专利名称：多功能荧光免疫层析快速定量检测卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫测定领域。具体而言，本发明涉及用于检测样品中待测抗原的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡。本发明还涉及此定量检测卡的制备方法及其在食品安全检测中的应用。
背景技术：
目前的免疫层析快速检测卡多以胶体金、彩色乳胶微粒或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品具有灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题。彩色乳胶微粒虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量。基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测。近年来，食品安全事故频出，食品安全越来越受到政府和广大群众的重视。三聚氰胺、瘦肉精等事件将食品安全问题暴露在了人民群众跟前。对于三聚氰胺、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等小分子检测，检测方法多为色谱分析和免疫分析。色谱分析包括高效液相色谱、气质联用色谱等。而免疫分析主要有酶联免疫法(ELISA),胶体金快速诊断等。市面上的快速检测试纸只能固定的检测一个或者两个项目，如检测三聚氰胺的检测卡只能用于检测三聚氰胺，而检测盐酸克伦特罗的检测卡只能检测盐酸克伦特罗。当需要检测多个项目时，需要准备多种检测卡。因此本领域迫切需要灵敏度高、检测用途广的新型检测卡，尤其需要能够实现一卡多用的检测卡。
发明内容
本发明开发了 一种免疫荧光快速定量检测卡，只要针对不同的检测项目更换相应的样品处理液，即可检测不同的物质，并且得到精确定量结果，真正实现了一卡多用的目的。本发明的提供了一种新型的基于免疫层析技术的多功能快速定量检测试剂，特征在于样品处理液为荧光素标记的抗原和生物素标记的抗体，免疫层析膜上固定有亲和素(链霉亲和素)和羊抗鼠抗体。本发明所述的荧光免疫层析快速定量检测卡，该检测卡为底衬上依次搭接样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，硝酸纤维素膜上有检测线(T线，固定有亲和素)和质控线(C线，固定有羊抗兔抗体)。针对不同的检测项目，配备不同过的样品处理液，样品处理液包括A、B两个组分，A液中含有荧光素标记的待测抗原分子和荧光素标记的兔抗，B液中含有生物素标记的针对待测抗原的鼠单克隆抗体。如检测盐酸克伦特罗的样品处理液A中含有荧光素标记的盐酸克伦特罗抗原和荧光素标记的兔抗，B液中含有生物素标记的盐酸克伦特罗单克隆鼠抗。检测莱克多巴胺的样品处理液A中含有突光素标记的莱克多巴胺抗原和突光素标记的兔抗，B液中含有生物素标记的莱克多巴胺单克隆鼠抗。检测三聚氰胺的样品处理液A中含有荧光素标记的三聚氰胺抗原和荧光素标记的兔抗，B液中含有生物素标记的三聚氰胺单克隆鼠抗。标记用的荧光素可以是市售的各种荧光标记物，如FITC、罗丹明、Invitrogen公司的Alexa Fluor突光标记物系列等。本发明可用于检测各种小分子抗原或半抗原，检测原理同免疫竞争法。检测步骤:将待测样本加入样品处理液A中，然后再在样本处理液中加入样本处理液B，待测样本中的抗原与荧光素标记的抗原相互竞争与B液中的生物素标记的单克隆抗体结合，样本中待测抗原浓度越高，则荧光素标记的抗原与生物素标记的抗体结合的量越少。将混合液滴加在检测卡中，抗原抗体复合物通过层析作用依次通过C、T线，生物素标记的单克隆抗体与T线的亲和素结合，而混合液中的荧光素标记兔抗则被C线的羊抗兔抗体捕获。待测样本中的抗原浓度越高，则荧光素标记的抗原与生物素标记的抗体量形成抗原抗体复合物的量就越少，T线上被亲和素捕获的荧光免疫复合物的量也就越少，待测样本中抗原的浓度与T线信号成负相关。而C线上捕获的荧光素标记兔抗信号值则相对固定。通过荧光检测仪对检测卡进行扫描，根据抗原浓度与荧光信号成负相关，获得待测样本中抗原的准确浓度。本发明的另外一个目的在于提供一种新型的基于免疫层析技术的多功能快速定量检测卡的制备方法。本发明所述的多功能快速定量检测卡的制备方法，包括以下步骤:(I)荧光素标记抗原(2)荧光素标记兔抗(3)生物素标记针对特定抗原的单克隆抗体(4)样品处理液A制备(5)样品处理液B制备(6)喷膜将亲和素稀释到0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在硝酸纤维素膜检测区T。将羊抗兔抗体稀释到0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在硝酸纤维素膜质控区C。C、T线喷膜液量为0.5 2 μ I/cm。(7)大卡粘贴在带有背胶的底板上依次黏贴硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸等。(8)干燥将上述喷好试剂的大卡在恒温烘箱或者烘房中37度烘干6 24小时。(9)切条、装卡将干燥好的大卡用切条机或者滚刀切割成特定宽度的检测卡，将切割好的检测卡装在塑料外壳中，并用铝箔袋或塑料袋封装，封装袋中加入干燥剂。因此，本发明一方面提供了一种多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，该检测卡包括:a)样品处理液A,其含有突光素标记的待测抗原和突光素标记的对照；b)处理液B，其含有生物素标记的针对待测抗原的单克隆抗体；c)检测卡，其包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有亲和素，所述质控线区域固定有针对所述对照的抗体。在本发明中，荧光素标记的待测抗原浓度优选为I 100ng/ml，对照的终浓度优选为I 20ng/ml,单克隆抗体终浓度优选为5 50 μ g/ml。在本发明的一些实施方案中，对照可以是兔抗，针对该对照的抗体可以是羊抗兔抗体。在本发明的一些实施方案中，待测抗原包括但不限于盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、三聚氰胺。另外，待测抗原也包括小分子抗原和半抗原。在本发明中，荧光素可以使用任何适当的荧光素，例如FITC、罗丹明、Alexa Fluor荧光标记物系列等。本发明另一方面还提供本发明的检测卡在食品安全检测中的应用。本发明又一方面提供使用本发明的检测卡检测样本中待测抗原的方法，其包括下述步骤:i)将待测样本加入样品处理液A中，然后再在样本处理液中加入样本处理液B，得到混合液，其中，待测样本中的抗原与处理液A中所述荧光素标记的待测抗原相互竞争与处理液B中所述单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，样本中待测抗原浓度越高，则处理液A中所述荧光素标记的待测抗原与处理液B中所述单克隆抗体结合的量越少；ii)将i)中得到的混合液滴加在检测卡中，所述抗原抗体复合物通过层析作用依次通过质控线区域、检测线区域，生物素标记的单克隆抗体与检测线区域的亲和素结合，而混合液中的荧光素标记对照则被质控线的该对照的抗体捕获；待测样本中的抗原浓度越高，则荧光素标记的抗原与生物素标记的抗体量形成抗原抗体复合物的量就越少，检测线上被亲和素捕获的荧光免疫复合物的量也就越少，待测样本中抗原的浓度与检测线信号成负相关；而质控线上捕获的荧光素标记的对照的信号值则相对固定；iii)通过荧光检测仪对检测卡进行扫描，根据抗原浓度与荧光信号成负相关，获得待测样本中抗原的准确浓度。本发明又一方面提供检测卡的制备方法，其包括以下步骤:i)制备荧光素标记的待测抗原、荧光素标记的对照、生物素标记的针对待测抗原的单克隆抗体；ii)制备处理液A、处理液B ；iii)喷膜，其包括将亲和素稀释到0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在载体膜检测线区域；iv)将针对对照的抗体稀释到0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在载体膜的质控线区域；质控线、检测线的喷膜液量为0.5 2 μ 1/cm ；v)大卡粘贴，在带有背胶的底板上依次粘帖载体膜、样品垫、吸水纸；
vi)干燥，将上述喷好试剂的大卡在恒温烘箱或者烘房中烘干6 24小时；vii)切条、装卡，将干燥好的大卡用切条机或者滚刀切割成检测卡，将切割好的检测卡装在塑料外壳中，并用铝箔袋或塑料袋封装，封装袋中加入干燥剂。在本发明中，可以使用任何适当的载体膜，如硝酸纤维素膜。
图1:膜组合方式及区域划分1:底板2:样品垫3:吸水垫4:硝酸纤维素膜5:检测线(T线)区域6:质控线(C线)区域。图2:盐酸克伦特罗检测标准曲线。图3:莱克多巴胺检测标准曲线。图4:三聚氰胺检测标准曲线。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，但实施例并非限定本发明的保护范围。实施例1:荧光素标记蛋白(I)突光素(以突光素Alexa Fluor 647为例,购自Invitrogen)标记盐酸克伦特罗(莱克多巴胺、三聚氰胺)抗原(连接有BGG、BSA等大分子载体，盐酸克伦特罗-BSA合成抗原购自杭州隆基生物，莱克多巴胺-BSA合成抗原购自杭州隆基生物，三聚氰胺-BSA合成抗原购自北京博奥森生物)或者羊抗兔抗体(购自杭州隆基生物)100μ l(lmg/ml,PBS)盐酸克伦特罗(莱克多巴胺、三聚氰胺)抗原或者羊抗兔抗体中添加10 μ I lmol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.3),再添加I μ I Alexa Fluor 647 (lOmg/ml)，然后在4°C下反应过夜。将上述反应液用Sephadex G25色谱柱(购自Phamarcia)将游离的Alexa染料去除，得到荧光素标记的盐酸克伦特罗(莱克多巴胺、三聚氰胺)抗原。实施例2:生物素标记蛋白(I)生物素标记盐酸克伦特罗(莱克多巴胺、三聚氰胺)单克隆抗体，(盐酸克伦特罗单克隆抗体购自杭州隆基生物，莱克多巴胺单克隆抗体购自杭州隆基生物；三聚氰胺单克隆抗体购自北京博奥森生物)用0.1M NaHC03将待标记抗体配制成lmg/ml溶液，采用DMSO配置Biotin-X-X-NHS溶液至 16.172mg/ml,取 5.4ul Biotin-X-X-NHS至 Img待标记抗体溶液中，混合均匀并在4 °C下放置过夜。将上述反应液用S印hadex G25色谱柱将游离的Biotin-X-X-NHS去除，得到生物素标记的待标记抗体。
实施例3:样品处理液A配制(I)盐酸克伦特罗的样品处理液A配制荧光素标记盐酸克伦特罗抗原和荧光素标记兔抗混合液，其中荧光素标记的盐酸克伦特罗终浓度I 100ng/ml，荧光素标记兔抗终浓度为I 20ng/ml。此混合液即为盐酸克伦特罗样品处理液A(2)莱克多巴胺的样品处理液A配制荧光素标记莱克多巴胺抗原和荧光素标记兔抗混合液，其中荧光素标记的莱克多巴胺终浓度I 100ng/ml，荧光素标记兔抗终浓度为I 20ng/ml。此混合液即为莱克多巴胺样品处理液A(3)三聚氰胺的样品处理液A配制荧光素标记三聚氰胺抗原和荧光素标记兔抗混合液，其中荧光素标记的莱克多巴胺终浓度I 100ng/ml，荧光素标记兔抗终浓度为I 20ng/ml。此混合液即三聚氰胺样品处理液A实施例4:样品处理液B配制(I)盐酸克伦特罗的样品处理液B配制生物素标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体，终浓度5 50 μ g/ml，作为盐酸克伦特罗样品处理液B。(2)莱克多巴胺的样品处理液B配制生物素标记的莱克多巴胺单克隆抗体，终浓度5 50μ g/ml，作为莱克多巴胺样品处理液B。(3)三聚氰胺的样品处理液B配制生物素标记的三聚氰胺单克隆抗体，终浓度5 50 μ g/ml，作为三聚氰胺样品处理液B。实施例5:多功能免疫层析定量检测卡的制备(I) T线溶液配制用IOmM PB (含有3%甲醇)溶液将亲和素(链霉亲和素，购自sigma)稀释成lmg/ml ο(2) C线溶液配制用IOmM PB(含有3%甲醇)溶液将羊抗兔抗体稀释到lmg/ml。(3)喷膜将C、T线溶液喷在硝酸纤维素膜(购自Millipore公司，型号HF135)的CT区域(附图中分别对应6、5)(4)大卡粘帖依次在底板(附图中I)上粘帖硝酸纤维素膜(附图中4)，样品垫(附图中2)，吸水垫(附图中3)。(5)烘干将上述喷好试剂的大卡在恒温烘箱或者烘房中37度烘干24小时。(6)切条及装卡将烘干的大卡切割成3 5mm宽度的纸条，装配到塑料壳中，铝箔袋或者塑料袋封装，内配干燥剂，形成多功能免疫荧光定量检测板。与相应的样品处理液A、B配合即可检测检测相应的抗原。实施例6:标准曲线绘制(I)盐酸克伦特罗检测标准曲线绘制用磷酸盐缓冲液(PBS:0.01M, P H 7.4)配制浓度为 0、0.2、1、10、50、100ng/ml 的盐酸克伦特罗标准品进行平行检测，每个浓度进行10次实验，反应时间为lOmin，仪器测定检测结果，以浓度和信号绘制标准曲线，储存在数据卡中，作为本批试剂的盐酸克伦特罗定标曲线，标准曲线见图2。表I盐酸克伦特罗标准品检测结果
权利要求
1.一种多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，该检测卡包括: a)样品处理液A，其含有荧光素标记的待测抗原和荧光素标记的对照； b)处理液B，其含有生物素标记的针对待测抗原的单克隆抗体； c)检测卡，其包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有亲和素，所述质控线区域固定有针对所述对照的抗体。
2.根据权利要求1所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，其中所述待测抗原浓度为I 100ng/ml,所述对照终浓度为I 20ng/ml,所述单克隆抗体终浓度为5 50 μ g/ml ο
3.根据权利要求1或2所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，其中所述对照是兔抗，针对所述对照的抗体是羊抗兔抗体。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，其中所述待测抗原包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、三聚氰胺。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，其中所述荧光素包括FITC、罗丹明、Alexa Fluor荧光标记物系列。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡，其中所述待测抗原包括小分子抗原和半抗原。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡在食品安全检测中的应用。
8.—种通过权利要求1-6中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡检测样本中待测抗原的方法，其包括下述步骤: i)将待测样本加入样品处理液A中，然后再在样本处理液中加入样本处理液B，得到混合液，其中，待测样本中的抗原与处理液A中所述荧光素标记的待测抗原相互竞争与处理液B中所述单克隆抗体结合形成抗原抗体复合物，样本中待测抗原浓度越高，则处理液A中所述荧光素标记的待测抗原与处理液B中所述单克隆抗体结合的量越少； )将i)中得到的混合液滴加在检测卡中，所述抗原抗体复合物通过层析作用依次通过质控线区域、检测线区域，生物素标记的单克隆抗体与检测线区域的亲和素结合，而混合液中的荧光素标记对照则被质控线的该对照的抗体捕获；待测样本中的抗原浓度越高，则荧光素标记的抗原与生物素标记的抗体量形成抗原抗体复合物的量就越少，检测线上被亲和素捕获的荧光免疫复合物的量也就越少，待测样本中抗原的浓度与检测线信号成负相关；而质控线上捕获的荧光素标记的对照的信号值则相对固定； iii)通过荧光检测仪对检测卡进行扫描，根据抗原浓度与荧光信号成负相关，获得待测样本中抗原的准确浓度。
9.一种权利要求1-6中任意一项所述的多功能荧光免疫层析快速定量检测卡的制备方法，其包括以下步骤: i)制备荧光素标记的待测抗原、荧光素标记的对照、生物素标记的针对待测抗原的单克隆抗体； ii)制备处理液A、处理液B; iii)喷膜，其包括将亲和素稀释到 0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在载体膜检测线区域；iv)将针对对照的抗体稀释到0.5 2mg/ml，用喷膜仪定量喷在载体膜的质控线区域；质控线、检测线的喷膜液量为0.5 2 μ 1/cm ； v)大卡粘贴，在带有背胶的底板上依次粘帖载体膜、样品垫、吸水纸； vi)干燥，将上述喷好试剂的大卡在恒温烘箱或者烘房中烘干6 24小时； vii)切条、装卡，将干燥好的大卡用切条机或者滚刀切割成检测卡，将切割好的检测卡装在塑料外壳中，并用铝箔袋或塑料袋封装，封装袋中加入干燥剂。
10.根据权利要 求9所述的制备方法，其中所述的载体膜为硝酸纤维素膜。
全文摘要
本发明涉及多功能荧光免疫层析快速定量检测卡。本发明的检测卡包括a)样品处理液A，其含有荧光素标记的待测抗原和荧光素标记的对照；b)处理液B，其含有生物素标记的针对待测抗原的单克隆抗体；c)检测卡，其包括检测线区域和质控线区域，所述检测线区域固定有亲和素，所述质控线区域固定有针对所述对照的抗体。本发明还涉及所述多功能荧光免疫层析快速定量检测卡的制备方法、其在食品安全检测中的应用以及使用所述检测卡检测样本中待测抗原的方法。本发明的特点在于1)检测卡通用，可以检测不同食品添加剂；2)产品保质期长，稳定性好；3)提高了检测的灵敏性和稳定性，不易受到干扰，且可以达到定量检测的目的。
文档编号G01N33/558GK103163297SQ201110422050
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者王哲 申请人:王哲, 霍春辉, 哈峰