专利名称：脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法
技术领域：
本技术发明是一种脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，设计生物技术领域。
背景技术：
脱氢表雄酮(DHEA)，是一种C19类固醇激素，主要由肾上腺皮质网状带分泌，在循环血液中以DHEA及其储存硫酸盐形式(DHEAS)存在(体内后者是前者的100倍左右)，DHEA能转化为雌激素、雄激素、孕激素、皮质醇和皮质酮等其他激素，因此被誉为多向性“激素缓冲剂”。许多研究表明，DHEA在促进脂肪代谢、抗氧化、提高机体免疫力、增强细胞活性、防治老年性痴呆等方面均有积极的作用。机体衰老后体内DHEA及DHEAS水平显著下降，导致各种类固醇激素的含量明显下降，同时伴随心血管疾病、肿瘤发病率的上升以及免疫功能的下降。在实际应用中，DHEA已作为抗衰老保健药进入市场，它不仅抗衰老，还对糖尿病、心脏病、乳腺癌、子宫癌的预防和治疗有明显作用。同时该激素是近年来国际奥委会列出的禁用药物之一，是常规的兴奋剂检测项目。目前对血清和尿液中DHEA的检测方法主要分为色谱技术和免疫分析技术。色谱分析法包括气相色谱法(HPLC)、气质联用和液质联用法等，该类技术需要昂贵的仪器设备，而且DHEA和DHEAS在检测过程中能衍生成同种物质，干扰测定，所以样本首先需要通过固相萃取分离法除去DHEAS，这使得操作过程相对繁琐，技术要求较闻。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。实现该测定的重要环节是针对待测分子的高特异性、高亲和力抗体的制备。但许多小分子半抗原免疫原性较弱，通过传统的免疫方法不易产生特异性的抗体，需要将其偶联到大分子物质上(载体)后获得免疫原性，然后才能产生高质量的抗体。偶联方法的选择，需要根据小分子的结构以及载体的特性来决定，可利用小分子含的羧基、氨基或者羟基与蛋白质分子形成共价键，将小分子连接到载体上去。连接后的小分子成为完全抗原，经过鉴定后可以用来免疫动物获得抗体,并完成后续ELISA试剂盒的制备。DHEA的分子式是C19H2802，分子量为288. 41，不具备免疫原性，为此，必须先设法将半抗原DHEA与载体蛋白偶联制备成全抗原，才能用于免疫动物。本专利从ELISA试剂盒制备的源头入手，将DHEA与载体蛋白BSA偶联，并利用新技术提高偶联效率，制备稳定的DHEA-BSA,再使用免疫技术制备特异性高亲和力强的抗体，为试剂盒的制备提供高品质原材料。
发明内容
本技术利用混合酸酐法，通过多次实验，调整反应试剂比例，以最适比例得到最佳偶联结合比的DHEA-BSA，并采用紫外吸收法、质谱分析法、SDS-PAGE及分光光度法分别针对人工抗原的浓度、纯度、结构以及欧联比进行综合评估，筛选出最好的作为免疫原，制备兔多抗。本发明提供的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法采用脱氢表雄酮和琥珀酸酐作为原料，包括以下步骤步骤一、制备脱氢表雄酮全抗原(DHEA-BSA)，采用混合酸酐法制备DHEA-BSA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取适量修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量BSA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到抗原DHEA-BSA ；步骤二、制备脱氢表雄酮包被抗原(DHEA-OVA)，采用混合酸酐法制备DHEA-0VA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量OVA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到抗原DHEA-OVA ；步骤三、制备抗脱氢表雄酮(DHEA)抗体，融合形成表达ant1-DHEA的杂交瘤细胞株；经多次有限稀释后由ELISA检测筛选P/N值最高的单克隆抗体；将细胞扩大培养后收取表达上清，选用蛋白A柱进行分离、纯化，浓缩后得到抗DHEA单克隆抗体；步骤四、制备酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，使用固相载体，包被步骤二所得的DHEA-OVA经过封闭、洗板处理后制成酶标板，加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，通过生物素-亲和放大系统，依次加入底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。优选的，上述步骤一中具体修饰的半抗原的步骤为1.1)取重量1:1的25-75mg脱氢表雄酮与25_75mg琥珀酸酐在室温下反应过夜；1. 2)采用TLC薄层检测反应产率，硅胶柱层析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脱，按每瓶50ml收集，回收溶剂，TLC跟踪检测，合并相同部分，用TLC与脱氢表雄酮对照，留取反应产物即为修饰的半抗原。优选的，上述步骤一中利用修饰过的半抗原制备抗原DHEA-BSA的具体步骤为1. 3)取5mg_20mg修饰过的半抗原，加入10_30ul氯甲基异丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反应2h，得A液；1. 4)将10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸盐缓冲液中，得B液，将其冷却至4°C ；1. 5)将A液逐滴加入B液中，搅拌反应6h，然后过S印hadex G-100柱，PBS洗脱，收集蛋白部分，除去未反应的半抗原1. 6)对收集的蛋白部分进行超滤杯浓缩，SDS-PAGE胶检测，DEHA-BSA电泳条带滞后于载体蛋白BSA的电泳条带；1. 7)冷冻干燥24h，冻干粉分装，得抗原DEHA-BSA。优选的，上述步骤二中具体修饰的半抗原的步骤为2.1)取重量1:1的25-75mg脱氢表雄酮与25_75mg琥珀酸酐在室温下反应过夜；
2. 2)采用TLC薄层检测反应产率，硅胶柱层析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脱，按每瓶50ml收集，回收溶剂，TLC跟踪检测，合并相同部分，用TLC与脱氢表雄酮对照，留取反应产物即为修饰的半抗原。优选的，上述步骤二中利用修饰过的半抗原制备包被抗原DHEA-OVA的具体步骤为2. 3)取5mg-20mg修饰过的半抗原，加入10_30ul氯甲基异丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反应2h，得A液；2. 4)将10-30mg0VA溶解在l_4ml碳酸盐缓冲液中，得B液，将其冷却至4°C ；2. 5)将A液逐滴加入B液中，搅拌反应6h，然后过S印hadex G-100柱，PBS洗脱，收集蛋白部分，除去未反应的半抗原2. 6)对收集的蛋白部分进行超滤杯浓缩，SDS-PAGE胶检测，DEHA-OVA电泳条带滞后于载体蛋白OVA的电泳条带；2. 7)冷冻干燥24h，冻干粉分装，得抗原DEHA-OVA。优选的，上述步骤三中制备杂交瘤细胞具体步骤为3.1)选用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每只10_30ug，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量皮下加强免疫，每2周加强I次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d腹腔加强免疫；3. 2)用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠脾细胞，制备杂交瘤细胞。优选的，上述步骤三中利用杂交瘤细胞进一步制备得到抗DHEA抗体的具体步骤为3. 3)在所述步骤3. 2)得到的杂交瘤细胞2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆3. 4)每次克隆后扩大培养建库的细胞上清；3. 5)用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗DHEA的抗体。优选的，上述步骤四具体包括以下步骤4.1)使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化；4. 2)在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的DHEA_0VA，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板；4. 3)检测时，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，形成标准品/待测标本中的DHEA和酶标板上包被的DHEA竞争结合生物素化抗DHEA抗体的局面，再通过生物素-亲和素放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。本发明通过高效的偶联方法的得到稳定性好的DHEA-BSA，并通过免疫动物得到特异性高及亲和力强的单克隆抗体，用来制备DHEA的ELISA试剂盒。通过与高效液相色谱(HPLC)法的比较，其操作步骤简单、可一次检测多个样本、且不需贵重仪器、同时在检测灵敏度、所需时间等方面均优于HPLC法。同时，该试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，相较于HPLC法无需使用正己烷、乙腈、甲醇等有机试剂，减少对实验者及环境的毒害，在环保方
面更胜一筹。
图1为本发明试剂盒质量指标检测浓度-光密度示意图。
具体实施例方式为了便于本领域普通技术人员理解和实施本发明，下面结合附图及具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。本专利采用效率高的新型偶联技术，获得稳定性好的DHEA-BSA，并利用免疫技术制备高特异性及高亲和力的单克隆抗体，将其应用于ELISA试剂盒的制备和生产中。其中将半抗原DHEA与载体蛋白BSA偶联制备成全抗原是制备高品质DHEA酶联免疫试剂盒的最为关键的因素之一。主要的技术路线如下DHEA酶联免疫试剂盒的研制方法，其具体步骤为a、DHEA全抗原及包被抗原的制备采用混合酸酐法制备DHEA-BSA.取25_75mg脱氢表雄酮与25_75mg琥珀酸酐(重量1:1)在室温下反应过夜，TLC薄层检测反应产率，硅胶柱层析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脱，按50ml每瓶收集，回收溶剂，TLC跟踪检测，合并相同部分，用TLC与脱氢表雄酮对照，留取反应产物即为修饰的半抗原。取5mg_20mg修饰过的半抗原，加入10_30ul氯甲基异丁酯和5_20ul三正丁胺，在4°C反应2h，得A液。将10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸盐缓冲液中，得B液，将其冷却至
40C ο将A液逐滴加入B液中，搅拌反应6h，然后过S印hadex G-100柱，PBS洗脱，收集蛋白部分，除去未反应的半抗原。收集的蛋白部分超滤杯浓缩，SDS-PAGE胶检测，DEHA-BSA电泳条带滞后于载体蛋白BSA的电泳条带。冷冻干燥24h，冻干粉分装，得抗原脱氢表雄酮-BSA。同法制得包被抗原DHEA-OVA。b、抗DHEA抗体的制备选用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每只10_30ug，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量腹腔加强免疫，每2周加强I次，加强后每隔7d眼眶采血，分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d尾静脉加强免疫。用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠腹水脾细胞，制备杂交瘤细胞。2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆。每次克隆后扩大培养建库的细胞上清。用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗DHEA的抗体。采用间接ELISA法进行鉴定，抗体效价为1: 160000-1 320000。c、ELISA试剂盒的研制本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中DHEA的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的DHEA-OVA，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，形成标准品/待测标本中的DHEA和酶标板上包被的DHEA竞争结合生物素化抗DHEA抗体的局面，再通过生物素-亲和素放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。2、经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线b.灵敏度=ELISA法检测血清标本时最低检测限为55. lpg/ml ；c.回收率用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(n = 5)。平均回收率98. 74% (表I)。如图1所示，为本发明试剂盒质量指标检测浓度-光密度示意图。
权利要求
1.一种脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，采用脱氢表雄酮和琥珀酸酐作为原料，其特征在于包括以下步骤 步骤一、制备脱氢表雄酮人工抗原(DHEA-BSA)，采用混合酸酐法制备DHEA-BSA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取适量修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量BSA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到抗原DHEA-BSA ； 步骤二、制备脱氢表雄酮人工包被抗原(DHEA-OVA)，采用混合酸酐法制备DHEA-0VA，取脱氢表雄酮与琥珀酸酐作为原料，将两者反应、层析、洗脱、收集，合并后留取反应产物得到修饰的半抗原；取修饰过的半抗原，加入氯甲基异丁酯和三正丁胺，反应后得A液，取适量OVA溶解在碳酸盐缓冲液中得B液，将A液加入B液中，经过搅拌、洗脱、收集得到蛋白部分，再进行浓缩、冷冻、干燥后得到人工抗原DHEA-OVA ； 步骤三、制备抗脱氢表雄酮(DHEA)单克隆抗体，融合形成表达ant1-DHEA的杂交瘤细胞株；经多次有限稀释后由ELISA检测筛选P/N值最高的单克隆抗体；将细胞扩大培养后收取表达上清，选用蛋白A柱进行分离、纯化，浓缩后得到抗DHEA单克隆抗体； 步骤四、制备酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，使用固相载体，包被步骤二所得的DHEA-OVA经过封闭、洗板处理后制成酶标板，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，再经生物素-亲和素放大系统，依次加入底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。
2.如权利要求1所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤一中具体修饰的半抗原的步骤为1.1)取重量1:1的25-75mg脱氢表雄酮与25_75mg琥珀酸酐在室温下反应过夜；1.2)采用TLC薄层检测反应产率，硅胶柱层析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脱，按每瓶50ml收集，回收溶剂，TLC跟踪检测，合并相同部分，用TLC与脱氢表雄酮对照，留取反应产物即为修饰的半抗原。
3.如权利要求2所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤一中利用修饰过的半抗原制备抗原DHEA-BSA的具体步骤为1.3)取5mg-20mg修饰过的半抗原，加入10_30ul氯甲基异丁酯和5_20ul三正丁胺，在.4V反应2h，得A液；1.4)将10-30mgBSA溶解在l_4ml碳酸盐缓冲液中，得B液，将其冷却至4°C ； .1.5)将A液逐滴加入B液中，搅拌反应6h，然后过S印hadexG-100柱，PBS洗脱，收集蛋白部分，除去未反应的半抗原； .1.6)对收集的蛋白部分进行超滤杯浓缩，SDS-PAGE胶检测，DEHA-BSA电泳条带滞后于载体蛋白BSA的电泳条带； .1.7)冷冻干燥24h，冻干粉分装，得人工抗原DEHA-BSA。
4.如权利要求1所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤二中具体修饰的半抗原的步骤为 .2.1)取重量1:1的25-75mg脱氢表雄酮与25_75mg琥珀酸酐在室温下反应过夜； .2.2)采用TLC薄层检测反应产率，硅胶柱层析，石油醚/丙酮混合溶液梯度洗脱，按每瓶50ml收集，回收溶剂，TLC跟踪检测，合并相同部分，用TLC与脱氢表雄酮对照，留取反应产物即为修饰的半抗原。
5.如权利要求4所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤二中利用修饰过的半抗原制备包被抗原DHEA-OVA的具体步骤为 2.3)取5mg-20mg修饰过的半抗原，加入10_30ul氯甲基异丁酯和5_20ul三正丁胺，在4V反应2h，得A液； 2.4)将10-30mg0VA溶解在l_4ml碳酸盐缓冲液中，得B液，将其冷却至4°C ； 2.5)将A液逐滴加入B液中，搅拌反应6h，然后过S印hadex G-100柱，PBS洗脱，收集蛋白部分，除去未反应的半抗原； 2.6)对收集的蛋白部分进行超滤杯浓缩，SDS-PAGE胶检测，DEHA-OVA电泳条带滞后于载体蛋白OVA的电泳条带； 2.7)冷冻干燥24h，冻干粉分装，得人工抗原DEHA-0VA。
6.如权利要求1所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤三中制备杂交瘤细胞具体步骤为 3.1)选用BALB/C小鼠，用DHEA-BSA免疫，每只10_30ug，皮下多点及四脚掌初次免疫，14d后相同剂量皮下加强免疫，每2周加强I次，加强后每隔7d尾部采血，分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价，于细胞融合前3d腹腔加强免疫； 3. 2)用PEG融合处于对数生长期的骨髓瘤细胞和BALB/C小鼠腹水脾细胞，制备杂交瘤细胞。
7.如权利要求6所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤三中利用杂交瘤细胞进一步制备得到抗DHEA抗体的具体步骤为 3.3)在所述步骤3. 2)得到的杂交瘤细胞2周后用间接ELISA法检测细胞上清液，选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3-4次克隆； 3.4)每次克隆后扩大培养建库的细胞上清； 3.5)用硫酸铵沉淀法粗提单抗，用亲和层析法纯化分离得到特异性高的抗DHEA的抗体。
8.如权利要求1所述的脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，其特征在于所述步骤四具体包括以下步骤 ·4.1)使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化； ·· 4. 2)在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的DHEA-0VA，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板； ·4.3)检测时，依次加入不同浓度的标准品/待测标本及生物素化的抗DHEA单克隆抗体，形成标准品/待测标本中的DHEA和酶标板上包被的DHEA竞争结合生物素化抗DHEA抗体的局面，再通过生物素-亲和素放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成DHEA的ELISA试剂盒的制备。
全文摘要
本发明公开的了一种脱氢表雄酮酶联免疫吸附测定试剂盒的研制方法，采用脱氢表雄酮和琥珀酸酐作为原料，利用混合酸酐法，分别制备脱氢表雄酮人工抗原(DHEA-BSA和DHEA-OVA)、抗脱氢表雄酮(DHEA)单克隆抗体，进而制备酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。通过与高效液相色谱(HPLC)法的比较，其操作步骤简单、可一次检测多个样本、且不需贵重仪器、同时在检测灵敏度、所需时间等方面均优于HPLC法。同时，相较于HPLC法ELISA方法无需使用正己烷、乙腈、甲醇等有机试剂，可减少对实验者及环境的毒害，在环保方面更胜一筹。
文档编号G01N33/74GK102998464SQ201110275129
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者何峰容, 李华渊, 童晓玲, 杨娟, 章秀波, 汪景, 谢正红 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司