专利名称：一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
随着肝癌外科的成熟和发展，肝癌的治疗方法和手段日渐丰富，而不再局限于单一的手术治疗。肝切除术和肝移植仍然是肝癌患者治疗的主要方法，但微创治疗、经皮肝动脉化疗栓塞等技术方法，作为手术治疗的重要补充，也得到了较广泛的应用，它们在为患者创造手术治疗机会、降低或减少肿瘤的复发和转移等方面都起到了一定的作用，延长了患者的生存时间。虽然如此，肝癌患者发病隐匿、无明显症状、多数患者就诊时已失去手术根治的机会。因此，“早期发现、早期诊断、早期治疗”是降低癌症死亡率的重要措施。筛选和建立用于癌症早期诊断的、高敏感、高特异的血清学诊断技术，提供癌症早期预警普查，具有重大意义和巨大市场前景。目前国内外广泛采用检测血清中甲胎蛋白(AFP)来确诊肝癌(HCC)，尽管这种方法提高了 HCC的检测水平，但仍有显著数量患者的甲胎蛋白并未升高，尤其对肿瘤直径小于3CM的小肝癌患者，其敏感性及特异性更低。近年来，标志物联检在肿瘤诊断中的应用的研究得到很大的重视。如通过联检甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、血清铁蛋白(SF)、 α-L-岩藻糖苷酶(AFU)可显著提高肝癌诊断的阳性率。AFP、CEA、SF、CA等四标志物联检原发肝癌的实验也获得不错的结果。但由于诊断特异性或成本效益方面的原因，很难在肝癌普查中广泛应用。血清中丰富的多肽资源在目前重大疾病诊断中扮演重要的角色。采用目前常规的临床手段进行多肽检测逐渐引起学术界和医药界的高度重视，基于多肽的肿瘤诊断技术正开始向临床应用高速发展，肿瘤的早期预警技术也在开发之中，一些多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的预警提供革新性的突破。血清中多肽同血清中蛋白不同，其分子量低于lOOOODa，结构简单，变化多样。是否能够采用目前常规的临床手段进行检测仍在探索。目前，检测血清中多肽进行临床诊断还没有先例。血清多肽能否用于诊断或早期诊断肝癌可以从三个方面来判断。1、血清多肽是血清蛋白的降解产物或基因直接编码产物。当生理状态发生变化时尤其向肿瘤转化时，蛋白的代谢发生变化，导致多肽相应变化， 从而建立了多肽----疾病的相关关系，因此，多肽可以像蛋白一样进行疾病诊断。2、实践上已经有一些疾病的诊断采用多肽标志物，1985年以来，利用合成多肽检测艾滋病病毒 (PM)、风疹病毒、人巨细胞病毒及类风湿等已应用到临床。3、文献表明，多肽可以用于临床诊断，如，Clinical Chemistry 51 10,1933-1945(2005)和 Clinical Chemitry 53:61， 067-1074(2007)认为血清多肽标志物能更精确的区分蛋白标志物不能区分的肿瘤。Nat Methods. 2008 Jan ；5(1) :57_9认为质谱诊断肿瘤甚至比MRI还好。质谱技术给生命科学带来的促进作用举世公认，近十年来，质谱在新生二筛查、基因突变检测方面取得一系列重要进展，并出现了单核苷酸多态性(SNP)分析专业质谱仪器，显示了质谱在临床诊断方面
3的价值。基于血清多肽抗原的肿瘤早期诊断试剂盒是当前最受关注的肿瘤早期诊断技术之一。目前临床领域中单一标志物始终存在着特异性不强、阳性率较低等不足，特别是对早期肿瘤的检测率不高，多标志联合检测事在必行，但苦于没有一个很好的手段实现同时检测。2006年Jos印Villanueva等人对32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌血清多肽研究，发现14个、10个和58个可分别作为前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志多肽， 预测准确率为100%。血清中存在的丰富的多肽为肿瘤预警和早期诊断提供了丰富的标志物资源，这些多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的预警提供革新性突破。经研究发现，序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽是癌症重要血清多肽标志物之一。近几年兴起的血清多肽组学已成功应用于几种癌的诊断研究，如乳腺癌，卵巢癌， 前列腺癌等，主要采用的是表面增强激光解吸离子化(SELDI)技术和免疫磁珠技术，但该体系存在价格昂贵，不利推广的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒，其含有保藏编号为CGMCC No. 5269的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105分泌的单克隆抗体以及和待测样品中的多肽标志物竞争的多肽标准品，所述多肽的序列为Asn-Le u-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。本其中，所述杂交瘤细胞株是以多肽标志物抗原(序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽，命名为多肽 5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，已于2011年9月 27号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3 号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。其中，所述的单克隆抗体为酶标单克隆抗体，优选的，所述标记的酶可为辣根过氧化物酶。本发明的肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒还可进一步含有包被液、5%脱脂奶粉、TMB显色液、2M硫酸和96孔酶联板。本发明提供的检测肝癌多肽标志物抗原检测方法，包括步骤(1)采集样品；(2)用所述的试剂盒进行检测；(3)分析检测结果优选地，所述方法具体包括如下步骤1)取1-1. 5 μ g/mL多肽标准品溶液100 μ L (包被液溶解)，置于96孔板中，4°C放置过夜或37°C放置2小时；2)弃包被液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干;
3)加入200-300 μ L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭1-2小时；4)弃封闭液，用0. 01M、pH7. 4 PBST缓冲液200-300 μ L清洗5-7次，拍干;5)待测样品与0. 3 μ g/mL的HRP标记多肽抗体以体积比1 1在板外37°C结合 0. 5-1小时；同时以PBS代替待测样品作为阴性对照；6)加入80-120 μ L 5)中结合溶液，37°C静置0. 5-1小时；7)弃 6)中溶液，用 0. 01M、pH7. 4 PBST 缓冲液 200-300 μ L 清洗 5-7 次，拍干；8)加入80-120 μ LTMB显色液，37°C避光孵育15min显色；9)加入30-70 μ L 2M硫酸，终止反应；10)用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值(0D值)。本发明所提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多肽标志物抗原的检测方法的操作步骤简便快捷，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。本发明将多肽抗体与ELSIA技术联合，可以同时检测多个生物标志群，并可用于大规模的样本检测，是验证血清标志物和应用于临床检测的理想工具。
图1为本发明的检测肝癌与正常血清的ROC曲线图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法1)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；其全长序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后检测尾血滴度，达到1 1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合；3)通过ELISA方法进行筛选，用有限稀释法对分泌抗体阳性的杂交瘤细胞进行克隆纯化；4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，意外地发现其中一株敏感性较高(lng/well)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(1 200000)、滴度 (0.0005 μ g/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株，并于2011年9月27 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。实施例2多肽标志物抗原的竞争性酶联免疫检测试剂盒的组装1) 1. 25 μ g/ml辣根过氧化物酶标记的实施例1的抗多肽5的特异性单克隆抗体；2)多肽标准品溶液1 μ g/ml合成肽5的包被溶液；3)包被液0. IM pH9. 6的碳酸盐缓冲液；4) 5%脱脂奶粉5g/100ml脱脂奶粉；5) TMB显色液购自北京康为世纪生物科技公司；6) 2M 硫酸；7)96孔酶联板。
实施例3多肽标志物抗原的竞争性酶联免疫检测方法样本临床确诊的肝癌血清、正常血清各60份。检测过程1)取1 μ g/mL多肽标准品溶液100 μ L (包被液溶解)，置于96孔板中，4°C放置过夜；2)弃包被液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；3)加入200 μ L 5%的脱脂奶粉，37°C静置封闭1. 5小时；4)弃封闭液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；5)待测样品与0. 3 μ g/mL的HRP标记多肽抗体以体积比1 1在板外37°C结合 1小时；同时以PBS代替待测样品作为阴性对照；6)加入100 μ L 5)中结合溶液，37°C静置1小时；7)弃6)中溶液，用0. 01M、ρΗ7· 4 PBST缓冲液200 μ L清洗6次，拍干；8)加入100 μ LTMB显色液，37°C避光孵育15min显色；9)加入50 μ L 2Μ硫酸，终止反应；10)用酶联检测仪测定波长450nm的光吸收值(0D值)。结果经统计，如图1的ROC曲线显示，肝癌血清与正常血清两组诊断阳性标准为OD 值< =0. 967，敏感度达到94. 3%，特异度达到95. 1 %，说明用本发明提供的试剂盒进行酶联免疫检测，特异性很强、重复性好。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，含有保藏编号为CGMCC No. 5269的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株APO105分泌的单克隆抗体以及和待测样品中的多肽标志物竞争的多肽标准品，所述多肽的序列为Asn-Le u-Gly-His-Gly-His_Lys_His-Glu—Arg—Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Glnο
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体为酶标单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1 3任一项所述的检测试剂盒，其还含有包被液、5%脱脂奶粉、TMB 显色液、2M硫酸和96孔酶联板。
全文摘要
本发明公开了一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒，其含有保藏编号为CGMCC No.5269的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105分泌的单克隆抗体以及和待测样品中的多肽标志物竞争的多肽标准品，所述多肽的序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。本发明所提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多肽标志物抗原的检测方法的操作步骤简便快捷，利于临床检测；可进行高通量、低成本的酶联检测仪检测。
文档编号G01N33/577GK102520175SQ20111035948
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者付海媛, 侯利平, 原剑, 周晓明, 孙云波, 张拓, 杨保安, 王东茂, 甄蓓, 肖汉族, 郑俊杰, 魏开华, 黄亚娟 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司