慢滴加DCC溶液(2mgDCC溶于0. 2ml 二氧六环中得到)。室温搅拌反应48h。最后用PBS溶液透析2 3d，-20°C保存。2、对待测样品进行萃取，得到萃取液
将玉米研磨，取0. 3g作为待测样品，加入3ml体积分数为70%的甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min。上清液通过快速定性滤纸过滤，稀释5倍后，取50μ 1进行检测。3、免疫伏安方法检测待测样品萃取液
3. 1将^N-OVA以最佳包被浓度包被在96孔板上，封闭后分别加入已知的不同浓度的 ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，孵育；
(1)将^N-OVA以最佳包被浓度包被在96孔白板上，37°C孵育4小时；本发明实施例原理如图1所示；其中，a为不加入含有ZEN样品的示意图，b为加入含有ZEN样品的示意图；本发明实施例96孔板检测示意图如图2所示。检测试剂盒中含有100、50、10、5、1、0. 1、 0 ng/ml的ZEN标准溶液，根据标准溶液的氧化峰电流值(每个样品3次重复，得到平均值) 确定标准曲线，再根据待测样品的氧化峰电流值(每个样品3次重复，得到平均值)从标准曲线中计算得到对应浓度；为了测试试剂盒的可靠性，设计加入空白对照，如果在检测中空白对照的氧化峰电流值达到或超过0 ng/mlZEN溶液所对应的氧化峰电流值的一半，则判定试剂盒失效。(2) M 0.01 M PBST洗涤3次，每次加入PBST，震荡3分钟并倒出孔内液体，加入质量分数为5%的脱脂奶粉，37°C孵育2小时；
(3)用0.01M PBST洗涤3次，每次加入PBST震荡3分钟并倒出孔内液体；
(4)在标准曲线孔中依次加入100、50、10、5、1、0.1、0 ng/ml ^^EN纯品50 μ 1，并做3 次重复；在待测孔中加入步骤2中制备的待测样品萃取液50 μ 1，并做3次重复。以上各孔中分别加入50 μ 1的1/40000稀释的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；空白孔中加入100 μ 1 0. OlM PBS，将96孔板放置37°C孵育1小时;
3. 2孵育后加入ALP标记的二抗，之后再加入底物液和终止液，进行氧化峰电流测定， 得到结果；
(1)用0. OlM PBST洗涤3次，每次加入PBST震荡3分钟并倒出孔内液体，ALP标记的羊抗鼠IgG抗体用0. OlM PBS稀释至1 :1000，以IOOul/孔加入酶标反应板，37°C温育lh。 PBST洗涤3次。(2)用0.01 M PBST洗涤3次，每次加入PBST震荡3分钟并倒出孔内液体，加入 100 μ 1底物缓冲液；所述底物缓冲液为0. Imol 二乙醇胺溶于IL水中，再加入0. OOlmol 的MgC12，调节ρΗ至9. 8，再加入0. Olmol的ρΝΡΡ即可。避光37°C温育30min，再加入50 μ 1 终止液(2 mol/L)NaOH终止反应。将孔内的溶液转入5mlBR缓冲液(pH3. 0)内以微分脉冲伏安(DPV)法进行电化学检测。测试条件扫描范围为0. 6 1. 5V，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度20ms，脉冲周期为200ms，扫速为50mV/s。电化学反应池中，在_0. IV处搅拌富集90s， 静置IOs后进行扫描，记录氧化峰电流。每次测量后，电极在1. OV处极化120s，以清洗电极上的残留物质。4、检测ZEN的标准曲线的制作与结果判定
(1)根据已知不同浓度ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体加入后得到的氧化峰电流值，绘制标准曲线，具体做法为以加入ZEN浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度^N 所得到的不同氧化峰电流值的平均数除以不加入ZEN (空白)所得到的氧化峰电流值的结果为纵坐标，通过Microsoft Excel软件，绘制散点图并添加趋势线公式和R2 ；
(2)根据待测样品的氧化峰电流值的平均值，通过标准曲线所得到的趋势线公式计算， 得到对应的ZEN浓度。5、加标样本的化学氧化峰电流检测针对已知阴性样本(不含^N的玉米)， 研磨后，添加ZEN，制备加标样本，使样本中的ZEN浓度为lyg/kgUOyg/kgJOyg/kg。取 0. 3g加标样本加入3ml70% (ν/ν)甲醇，剧烈震荡15分钟，静置1小时，2500g离心15分钟，取上清液。上清液通过快速定性滤纸过滤，稀释5倍后，取50 μ 1进行检测。将萃取液加入待测样品孔中，再加入50 μ 1的1/40000稀释的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，同一样品做3次重复。最后，通过加标样本的氧化峰电流值和标准样品的标准曲线计算加标样本的玉米赤霉烯酮含量，其回收率在80% 120%。综上所述，本发明的方法能够快速检测出待测样品中含有的ZEN的量；相比ELISA 方法还具有仪器便携，利于现场检测的特点。同时，本发明的方法检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高；本发明的方法采用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体， 与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。
权利要求
1.一种玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将ZEN半抗原通过活泼酯法与OVA偶联，得到偶联物^N-OVA ；步骤二，对待侧样品进行萃取，得到萃取液；步骤三，将^N-OVA包被在酶标反应板上，封闭后分别加入已知的不同浓度的ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，孵育；步骤四，孵育后加入ALP标记的二抗，之后再加入底物缓冲液和终止液，进行氧化峰电流测定，得到结果；步骤五，根据已知不同浓度ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液的氧化峰电流值，制作标准曲线，再根据待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液的氧化峰电流值，通过标准曲线得到待测样品萃取液中的ZEN浓度。
2.根据权利要求1所述的玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，其特征在于，步骤二中，所述萃取方法为取0. 3g待测样品，加入3ml体积分数为70%甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min ；上清液通过快速定性滤纸过滤，稀释5倍后，得萃取液。
3.根据权利要求1所述的玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，其特征在于，步骤四中，所述底物缓冲液的配制方法为0. Imol 二乙醇胺溶于IL水中，再加入0. OOlmol的 MgCl2,调节pH至9. 8，再加入0. Olmol的pNPP即可；所述终止液的配制方法为JmolNaOH 溶于IL水中，即得。
4.根据权利要求1或3所述的玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，其特征在于，步骤四中，所述氧化峰电流测定是将所述加入底物缓冲液和终止液后的酶标反应板孔内的溶液转入5ml 2mol/L BR缓冲液内以微分脉冲伏安法进行电化学检测，记录氧化峰电流值。
5.根据权利要求4所述的玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，其特征在于，所述 BR缓冲液的配制方法为向IOOml水中加入磷酸、醋酸、硼酸，使磷酸、醋酸、硼酸的终浓度均为0. 04mol/L,使用0. 2mo/L的NaOH调节pH至3. 0，即得。
全文摘要
本发明公开了一种玻碳电极免疫检测玉米赤霉稀酮的方法，包括如下步骤将ZEN半抗原通过活泼酯法与OVA偶联，得到偶联物ZEN-OVA；对待侧样品进行萃取，得到萃取液；将ZEN-OVA包被在酶标反应板上，封闭后分别加入已知的不同浓度的ZEN纯品与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，待测样品萃取液与抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的混合溶液，孵育；孵育后加入ALP标记的二抗，之后再加入底物缓冲液和终止液，进行氧化峰电流测定，得到结果；制作标准曲线，通过标准曲线得到待测样品萃取液中的ZEN浓度。本发明可以快速、准确检测出待测样品中含有的ZEN量，同时相比传统的ELISA方法还具有仪器便携，利于现场检测的特点。
文档编号G01N33/64GK102384977SQ20111023969
公开日2012年3月21日 申请日期2011年8月19日 优先权日2011年8月19日
发明者严亚贤, 孙建和, 王元凯, 郝倩雯 申请人:上海交通大学