专利名称：检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒，特别是一种基于IgG2b、IgM两种单抗的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒及制备方法。
背景技术：
1、免疫诊断在日本血吸虫病防治中的重要性血吸虫病是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人兽共患寄生虫病，全球76个国家和地区的约2亿人口受感染，有6亿人口受感染威胁。我国是日本血吸虫病流行区，建国初期曾严重影响了人们的正常生产和生活。经过50多年的防治，已经取得了举世瞩目的成就，到2003年全国共有血吸虫病病人数843007人，较建国初期(1161. 2万人)减少了 92.74%。已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)阻断了血吸虫病的传播；仅剩湖南、湖北、江西、安徽、江苏等5省湖区及川、滇山区未得到控制。我们在欣喜的同时，也面临着进一步防治工作的巨大挑战。随着防治工作的深入，人群感染度不断下降，低度流行区扩大，血吸虫病的病原学诊断在现场大范围的应用越来越困难，不但敏感性差、费时费力， 且不易被群众和工作人员接受。另一方面，现在控制血吸虫病的主要手段是吡喹酮化疗，但大规模、反复单一药物化疗，可能产生药物抗性，据国外报道，已经出现具吡喹酮抗性的曼氏血吸虫株，因此研制用于血吸虫病低度流行区的敏感性和特异性更高的诊断手段已经被列为第三大世界血吸虫病防治规划优先研究项目。2、循环抗原在日本血吸虫病免疫诊断中的作用经过几十年的发展，血吸虫病免疫诊断技术已具有较高的敏感性、特异性和可行性。检测血吸虫循环抗体是一种成本低、操作简单的检测，也是目前现场流行病学调查时应用最广的途径，但循环抗体在治疗后相当长一段时间内仍保持较高水平，不易区分既往感染和现症感染，无法在现场应用时确定目标化疗人群；而且难以反映药物疗效，不宜用作疗效考核的评价指标。另一种途径是检测循环抗原，循环抗原(circulating antigen, CAg) 是存在于患者血液、唾液、尿液等体液中的血吸虫虫体的代谢产物及分泌物，检测患者血清或尿液中的循环抗原，可评估虫负荷数和活动性感染，可以作为诊断的依据。而且，在治疗后，CiVg转阴较快，检测循环抗原可以作为疗效考核的依据，基于循环抗原检测的各种方法层出不穷，但都困扰在敏感性低、特异性不强的问题上，因此寻找敏感性高、特异性强的循环抗原检测方法和技术是血吸虫病免疫诊断的新方向。3.单克隆抗体技术在血吸虫病免疫诊断技术中的应用自Kohler和Milstein(197 发明单克隆抗体制备技术以来，单抗技术广泛运用于医学和生物学的各个领域，为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供了重要的手段。单克隆抗体是由一个细胞产生的，其成分(类，亚类，型和结合P位等)是同源的，只针对复杂抗原的一个抗原决定簇，并有相同的亲和性，抗体滴度也很高，检测循环抗原具有高度的特异性，抗原和单抗可规模化生产，方法简便实用，且具有较好的疗效考核价值，可区分现症感染与既往感染，可用于血吸虫病的免疫诊断和流行病学现场调查。
发明内容
本发明的目的在于提供检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒及制备方法，所述的这种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒及制备方法要解决现有技术中检测血吸虫循环抗原的方法敏感性低、特异性不强的技术问题。本发明提供了一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，包括一个盒体，所述的盒体中设置有一个垫板，所述的垫板的上侧的一端设置有一个样品垫，所述的垫板的上侧的另外一端设置有一个末端吸水垫，所述的垫板的中部设置有一个检测层，所述的检测层和所述的末端吸水垫紧密连接，在所述的样品垫和所述的检测层之间设置有一个金标垫，所述的金标垫上含有胶体金标记的抗血吸虫病循环抗原单克隆抗体，所述的样品垫、金标垫和所述的检测层紧密连接，在所述的检测层上包被有检测线和质控线，所述的盒体的一个正面上设置有一个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。进一步的，所述的检测层的一端设置在所述的金标垫的下侧，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下侧。进一步的，所述的检测层的另外一端设置在所述的末端吸水垫的下侧。进一步的，所述的检测层为硝酸纤维素膜。进一步的，所述的检测线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为0. 8 1. 5mg/ml的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b后，均勻地喷在检测层中段制成。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO 4978的小鼠杂交瘤细胞产生。进一步的，所述的质控线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为2 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均勻地喷在检测层上制成，所述的质控线靠近所述的末端吸水垫，距离检测线0. 5 1cm。进一步的，所述的金标垫包括一个纤维膜，所述的纤维膜上喷设有标记好胶体金的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，喷液量为0. 8 2. 0 μ 1/cm。进一步的，所述的纤维膜为玻璃纤维膜。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO 3642的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明还提供了上述的一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，包括一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤，所述的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异单克隆抗体用于制备胶体金标记的单克隆抗体和检测单克隆抗体，包括一个制备胶体金的步骤，包括制备一个胶体金标记抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgM的步骤，包括一个制备金标垫的步骤，当制备好的胶体金与待标记的单克隆抗体成功结合后，用二维喷动仪将标记好胶体金的单克隆抗体均勻地喷在检测层上，包括一个制备检测层中检测线和质控线的步骤，将抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体 IgG2b均勻地喷在检测层中段，得到检测线，将羊抗鼠IgG或IgM，均勻地喷在检测层上，距离检测线0. 5 Icm处得到质控线，包括一个制备盒体和垫板的步骤，将检测层粘贴在垫板上，将垫板设置在所述的盒体中。进一步的，所述的检测层为硝酸纤维素膜。进一步的，在一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤中，包括如下步骤，1) 一个动物免疫的步骤，在所述的动物免疫的步骤中，先制备血吸虫的可溶性抗原，然后通过血吸虫的可溶性抗原免疫动物，取得免疫脾细胞；2) —个细胞融合的步骤，取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1 5 1 10比例在PEG4000作用下进行融合；3) 一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤，得到保藏号为CGMCC NO :4978和3642的小鼠杂交瘤细胞株；4)将上述的单克隆细胞株分别注入动物体内产生一种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgM和一种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b的步骤；5) 一个分别纯化上述的两种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤。进一步的，在所述的一个制备盒体和垫板的步骤中，先准备一个垫板，先将含有检测线和质控线的检测层粘贴在垫板上，然后在检测层的一端先粘贴金标垫，金标垫上含有胶体金标记的抗血吸虫病循环抗原单克隆抗体，再在远离检测层的金标垫的一侧粘贴样品垫，所述的样品垫、金标垫和所述的检测层紧密连接，在检测层的另一端粘贴末端吸水垫， 检测层和末端吸水垫紧密相连，将垫板设置在盒体中，在盒体的正面上设置加样孔和观察孔，所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。进一步的，所述的检测线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为0. 8 1. 5mg/ml的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b后，均勻地喷在检测层中段制成。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO 4978的小鼠杂交瘤细胞产生。进一步的，所述的质控线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为2 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均勻地喷在检测层上制成，所述的质控线靠近所述的末端吸水垫，距离检测线0. 5 1cm。进一步的，所述的金标垫包括一个纤维膜，所述的纤维膜上喷设有标记好胶体金的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，喷液量为0. 8 2. 0 μ 1/cm。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO 3642的小鼠杂交瘤细胞产生。本发明的工作原理是当待测血清样品等液体标本滴加在样品垫上时，液体即向质控线处不断扩散，当液体到达金标垫处时，抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体金标记物被溶解，同时与标本中的循环抗原反应而形成复合物，液体继续前移至检测线处，胶体金标记的复合物再与膜上检测线的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体结合形成金标单抗-循环抗原-单抗夹心复合物而呈现红色的线条，多余的胶体金标记的抗体继续前移至质控线处与羊抗鼠IgG或IgM结合而呈现红色的线条，最后残余的液体被末端吸水垫吸收。阳性标本在检测线与质控线均有条带出现，而阴性则只有质控线一条条带，若无条带则说明试纸条已经失效。本发明还提供了一种抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株A1E3)，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2010 年3月3号保藏号为CGMCC而3642，该细胞株是由小鼠骨髓瘤细胞5 2/0与免疫脾细胞融合得到的杂交瘤细胞株。本发明还提供了一种抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞(细胞株D9G8)，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2011年6月21日，保藏号 CGMCC NO :4978.该细胞株是由小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞融合得到的杂交瘤细胞株。本发明与现有技术相比具有如下优点本发明的试剂盒操作简便、快速，检测急、 慢性血吸虫病病人血清，检出率高，适合医院检验科、疾病防控中心、社康中心等部门用于血吸虫病的临床诊断、疗效考核和流行病学调查，具有很高的实用价值。采用本发明的试剂盒检测血吸虫循环抗原的双抗体夹心法为一步法，敏感性高、特异性强、重复性好，分别适合批量标本的检测和疗效考核。
图1是本发明的一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的外观结构示意图，其中1为盒体；2为加样孔；3为观察孔。图2是本发明的一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的内部结构示意图，其中4为样品垫；5为金标垫；6为硝酸纤维膜检测层；7为检测线；8为质控线； 9为末端吸水垫，10为PVC垫板。图3是本发明的一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的阳性结果，样品液为急性血吸虫病人血清。图4是本发明的一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的阴性结果，样品液为正常人血清。
具体实施例方式实施例1抗血吸虫SEA单克隆抗体的制备方法如下(一 )动物免疫①抗原制备将每只感染1500条日本血吸虫尾蚴(来自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)的7只新西兰兔在42天后按常规方法解剖，从肝脏中分离收集虫卵并冻干。取干卵称重，按1 %的比例溶于0. 9 %的生理盐水中，研磨后，置4°C冷浸，期间每天振摇2次，每次2分钟。4天后冰浴超声粉碎，每次3分钟，间歇3分钟，共3次。再如上冷浸 2天，10000rpm4°C离心30分钟，取上清，收集分装，用Braford法测定抗原蛋白浓度，_20°C 保存备用。
②免疫动物的选择选用6 8w的雌性BALB/c小鼠(来自中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)。初次免疫将血吸虫可溶性抗原(SEA)与弗氏完全佐剂混合并乳化完全，按25 100 μ g/只剂量腹腔注射小鼠。4周后用相同剂量的SEA与弗氏不完全佐剂混合乳化进行加强免疫，以后每隔2周，再用SEA单独加强免疫2次，用ELISA法检测免疫效价，达到1/10000以上时，进行最后一次尾静脉加强免疫，三天后取脾脏融合。(二)细胞融合取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1 5 1 10比例在 PEG4000作用下进行融合，融合好后杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，Α)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，Τ)的培养基(HAT)中进行选择生长，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。(三)杂交瘤细胞筛选和克隆化杂交瘤细胞在融合后2周左右即用SEA进行筛选，挑选出针对SEA的杂交瘤细胞株进行克隆化，直到获得分泌稳定的针对SEA的单克隆细胞株。一种抗血吸虫可溶性抗原(SEA)的单克隆细胞株，其分类命名为小鼠杂交瘤细胞(日本血吸虫病单克隆抗体细胞株Α1Ε3和细胞株D9G8)，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2010年3月 3号和2011年6月7号，保藏号为3642和4978。(四)将上述的小鼠杂交瘤细胞(CGMCC3642和4978)分别注入BALB/c小鼠腹腔内，1 2周后小鼠腹腔产出大量的抗体，小心抽取腹水，离心得到大量针对SEA的单克隆抗体腹水上清，抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)单克隆抗体(Anti-SEA-IgG2b)由保藏号为CGMCC NO :4978的小鼠杂交瘤细胞株产生，抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)单克隆抗体(Anti-SEA-IgM)由保藏号为CGMCC NO :3642的小鼠杂交瘤细胞株产生。(五)所述的血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的单克隆抗体的纯化方法如下①饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8。②盐析吸取IOml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5. Oml ；继续缓慢搅拌30min ； 10000r/min离心15min ；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1 2次；沉淀物溶于1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 缓冲液中。③脱盐常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过kphadexG-50层析柱， 以PBS或Tri s-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速lml/min。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋lOmin，冷至室温即可使用(并可于0.2mol/L EDTA 溶液中，4°C保存备用)。将盐析样品装入透析袋中，对50 100倍体积的PBS或Tris-HCl 缓冲液透析) 12 M小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂(碘化汞11.5g，碘化钾 8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% Na0H50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。④蛋白质含量的测定(Pr)(mg/ml) = (1. 45 X OD280-O. 74 X OD260) X 稀释倍数；或 (Pr) =OD28tlX 稀释倍数/3⑤分装冻存备用。实施例2
如图1和图2所示，本发明提供了一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，包括一个盒体1，所述的盒体1中设置有一个垫板10，垫板10的上侧设置有一个样品垫4，垫板10上侧的另一端设置有一个末端吸水垫9，垫板10的中部设置有一个检测层 6，在样品垫4和检测层6之间设置有一个金标垫5，检测层6的一端设置在金标垫5的下侧，金标垫5的一端设置在样品垫4的下侧，检测层6上包被有检测线7和质控线8，盒体的正面设置有一个加样孔2和一个观察孔3，加样孔2设置在样品垫4的上方，观察孔3设置在检测线7和质控线8的上方，检测层6的另外一端设置在末端吸水垫9的下侧。进一步的，所述的检测层6为硝酸纤维素膜。进一步的，所述的垫板10材料为PVC。进一步的，所述的检测线7是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为0. 8 1. 5mg/ml的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b后，均勻地喷在检测层6中段制成。进一步的，所述的质控线8是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为2 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均勻地喷在检测层6上制成，所述的质控线8靠近所述的末端吸水垫9，距离检测线7为0. 5 1cm。进一步的，所述的金标垫5包括一个纤维膜，所述的纤维膜上喷设有标记好胶体金的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，喷液量为0. 8 2. 0 μ 1/cm。进一步的，所述的纤维膜为玻璃纤维膜。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO 4978的小鼠杂交瘤细胞产生。进一步的，所述的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO 3642的小鼠杂交瘤细胞产生。进一步的，所述的样品垫4和末端吸水垫9由吸水纸裁剪而成。实施例3本发明还提供了一种制备上述检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的方法，该方法包括一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤， 所述的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异单克隆抗体用于制备胶体金标记的单克隆抗体 (IgM)和检测单克隆抗体(IgG2b)，包括一个制备胶体金的步骤，包括制备一个胶体金标记抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤，包括一个制备金标垫5的步骤，当制备好的胶体金与待标记的单克隆抗体(IgM)成功结合后，用二维喷动仪将标记好胶体金的单克隆抗体均勻地喷在玻璃纤维膜上，包括一个制备硝酸纤维素膜检测层6中检测线7和质控线8 的步骤，将检测单克隆抗体(IgG2b)均勻地喷在硝酸纤维膜中段，得到检测线7 ；将羊抗鼠 IgG或IgM(sigma公司或其他公司购买)，均勻地喷在硝酸纤维膜上，距离检测线70. 5 Icm处得到质控线包括一个制备盒体和垫板的步骤，将垫板设置在所述的盒体中。进一步的，在一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤中，包括如下步骤，1) 一个动物免疫的步骤，在所述的动物免疫的步骤中，先制备日本血吸虫的可溶性抗原，然后通过日本血吸虫的可溶性抗原免疫动物，取得免疫脾细胞；2) —个细胞融合的步骤，取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1 5 1 10比例在PEG4000作用下进行融合；3) 一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤，得到保藏号为CGMCC NO :4978和3642的小鼠杂交瘤细胞株；4)将上述的单克隆细胞株分别注入动物体内产生一种胶体金标记用的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体和检测用的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤；5) 一个分别纯化上述的两种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤。进一步的，在所述的一个制备盒体和垫板10的步骤中，先准备一个垫板10，先将含有检测线7和质控线8的检测层6粘贴在垫板10上，然后在检测层6的一端先粘贴金标垫5，金标垫5上含有胶体金标记的抗血吸虫病循环抗原单克隆抗体，再在远离检测层6的金标垫的一侧粘贴样品垫4，所述的样品垫4、金标垫5和所述的检测层6紧密连接，在检测层6的另一端粘贴末端吸水垫9，检测层6和末端吸水垫9紧密相连，将垫板10设置在盒体中，在盒体的正面上设置加样孔和观察孔，所述的加样孔位于在样品垫4的上方，所述的观察孔位于检测线7和质控线8的上方。本发明的工作原理是当待测血清样品等液体标本滴加在样品垫4上时，液体即向质控线8处不断扩散，当液体到达金标垫5处时，抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体金标记物被溶解，同时与标本中的循环抗原反应而形成复合物，液体继续前移至检测线7处，金标记的复合物再与膜上检测线7的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体结合形成金标单抗-循环抗原-单抗夹心复合物而呈现红色的线条，多余的金标抗体继续前移至质控线8处与羊抗鼠IgG或IgM结合而呈现红色的线条，最后残余的液体被末端吸水垫9吸收。阳性标本在检测线7与质控线8均有条带出现，而阴性则只有质控线8 一条条带，若无条带则说明试纸条已经失效。(如图3、图4所示)实施例4试剂盒特异性、灵敏度检测①特异性检测用移液器吸取20 μ 1血清，滴加到样品垫上，置室温约10分钟，待质控线8出现颜色反应，即可观察结果。每种组合都检测相同的血清，共检测正常人血清20 份，急性病人血清20份，慢性病人血清40份，卫氏并殖吸虫吸虫病人血清5份，弓形虫病人血清5份，华支睾吸虫病人血清5份。囊虫病人血清5份。结果如表1，本检测试剂盒对日本血吸虫急性病人和慢性病人检测阳性率都为100%，对正常人的特异性也为100%。但与囊虫病人血清和卫氏并殖吸虫病人血清有少许交叉反应。表1胶体金免疫层析试纸条检测不同血清样品中血吸虫SEA抗原
权利要求
1.一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，包括一个盒体，其特征在于 所述的盒体中设置有一个垫板，所述的垫板的上侧的一端设置有一个样品垫，所述的垫板的上侧的另外一端设置有一个末端吸水垫，所述的垫板的中部设置有一个检测层，所述的检测层和所述的末端吸水垫紧密连接，在所述的样品垫和所述的检测层之间设置有一个金标垫，所述的金标垫上含有胶体金标记的抗血吸虫病循环抗原单克隆抗体，所述的样品垫、 金标垫和所述的检测层紧密连接，在所述的检测层上包被有检测线和质控线，所述的盒体的正面上设置有一个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品垫上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。
2.如权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的检测层的一端设置在所述的金标垫的下侧，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下侧。
3.如权利要求2所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的检测层的另一端设置在所述的末端吸水垫的下侧。
4.如权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的检测层为硝酸纤维素膜。
5.如权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的检测线是用质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为0. 8 1. 5mg/ ml的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b后，均勻地喷在检测层中段制成。
6.如权利要求5所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO :4978的小鼠杂交瘤细胞产生。
7.如权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的质控线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为2 2. 5mg/ml 的羊抗鼠IgG或IgM后，均勻地喷在检测层上制成，所述的质控线靠近所述的末端吸水垫， 距离检测线0. 5 1cm。
8.如权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的金标垫包括一个纤维膜，所述的纤维膜上喷设有标记好胶体金的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，喷液量为0. 8 2. 0 μ 1/cm。
9.如权利要求8所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的纤维膜为玻璃纤维膜。
10.如权利要求8所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于所述的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO 3642的小鼠杂交瘤细胞产生。
11.权利要求1所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法， 其特征在于包括一个采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤，所述的抗血吸虫可溶性虫卵抗原的特异单克隆抗体用于制备胶体金标记的单克隆抗体和检测单克隆抗体，包括一个制备胶体金的步骤，包括制备一个胶体金标记抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgM的步骤，包括一个制备金标垫的步骤，当制备好的胶体金与待标记的单克隆抗体成功结合后，用二维喷动仪将标记好胶体金的单克隆抗体均勻地喷在玻璃纤维膜上，包括一个制备检测层中检测线和质控线的步骤，将抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b均勻地喷在检测层中段，得到检测线，将羊抗鼠IgG或IgM，均勻地喷在检测层上， 距离检测线0. 5 Icm处得到质控线，包括一个制备盒体和垫板的步骤，将垫板设置在所述的盒体中，将检测层粘贴在垫板上，将垫板设置在所述的盒体中。
12.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于在所述的采用杂交瘤技术制备抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤中，包括如下步骤，1)一个动物免疫的步骤，在所述的动物免疫的步骤中，先制备血吸虫的可溶性抗原，然后通过血吸虫的可溶性抗原免疫动物，取得免疫脾细胞；2)—个细胞融合的步骤，取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1 5 1 10比例在 PEG4000作用下进行融合；3)一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤，得到保藏号为CGMCC NO 4978和3642的小鼠杂交瘤细胞株；4)一个将上述的单克隆细胞株分别注入动物体内产生抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgM和抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b的步骤；5)一个分别纯化上述的两种抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤。
13.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于在所述的一个制备盒体和垫板的步骤中，先准备一个垫板，先将含有检测线和质控线的检测层粘贴在垫板上，然后在检测层的一端先粘贴金标垫，金标垫上含有胶体金标记的抗血吸虫病循环抗原单克隆抗体，再在远离检测层的金标垫的一侧粘贴样品垫，所述的样品垫、金标垫和所述的检测层紧密连接，在检测层的另一端粘贴末端吸水垫， 检测层和末端吸水垫紧密相连，将垫板设置在盒体中，在盒体的正面上设置加样孔和观察孔，所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的观察孔位于检测线和质控线的上方。
14.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于所述的检测线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为 0. 8 1. 5mg/ml的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b后，均勻地喷在检测层中段制成。
15.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于所述的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO 4978的小鼠杂交瘤细胞产生。
16.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于所述的质控线是将质量百分比浓度为1 3%的甲醛固定液固定浓度为 2 2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG或IgM后，均勻地喷在检测层上制成，所述的质控线靠近所述的末端吸水垫，距离检测线0. 5 1cm。
17.如权利要求11所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于所述的金标垫包括一个纤维膜，所述的纤维膜上喷设有标记好胶体金的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，喷液量为0. 8 2. 0 μ 1/cm。
18.如权利要求17所述的检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于所述的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO :3642的小鼠杂交瘤细胞产生。
全文摘要
一种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒，包括一个盒体，盒体中设置有一个垫板，垫板的上侧的一端设置有一个样品垫，另外一端设置有一个末端吸水垫，垫板的中部设置有一个检测层，在样品垫和检测层之间设置有一个金标垫，在检测层上包被有检测线和质控线，在盒体的正面上设置有一个加样孔和一个观察孔。本发明还提供了上述的这种检测血吸虫病循环抗原的胶体金免疫层析试剂盒的制备方法。本发明的试剂盒操作简便快速、敏感性高、特异性强、重复性好、结果直观、无需专门设备、不受环境条件的干扰，具有很高的实用价值。
文档编号G01N33/577GK102393461SQ20111029459
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者周洋, 张玲玲, 田利光, 艾琳, 蔡玉春, 郭俭, 陈家旭, 陈木新, 陈韶红 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所