专利名称：筛选和/或分析目标配体的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析方法，具体而言，本发明涉及一种筛选和/或分析目标配体的方法。
背景技术：
高通量筛选(High throughput screening,HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点(也称为靶蛋白)的结合作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。举例而言，以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是使用放射性或者比色、荧光的方法来直接检测酶活性，从而评价各种待测试的化合物分子对酶活性的影响(抑制或增强)。多数情况下，筛选靶标酶的小分子抑制剂是为发现药物前体分子而广泛采用的途径。但是高通量筛选方法也具有以下缺点:I)根据靶蛋白的功能发展一套特定的HTS方法，往往是费时费力的过程。通常需要对测定该蛋白的酶活性的常规生化方法进行很多的改变和优化才能达到建立HTS方法的要求。而且，一旦改换待研究的靶蛋白，就需要重新设计一套HTS方法。2) HTS筛选体系会产生一定的假阳性结果。例如蛋白质的非特异性聚合、降解会导致其自身活性的改变，产生假阳性的筛选结果。有研究报道，常规HTS技术所得到的候选分子其中60-80%能够被其他独立的技术所确认，剩余的20-40%的结果无法被重复；对于形式较复杂的HTS筛选体系，只有25%的结果可以被其他技术所重现和确认。3)HTS技术通常筛选的对象是纯化的化合物单体。如果带测试的对象为混合物(例如天然产物粗分得到的不同组分)，则给出的数据代表的是多组分共同干扰酶活性的整体结果，单由这一结果无法得知是混合物中的何种成分真正起到作用。蛋白质复合物晶体结构解析是在原子层面上获得关于蛋白质复合物的三维结构信息的技术手段。通常需要得到蛋白质复合物的晶体，而后使用X射线衍射技术解析其三维结构。一旦该方法成功得应用于待研究的靶蛋白和药物分子，便能够详细得了解药物分子与靶标蛋白结合作用的分子机制。对于待筛选的化合物分子，可将它与靶蛋白的晶体浸泡之后形成共晶(即复合物的晶体)，而后解析该复合物的三维结构，准确得了解配体分子的结合位点和结合的空间模式。但是蛋白质复合物晶体结构解析方法具有以下缺点:I)整个实验流程周期长，成本高。对于靶蛋白及其复合物，摸索合适的结晶条件往往需要几个月甚至几年的努力，消耗大量的人力物力；在许多情况下，无论如何优化实验条件都难以得到需要的蛋白质晶体。2)通常情况下，这一技术仅用于分析与单一的配体(同靶蛋白结合的任何分子都称为配体)有结合作用的蛋白质，要求配体分子达到很高的纯度。因此，对于筛选由天然产物/中药提取出的组成复杂的混合物，必须进行多步纯化得到近乎单一的组分，才能使用该方法逐一得研究特定的小分子化合物和靶蛋白的结合作用。因此，需要发展一种普适性高，能够排除HTS的假阳性结果，以及能够适用于含有多种小分子化合物的混合物(例如天然产物提取物的初级分离产物)的分析配体和靶蛋白之间的结合作用的方法。
发明内容
为了解决现有问题，本发明提供了一种普适性高，能够排除HTS的假阳性结果，以及能够适用于含有多种小分子化合物的混合物的分析配体和靶蛋白之间的结合作用的方法。根据本发明的一个方面，本发明提供的分析方法包括以下步骤:I)对靶蛋白进行纯化由于通过生物工程技术制备的靶蛋白的溶液不适用于直接的质谱分析，我们首先需要对该蛋白质溶液进行缓冲液的置换，去除其中所含的对质谱分析有严重干扰性的盐类小分子。该步骤可以使用离心式浓缩管、微透析或者微型色谱柱来实现。优选的靶蛋白是特定病毒合成的蛋白酶(例如HIV蛋白酶和SARS冠状病毒主蛋白酶)或核酸内切酶，该蛋白靶标对病毒的繁殖和侵袭宿主具有关键作用。2)利用高通量酶活性测试系统筛选出对靶蛋白的活性具有抑制效果的候选抑制剂抑制剂是指能够结合特定的蛋白质并抑制其活性的物质。利用高通量酶活性测试系统(HTS)，我们能够快速的筛选对某种靶蛋白的活性有特异性抑制效果的化合物分子或者天然产物的提取组分。这些由HTS筛选出的候选抑制剂(可以是单一成分或者是多组分的混合物)，将被用于下一步的生物质谱分析以便确认它们是否为真正结合靶蛋白的配体，配体为与靶蛋白结合的任何分子。其中天然产物(例如生药)的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对天然产物的提取物进行适当的分离。本发明选择制备型HPLC获取天然产物的逐级分离的提取物。对于下游的质谱分析，该提取物可以是十几种或几十种单体组成的混合物，如此可以显著降低对天然产物组分分离的成本投入。利用高通量酶活性测试系统(HTS)，能够快速地筛选对某种靶蛋白的活性具有特异性抑制效果的天然产物的提取组分。3)制备靶蛋白-配体复合物将候选抑制剂与靶蛋白浸泡，使用溶解蛋白质的缓冲液稀释候选抑制剂的储液，使得蛋白质与抑制剂分子的终浓度配比在1: 5 1: 10(摩尔比)范围内。二者通常在室温条件下浸泡10-15分钟，形成可能的靶蛋白-配体复合物。由天然产物中提取出的提取物组分，其水溶性和脂溶性变化范围很大。脂溶性过高的提取物组分不适合于直接的质谱分析。为此，本发明采用特定的方法来考察和增强候选提取物组分在蛋白质缓冲液中的溶解性。首先，对于能够使用HPLC级甲醇或乙醇完全溶解的提取物组分，将其先用溶解蛋白质的缓冲液进行稀释，而后与靶蛋白浸泡，使其在合适条件下形成可能的靶蛋白-配体复合物；其次，对于无法完全溶解于甲醇或乙腈的组分，使用DMSO将其配置成高浓度的储液，而后用用于溶解蛋白质的缓冲液逐级稀释到合适的浓度，确定其均匀分散于溶液之中，再与靶蛋白浸泡形成复合物。再次，对于那些经过逐级稀释仍旧生成沉淀的组分，我们会获取其中的上清(含有水溶性较高的单体成分)与靶蛋白浸泡形成可能的复合物。4)利用质谱分析靶蛋白与配体的结合作用使用高分辨的电喷雾离子化质谱(ES1-MS)来研究上一步骤得到的靶蛋白-配体复合物。为得到高信号强度、高分别率的质谱图，可以对质谱仪的若干电压参数和真空度值进行优化。通过适当的打开离子源内的隔离阀来调整质谱仪的前级压力，使其在4-6mbar之内变动，可以提高蛋白质复合物在源内的去溶剂化效率，最终增强复合物的质谱信号，使分析较低浓度的样品成为可能。通过精确测量靶蛋白及其与配体形成的复合物的整体分子量(质量偏差通常小于OTa)，可以准确的判断该抑制剂分子是否与靶蛋白发生直接的结合作用，并获知结合的配比数。一旦确认靶蛋白与配体的结合，可以进行滴定实验测量出能够反映结合强度的解离常数值(Kd)，解离常数是直接反映结合强度的物理参数。如果待检测的是多组分的混合物，其中真正有抑制效果的配体分子将与靶蛋白发生结合，从而在质谱分析中显现出特异的信号。根据所形成的复合物的整体分子量，我们可获得关于未知的配体分子的精确分子量信息，指导下一步的结构鉴定工作。相比之下，存在于该混合物中的非抑制剂分子无法结合靶蛋白，也就不会产生特定的质谱信号。因而，本技术方案能够区分混合物中的真实配体和杂质成分，降低对候选化合物纯度的要求。现代生物质谱分析方法具有灵敏度和特异性高，以及分析速度快的优点，能够发展成为研究生物大分子尤其是蛋白质复合物的关键技术手段。与广泛应用的高通量筛选技术(HTS)和其他常见的表征蛋白质-配体结合作用的技术相比，质谱分析具有以下的独特优势:I)利用质谱研究药物候选分子和靶蛋白的结合作用是一种普适性很高的方法，即研究不同的靶蛋白可以采用基本相同的技术路线；2)无需标记底物和靶蛋白，减少化学标记可能对蛋白的结合性质产生的影响；3)质谱的高灵敏度使靶蛋白的消耗量可降至微克级；4)对配体分子和靶蛋白的纯度要求明显降低，质谱能够区分混合底物中的不同成分，对它们各自的结合性质同时进行表征。本发明提供的分析配体和靶蛋白之间的结合作用的方法是一种普适性高的分析方法，对于不同的靶蛋白和从天然产物中提取出的结构各异的小分子配体，都能采用该方法快速地检测配体与蛋白质的结合作用本发明提供的分析方法可以用于验证通过HTS得到的候选抑制剂，确认该候选抑制剂与靶蛋白是否发生直接的结合(成为靶蛋白的配体分子)，排除HTS的假阳性结果。
本发明提供的分析方法可以用于测量靶蛋白与配体的结合配比、结合强度等热力学参数。对于从天然产物中初步提取得到的含有多种小分子化合物的混合物，能够通过本发明提供的分析方法检测混合物中与靶蛋白发生结合作用的配体，加快候选抑制剂分子的筛选流程。
图1是示出靶蛋白(HIV病毒蛋白酶)分别与两种从天然产物提取出的不同组分A和B浸泡后的得到的靶蛋白-配体的质谱图。图2是把图1中靶蛋白与天然产物组分A中的某一单体结合后得到的靶蛋白-配体的质谱图。图3是示出靶蛋白结合图1中天然产物组分B中存在的化合物单体得到的靶蛋白-配体的质谱图。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。以下实例说明本实验流程能够从多组分混合物中有效得检测与靶蛋白发生直接结合作用的小分子配体，得出关于配体数和结合强度(由解离常数来衡量)的具体信息。将重组蛋白HIV病毒蛋白酶首先进行缓冲液置换,使之溶解于IOmM醋酸铵溶液(pH 6.9)，浓度为20 ii M。由HTS筛选得到的若干抑制剂组分使用与溶解蛋白质的缓冲液相同的缓冲液稀释到100 U M(可溶于甲醇的提取物，使用蛋白的缓冲液稀释)，而后分别与靶蛋白溶液1:1 (体积比)混合(使得蛋白质与抑制剂分子的终浓度配比为1: 5)，在室温放置15分钟。使用生物质谱直接分析混合液中存在的蛋白质复合物。质谱分析条件:扫描范围m/z为2500-5000，喷雾电压为2.2 2.5kV，鞘气流速为30 50L/h，采集时间间隔为1.0 1.5sec。质谱仪选择高分辨的电喷雾四级杆-飞行时间质谱(ES1-Q-TOF MS)。图1是示出靶蛋白(HIV病毒蛋白酶)分别与两种从天然产物提取出的不同组分A和B浸泡后得到的靶蛋白-配体的质谱图。与靶蛋白自身产生的质谱峰相比较，在每一簇蛋白峰的右侧都能见到几簇新的质谱峰，这是靶蛋白结合了小分子配体生成复合物而发生质量迁移所造成的，说明这两种天然产物组分中确实存在能够特异性结合该靶蛋白的化合物单体。将谱图中的特定质谱峰解析成对应的大分子的精确分子量，能够得到如图2和图3所示的代表性的结果。图2是图1中靶蛋白与天然组分A中某一单体结合的复合物对应的质谱峰经过解析后得到的质谱图。图2左侧显示的是靶蛋白自身测得的分子量(21641，21683，21726Da，有三种形式存在)，右侧的则是结合了小分子配体的复合物的整体分子量(21969,22012，22054Da)，由此得出复合物与靶蛋白的平均质量差异是328Da，与该组分含有的化合物单体的分子量(328Da)完全相符，说明靶蛋白的三种形式均结合了一个小分子配体(配比数是1:1)。图3显示的是靶蛋白结合图1显示的天然产物B中的某一单体形成的复合物经过分子量解析后得到了几组质量数。举其中信号较强的一组数值为例:靶蛋白自身的某种形式测量得到的精确分子量为21688Da，我们同时又得到分别结合了一个、两个和三个的复合物的分子量(分别为22095，22501，22907Da)，因而我们了解到该种小分子配体质量数为407Da，可以不同的配比数1: 1，1: 2，1: 3与靶蛋白发生结合作用。考虑到浸泡时所用的靶蛋白和小分子配体的实际浓度，根据蛋白质复合物产生的质谱信号的强度，我们能够通过公式进一步估算出不同的配体分子与靶蛋白形成复合物的解离常数Kd。本例中，经计算得知配比数为1: 1，1: 2和1: 3的复合物的解离常数分别是50 iiM，40 ii M和IlOii M。上文中提到的天然产物A组分是用95%乙醇提取原药材厚朴，提取物用乙酸乙酯萃取，然后分离纯化，含有新木质素类化合物。天然产物B组分是用95%乙醇提取原药材夜关门，提取物用乙酸乙酯萃取，然后分离纯化，含有黄酮的糖苷类化合物。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种筛选和/或分析目标配体的方法，包括如下步骤: a.制备受试品与目标靶点的复合物； b.利用质谱分析上述复合物是否制备成功。
2.根据权利要求1所述的方法，当步骤b的分析结果为复合物制备成功时，所述方法还包括:c.进一步分析复合物中受试品与目标祀点结合的配比数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b通过以下方式实施:通过质谱精确测量的结果判断是否存在目标靶点与受试品形成的复合物的整体分子量，从而判断复合物是否制备成功。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤c通过以下方式实施:将目标靶点与受试品形成的复合物的整体分子量，减去目标靶点的分子量，获得的差值与受试品的分子量进行比较，通过两者之间的倍数关系来分析受试品与目标靶点结合的配比数。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在c步骤之后，还包括:d.利用滴定实验测量反映目标靶点与目标配体之间的结合强度的解离常数值的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标配体是与目标靶点形成复合物的受试品。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试品是利用高通量酶活性测试系统筛选获得的所述目标靶点的候选抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述候选抑制剂是单一的成分，或者是包含多组分的混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述包含多组分的混合物是天然产物的提取物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在制备受试品与目标靶点的复合物的步骤之前还包括通过离心式浓缩管、微透析或者微型色谱柱纯化目标靶点的步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中制备受试品与目标靶点的复合物的步骤通过将所述目标靶点与受试品一起浸泡实施。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b的质谱分析通过高分辨的电喷雾离子化质谱(ES1-MS)实施。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤b的质谱分析包括打开离子源内的隔离阀来调整质谱仪的前级压力，使其在4-6mbar的范围内变动。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标靶点是病毒合成的蛋白酶，或者是核酸内切酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒合成的蛋白酶是HIV蛋白酶或SARS冠状病毒主蛋白酶。
全文摘要
本发明提供了一种筛选和/或分析目标配体的方法，包括如下步骤a.制备受试品与目标靶点的复合物；b.利用质谱分析上述复合物是否制备成功；以及可选地包括c.进一步分析复合物中受试品与目标靶点结合的配比数。该方法普适性高，能够排除HTS的假阳性结果，以及能够适用于含有多种小分子化合物的混合物。
文档编号G01N27/62GK103163205SQ201110412780
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者水雯箐, 饶子和, 李伟, 郭宇, 杨诚 申请人:天津市国际生物医药联合研究院, 南开大学生命科学学院