TMEM88用于评估肺癌低分化、高p-TNM分期及不良预后的方法

文档序号:6020651阅读:318来源:国知局
专利名称:TMEM88用于评估肺癌低分化、高p-TNM分期及不良预后的方法
技术领域
本发明属于肺癌生物学行为标记物与诊断技术领域,尤其涉及TMEM88用于评估肺癌低分化、高P-TW分期及不良预后的方法及在肺癌低分化、高P-TW分期及不良后的标记方面的应用。
背景技术
在过去的30年里我国肺癌的发生率上升了 450%,与其他国家一样其死亡率已经居恶性肿瘤之首,其中80%死于侵袭和转移。然而,由于肺癌病理类型多样、组织
分型复杂,给临床治疗和预后评估带来巨大困难。新的肺癌生物学行为标记物的发现和应用。不仅为肺癌患者的治疗和评估预后带来益处,也可为开发新的靶向治疗药物提供依据。 因此,寻找并确立新的肺癌分子生物学标记,具有重要的理论和现实意义。近年来Wnt信号通路与肿瘤增殖、侵袭和转移的关系备受重视。Wnt信号通路主要由 Wnt 分子、Dishevelled(Dvl/Dsh)、Axin、GSK3 β、β-catenin 和组成。Lee 等人在研究Dvl功能结构域时发现了 ΤΜΕΜ88 (transmembrane 88)分子,其C端含有V_W_V (Val-Trp-Val)序列,可以与Dvl的PDZ结构域发生结合。目前关于TMEM88的研究局限于胚胎发育领域,而在人类肿瘤中是否存在TMEM88 的表达,其阳性表达有何临床意义以及在肿瘤中TMEM88是如何发挥其生物学作用的尚没有任何相关的报道。

发明内容
发明目的本发明提供一种TMEM88用于评估肺癌低分化、高ρ- Μ分期及不良预后的方法及其应用,其目的是解决目前对非小细胞肺癌的生物学诊断缺少合适的生物学标记物的问题。技术方案本发明是通过以下技术方案来实现的
ΤΜΕΜ88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于该方法的步骤如下
通过免疫组化和免疫印迹方法检测切除的肺癌患者新鲜肿物及癌旁正常肺组织标本、 术后石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织病理标本和培养多种肺癌细胞系中ΤΜΕΜ88的水平,并对染色结果进行评估,即免疫组化的染色评估。病理标本来自于肺癌患者活检取材及术中、术后病理取材。免疫组化检测采用S—P法进行染色;抗原修复1分40秒,一抗使用多克隆兔源性的 ΤΜΕΜ88 抗体一1 :100, Santa Cruze biotechnology,4°C孵育过夜,以正常兔 IgG-I 100,Santa Cruze biotechnology,作为阴性对照;生物素标记的二抗37°C孵育30分钟, DAB显色。免疫组化的染色评估方法如下在所有标本的每张切片随机选择5个视野,每个视野计数100个细胞;根据计数细胞着色的百分比,TMEM88的表达被划分成五个等级0分为无着色,1分为1_25%,2分为沈-50%,3分为51-75%,4分为76%以上;再根据细胞着色的强度,TMEM88的表达又被划分成3个等级0分为无着色,1分为浅黄色颗粒,2分为深黄色或者黄褐色颗粒,3分为深褐色颗粒;每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数, 将二者相乘,所得的乘积即为该切片的最终得分。免疫印迹检测方法如下用RIPA裂解液对组织或细胞进行充分裂解,分别提取切除的新鲜肺癌组织、癌旁正常肺组织和培养的肺癌细胞系的总蛋白,采用紫外分光光度计法定量,上样量为80微克,通过1 浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳1小时,一抗TMEM88—1 100,Santa Cruze biotechnology, β -Actin—1 :500, Santa Cruze biotechnology, 4° C 过夜;山羊抗兔二抗一 1:5000,JAKS0N,37°C孵育 2 小时;ECL 发光后,Bio-Image system— EpiChemi III Darkroom, UVP,进行条带灰度值测定,以TMEM88/β -Actin的比值作为相对表达量,实验重复三次取均值。ΤΜΕΜ88大于或者等于4分的定义为阳性表达,提示肺癌的低分化,高Ρ- Μ分期及不良预后。免疫印迹结果ΤΜΕΜ88/ β -actin,P<0. 05为高表达。TMEM88做为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌及肝癌低分化、高ρ- Μ分期及不良后的标记的应用。ΤΜΕΜ88做为上皮性恶性肿瘤及非小细胞肺癌的治疗靶点的应用。优点及效果
本发明提供了一种ΤΜΕΜ88用于评估肺癌低分化、高ρ- Μ分期及不良预后的方法,该方法通过免疫组化和免疫印迹方法检测切除的肺癌患者新鲜肿物及癌旁正常肺组织标本、 术后石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织病理标本和培养多种肺癌细胞系中ΤΜΕΜ88的水平,并对染色结果进行评估。我们首次采用免疫印记的方法对20例配对的新鲜肺癌组织和8种肺癌细胞系进行了检测,在证实了 ΤΜΕΜ88在肺癌组织和肺癌细胞系中的高表达是一个普遍的现象基础上,采用免疫组织化学的方法对138例非小细胞肺癌ΤΜΕΜ88的表达及意义进行了分析,同时为了证明ΤΜΕΜ88在恶性上皮性肿瘤中高表达的普遍性,我们又分别在乳腺癌、结肠癌、 胃癌、肝癌等常见恶性上皮性肿瘤中进行了验证。免疫组化结果显示ΤΜΕΜ88不仅在肺癌中高表达在其他上皮性恶性肿瘤中也同样存在着高表达现象。同时我们发现ΤΜΕΜ88蛋白在非小细胞肺癌中的阳性(高)表达与肺癌的低分化、高 ρ- Μ分期、淋巴结转移和不良预后明显相关,是反映非小细胞肺癌生物学行为的有用的标记物。ΤΜΕΜ88蛋白在非小细胞肺癌组织和多种肺癌细胞系中存在高表达,在包括乳腺癌、结肠癌、胃癌及肝癌等常见恶性上皮性肿瘤中也普遍存在着高表达现象;ΤΜΕΜ88蛋白在非小细胞肺癌中的阳性(高)表达与肺癌的低分化、高ρ- μ分期、淋巴结转移和不良预后明显相关,提供了一种新的非小细胞肺癌分子生物学标记,是一种简便易行的检测手段及科学的评估方法。本发明很好的解决了以往的生物学标记在临床治疗和预后评估方面效果不理想的问题。


图1-1为20对肺癌及相应癌旁正常肺组织中TMEM88免疫印迹结果对比图; 图1-2为肺癌细胞系LTE和正常支气管上皮细胞系HBE中TMEM88免疫荧光定位图; 图1-3为肺癌细胞系H157、BE1、LH7、LK、SPC、LTE、H460、A549和正常支气管上皮细胞系HBE中TMEM88免疫印迹结果对比图2-1为肺鳞状细胞癌、肺腺癌和癌旁正常支气管上皮中TMEM88免疫组化结果对比
图2-2为不同分化程度肺鳞状细胞癌中TMEM88免疫组化结果对比图; 图2-3为不同分化程度肺腺癌中TMEM88免疫组化结果对比图; 图3为Kaplan-Meier方法比较TMEM88表达阳性与阴性术后生存分析对比图; 图4为乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和相对应的癌旁正常组织中TMEM88免疫组化结果对比图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步的描述
TMEM88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于该方法的步骤如下
通过免疫组化和免疫印迹方法检测切除的肺癌患者新鲜肿物及癌旁正常肺组织标本、 术后石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织病理标本和培养多种肺癌细胞系中TMEM88的水平,并对染色结果进行评估。病理标本来自于肺癌患者活检取材及术中、术后病理取材。免疫组化检测采用S—P法进行染色;抗原修复1分40秒,一抗使用多克隆兔源性的 TMEM88 抗体一1 :100, Santa Cruze biotechnology,4°C孵育过夜,以正常兔 IgG-I 100,Santa Cruze biotechnology,作为阴性对照;生物素标记的二抗37°C孵育30分钟, DAB显色。标本的每张切片随机选择5个视野,每个视野计数100个细胞;根据计数细胞着色的百分比,TMEM88的表达被划分成五个等级0分为无着色,1分为1-25%,2分为26_50%, 3分为51-75%,4分为76%以上;再根据细胞着色的强度,TMEM88的表达又被划分成3个等级0分为无着色,1分为浅黄色颗粒,2分为深黄色或者黄褐色颗粒,3分为深褐色颗粒;每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数,将二者相乘,所得的乘积即为该切片的最终得分。用RIPA裂解液对组织或细胞进行充分裂解,分别提取切除的新鲜肺癌组织、癌旁正常肺组织和培养的肺癌细胞系(AM9、BE1、LH7、LK、SPC、LTE、H460、H157,包括正常HBE细胞系)的总蛋白,采用紫外分光光度计法定量,上样量为80微克,通过1 浓度的SDS-PAGE 进行蛋白电泳 1 小时,一抗 TMEM88— 1 :100, Santa Cruze biotechnology, β-Actin — 1 500, Santa Cruze biotechnology,4° C 过夜;山羊抗兔二抗一 1 5000,JAKS0N,37°C孵育 2 小时;ECL 发光后,Bio-Image system—EpiChemi III Darkroom, UVP,进行条带灰度值测定, 以TMEM88/ β -Actin的比值作为相对表达量,实验重复三次取均值。ΤΜΕΜ88大于或者等于4分的定义为阳性表达,提示肺癌的低分化,高ρ- Μ分期及不良预后。免疫印迹结果ΤΜΕΜ88/ β -actin,P<0. 05为高表达。TMEM88做为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌及肝癌低分化、高ρ- Μ分期及不良后的标记的应用。
TMEM88做为上皮性恶性肿瘤及非小细胞肺癌的治疗靶点的应用。本发明患者信息和样本
138例非小细胞肺癌(另选68例癌旁正常肺组织)、四例乳腺导管浸润癌(另选15例癌旁正常乳腺组织)、35例结肠癌(另选观例癌旁正常结肠组织)、沈例肝癌(另选11例癌旁正常肝组织)及M例胃癌(另选20例癌旁正常胃组织)标本均来自中国医科大学附属第一临床医院病理科存档蜡块。术前均未接受化疗或放射治疗。其中肺癌患者的平均年龄是60 岁,根据WH02003肺癌组织学分类标准,腺癌81例,鳞癌55例,大细胞癌2例。根据2010年
国际抗癌联盟P-TNM分期标准,1
期47例,II期26例,111期61例,IY期4例。138例肺癌病例中,有61例具有完整的随访
资料。随访从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。另收集20例新鲜的肺癌组织及相对应的周围正常的肺组织标本,保存在_70°C冰箱内,用于提取蛋白质和免疫印记检测。培养8种肺癌细胞系和HBE正常支气管上皮细胞系,用于提取蛋白和免疫印迹检测。免疫组织化学
所有的组织均经中性甲醛固定,石蜡包埋后,制成4微米厚度的切片。采用S— P免疫组化法进行染色。一抗使用多克隆兔源性的TMEM88抗体(1 :100,Santa Cruze biotechnology,)4 度孵育过夜。以正常兔 IgG (1 100, Santa Cruze biotechnology,)代替一抗作为阴性对照。生物素标记的二抗(购于福州迈新公司》7°C孵育30分钟,DAB显色。
免疫组化阳性判定标准
每张切片随机选择5个视野,每个视野计数100个细胞。根据计数细胞着色的百分比,TMEM88的表达被划分成五个等级0分(无着色),1分(1-25%),2分(26-50%),3分 (51-75%),4分(76%以上)。再根据细胞着色的强度,TMEM88的表达又被划分成3个等级0 分(无着色),1分(浅黄色颗粒),2分(深黄色或者黄褐色颗粒),3分(深褐色颗粒)。每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数,将二者相乘,所得的乘积即为该切片的最终得分。由于目前尚没有关于TMEM88免疫组化阳性判定标准,我们根据68例癌旁正常的肺组织中支气管和肺泡上皮染色后,按我们设定的评分标准进行判定,其得分均小于4分。 据此,我们将大于或者等于4分的定义为阳性表达,而小于4分者定义为阴性表达
免疫荧光
细胞接种在24孔板内,后4%多聚甲醛固定,5%BSA(Sigma)封闭,一抗TMEM88( 1:50, Santa Cruze) 4° 过夜。山羊抗兔荧光二抗(1 5000,JAKS0N)孵育 1 小时,DAPI (Sigma) 染色10分钟后,Olympus BX51荧光显微镜下检测。采用RIPA裂解液对组织或细胞进行充分裂解,然后分别提取其总蛋白,取100微克的总蛋白通过10%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳,然后转印到PVDF膜上。1%脱脂奶粉封闭 2 小时,一抗 TMEM88 (1 100,Santa Cruze),, β -Actin (1 500,Santa Cruze) 4° C 过夜。山羊抗兔二抗(1:5000,JAKS0N)37°C孵育2小时。ECL发光后,Bio-Image system (EpiChemi III Darkroom, UVP)进行条带灰度值测定,以TMEM88/ β -Actin的比值作为相对表达量。实验重复三次取均值。细胞培养
HBE、LTE、H157、LK、SPC、H460、和A549细胞从上海中国科学院细胞库获得,BEl和LH7 由北京大学医学部赠与,细胞系均用含有10%胎牛血清(Gibco,hvitrogen)和100U/mL青链霉素(Sigma)的1640培养基(Hyclone,Thermo)培养,并将其置于5%浓度的CO2细胞培养箱中培养。统计学分析
所有的数据采用SPSS13. 0版本进行统计学分析。采用Chis-Square检验TMEM88表达与临床病理因素之间的关联。采用t检验检测Western Blot结果中的灰度值。采用 Kaplan-Meier法检测TMEM88对患者生存时间的影响。Cox回归模型用以研究不同的变量对患者生存的影响。P <0.05作为有统计学意义。本发明采用免疫组织化学方法在非小细胞肺癌和其他上皮性恶性肿瘤及他们相对应的癌旁正常组织中检测TMEM88蛋白的表达及定位情况。采用Wfestern Blot方法检测TMEM88蛋白在非小细胞肺癌及配对的癌旁正常肺组织和多种肺癌细胞系中的表达情况。采用免疫荧光方法检测TMEM88在多种肺癌细胞系中的定位情况。统计学分析,采用Chis-Square检验分析TMEM88蛋白表达与临床病理因素之间的关联,采用Kaplan-Meier法检测TMEM88蛋白表达对患者生存时间的影响,采用Cox回归模型用以研究不同的变量对患者生存的影响。在非小细胞肺癌中的检测
(1)TMEM88蛋白在肺癌组织中的表达上调是一个普遍现象
我们从20对肺癌及癌旁正常的肺组织中提取的总蛋白,经Western Blot检测结果发现,其中有18例肺癌组织中的TMEM88蛋白表达量(光密度值为0. 865士0. 162)明显高于相应的癌旁正常肺组织(0. 294士0. 256)P=O. 000,见图1-1,图1-1中20例配对的组织中(N 为癌旁正常肺组织,T为肿瘤组织)有18例肺癌组织中TMEM88的蛋白表达明显高于相应的癌旁正常肺组织
表明TMEM88在肺癌组织中的高表达是一个较为普遍的现象。
蛋白在多种肺癌细胞系中的表达上调是一个普遍现象
接着我们在8种肺癌细胞系和1种正常支气管上皮细胞系中做了进一步的验证。免疫荧光结果发现TMEM88表达的阳性信号均定位于细胞胞浆中,见图1-2,图1-2中免疫荧光结果表明TMEM88蛋白表达于肺癌细胞的LTE胞浆中,虽然正常支气管上皮细胞系(HBE) 的胞浆中也有一定的TMEM88的表达,但明显弱于肺癌细胞系。免疫印迹结果证实除了 H460 和LK肺癌细胞系外,有6种肺癌细胞系(H157, BEl, LH7, SPC, LTE, AM9)均有TMEM88的高表达,尽管TMEM88在正常的支气管上皮细胞系HBE中也有阳性表达,但在这6种阳性表达的肺癌细胞系中其TMEM88的表达量均高于正常支气管上皮细胞HBE的表达量,见图1_3,图 1-3中免疫印记结果表明,8种肺癌细胞系中有6种存在TMEM88的蛋白表达且其表达量高于正常支气管上皮细胞系 HBE。ΡΗ157_ΗΒΕ=0·014,ΡΒΕ1_ΗΒΕ=0·034,PLH7_HBE=0. 031,Pspc_hbe=0. 002 ,Plte-hbe=0. 006PA549_hbe=0. 023。结果表明TMEM88蛋白在肺癌细胞系中的高表达也是一个较为普遍的现象。
(3) TMEM88蛋白的表达上调与肺癌的临床病理因素和不良预后相关
与肺癌细胞系一样,免疫组化结果显示TMEM88蛋白在肺癌组织中表达的阳性信号同样定位在癌细胞的细胞浆中,见图2-1,图2-1中TMEN88蛋白阳性信号定位肺鳞癌(B)和腺癌(C)细胞的胞浆中,呈黄褐色颗粒状,而在正常支气管上皮细胞中为阴性(A)。按评分标准,在68例癌旁正常肺组织中有59例小于或者等于4分,为阴性表达,只有9例的评分大于4为阳性表达,其阳性表达率仅为13. 2% (9/68)。而在138例肺癌组织中,有80例得分大于4分,其阳性表达率为57,9% (80/138),明显高于癌旁正常肺组织,P=O. 000。见表 1A。表IA TMEM88的蛋白在肺癌中的表达
权利要求
1.TMEM88用于评估肺癌低分化,高Ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于该方法的步骤如下通过免疫组化和免疫印迹方法检测切除的肺癌患者新鲜肿物及癌旁正常肺组织标本、 术后石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织病理标本和培养多种肺癌细胞系中TMEM88的水平,并对染色结果进行评估,即免疫组化的染色评估。
2.根据权利要求1所述的TMEM88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于病理标本来自于肺癌患者活检取材及术中、术后病理取材。
3.根据权利要求1所述的ΤΜΕΜ88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于免疫组化检测采用S—P法进行染色;抗原修复1分40秒,一抗使用多克隆兔源性的ΤΜΕΜ88抗体一 1 :100, Santa Cruze biotechnology,4°C孵育过夜,以正常兔 IgG-I :100, Santa Cruze biotechnology,作为阴性对照;生物素标记的二抗37°C孵育30 分钟,DAB显色。
4.根据权利要求1所述的TMEM88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于免疫组化的染色评估方法如下在所有标本的每张切片随机选择5个视野,每个视野计数100个细胞;根据计数细胞着色的百分比,ΤΜΕΜ88的表达被划分成五个等级0分为无着色,1分为1_25%,2分为沈-50%,3分为51_75%,4分为76%以上;再根据细胞着色的强度,ΤΜΕΜ88的表达又被划分成3个等级0分为无着色,1分为浅黄色颗粒,2分为深黄色或者黄褐色颗粒,3分为深褐色颗粒;每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数,将二者相乘,所得的乘积即为该切片的最终得分。
5.根据权利要求1所述的ΤΜΕΜ88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于免疫印迹检测方法如下用RIPA裂解液对组织或细胞进行充分裂解,分别提取切除的新鲜肺癌组织、癌旁正常肺组织和培养的肺癌细胞系的总蛋白,采用紫外分光光度计法定量,上样量为80微克,通过1 浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳1小时,一抗 TMEM88—1:100, Santa Cruze biotechnology, β -Actin—1:500, Santa Cruze biotechnology, 4° C 过夜;山羊抗兔二抗一 1:5000,JAKS0N,37 °C 孵育 2 小时;ECL 发光后,Bio-Image system—EpiChemi III Darkroom, UVP,进行条带灰度值测定,以 TMEM88/ β -Actin的比值作为相对表达量,实验重复三次取均值。
6.根据权利要求4所述的ΤΜΕΜ88用于评估肺癌低分化,高ρ- Μ分期及不良预后的方法,其特征在于ΤΜΕΜ88大于或者等于4分的定义为阳性表达,提示肺癌的低分化,高ρ- Μ 分期及不良预后;免疫印迹结果ΤΜΕΜ88/β -actin,P<0. 05为高表达。
7.TMEM88做为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌及肝癌低分化、高ρ- Μ分期及不良后的标记的应用。
8.TMEM88做为上皮性恶性肿瘤及非小细胞肺癌的治疗靶点的应用。
全文摘要
本发明提供一种TMEM88用于评估肺癌低分化,高p-TNM分期及不良预后的方法,其特征在于该方法的步骤如下通过免疫组化和免疫印迹方法检测切除的肺癌患者新鲜肿物及癌旁正常肺组织标本、术后石蜡包埋的肺癌及癌旁正常肺组织病理标本和培养多种肺癌细胞系中TMEM88的水平,并对染色结果进行评估,即免疫组化的染色评估。本发明很好的解决了以往的生物学标记在临床治疗和预后评估方面效果不理想的问题。
文档编号G01N33/68GK102364343SQ20111032153
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者张秀鹏, 王恩华 申请人:中国医科大学
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