专利名称：试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种诊断试剂盒。更具体地，本实用新型涉及包括五项检测试纸条的诊断试剂盒，所述五项试纸条分别包被有五种不同的抗原，用于体外定性检测人血液中的AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体，辅助诊断自身免疫性肝病。背景肝炎是影响人类健康的最常见疾病之一，慢性肝炎对患者与社会影响更大。近几年国外相继报道自身免疫性肝病，特 别是自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)和原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC),其发病率均有明显上升的趋势。AIH是由自身免疫反应引起的肝脏损伤，表现为慢性渐进性肝炎，直至肝硬化，血清学表现为高丙种球蛋白和特征性自身抗体等。由于AIH的检测指标经常和其他自身免疫性肝病的指标重叠，因此对病因不明的肝病患者筛查AIH的同时，有必要排除其他疾病的干扰。例如，已发现，AIH与PBC的重叠占8%，与原发性硬化性胆管炎重叠占6%，与慢性病毒型肝炎重叠占11%，与自身免疫性胆管炎重叠占10%，其他不明原因的慢型肝炎占13%。其中PBC的发病率较高，因此，有必要在筛查AIH的同时排除PBC的干扰。PBC是以破坏肝内小及中等大小胆管为主的器官特异性自身免疫性肝病，表现为肝门脉区炎症导致纤维化，肝硬化甚至功能性衰竭。PBC患者90%以上为女性，年龄一般为30至65岁之间，随年龄增长期发病率呈上升趋势。过去明确PBC诊断的方法是肝脏穿刺活检，但这种创伤性的检测手段限制了其应用。迄今为止，自身免疫性疾病的诊断手段主要是在结合临床的基础上，依赖实验室检测到一种或多种高效价的自身抗体。在国际权威机构制定的某些自身免疫性疾病诊断标准中就包括了自身抗体，如原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis, PBC),美国肝病学会(AASLD) 2000年发表的PBC诊断程序中，将抗线粒体抗体(AMA)列为诊断标准之一。线粒体膜上存在9种自身抗原(Ml 9)，针对其中M2亚型相应的AMA(AMA-M2)诊断PBC的敏感性和特异性最高。而对自身免疫性肝炎(AIH)的诊断，甚至可以根据患者血清中自身抗体的不同，将其分型。当然，以上各种自身抗体在疾病诊断过程均存在其局限性，不能一概而论。如有一些M2阴性的PBC患者就无法得到及时的诊断和治疗。近年已有不少报道在M2阴性的PBC患者的体内检测到一些特殊类型的自身抗体，对PBC的诊断具有高度特异性，最具临床价值的为SP100抗体和GP210抗体。SP100抗体可在约31 %的PBC患者体内被检测到，由于不能在其他各种类型的自身免疫性肝病中检测到该抗体，因此被视为PBC的标志物。GP210抗体虽然仅仅在约10%的PBC患者体内被检测到，但对M2阴性的PBC具有较高诊断价值，可在21%的M2阴性患者体内查到，因此联合SP100和GP210抗体指标，提高了单项M2检测对PBC的诊断率。SLA抗体对III性自身免疫性肝炎具有高度特异性，其阳性率占自身免疫性肝炎的11% 32. 5%，至今尚未发现在其他疾病或正常人群中存在SLA抗体，因而诊断价值很高。LKM抗体(抗肝/肾微粒体抗体)能与肝细胞质、近端肾小管起反应，经鉴定LKM抗体有3种亚型，LKM-I是II型自身免疫性肝炎的血清学标忐。[0007]目前还没有一种诊断装置，能够同时对AIH和PBC进行方便、快捷和准确的筛查。而对这两种疾病的筛查对临床诊断的准确性，以及后续治疗方案的选择都具有重要的意义。在临床诊断上，目前实验室常用的检测自身抗体的方法主要有酶联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、间接免疫突光法(indirectimmunof lurescence, IFF)、免疫印迹法(immunoblotting test, IBT)、线性免疫分析法(Line immuno assay，LIA)等。免疫印迹法虽综合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，但操作相对复杂，且试剂具有较强的毒性和污染性。间接免疫荧光法可作半定量测定，但需有荧光显微镜观察结果，结果判定的客观性不足，标准化困难，技术程序比较复杂,也不适合高通量标本的检测。线性免疫分析法主要用于疾病大类的筛查,针对性相对较差，同时也不适合高通量样本的检测。ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，目前被广泛认可，但操作比较繁琐，需多次加样和洗涤，且易受温度和孵育条件的影响，在专业实验室里进行操作，给实验带来诸多不便。因此，本领域迫切需要提供一种在临床中能够快速准确地检测和筛查AIH和PBC的诊断装置，以满足临床诊断的需要，实现即时检测、床边检测的需求。
发明内容本实用新型提供了一种用于诊断自身免疫性肝病的诊断试剂盒，其包括五个试纸条，其中所述试纸条包括依次搭接的样品垫、结合垫、检测膜、和吸水垫，以及支撑底板。其中，所述结合垫上包被有可与人抗体结合的胶体金标记的蛋白；所述检测膜的检测区上包被有一种检测蛋白印迹，所述检测膜的质控区上包被有一种质控蛋白印迹；所述试纸条的检测膜上的所述检测蛋白印迹与所述质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫。在某些实施方式中，所述样品垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，所述结合垫是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成，和所述检测膜是由硝酸纤维素膜制成，以及所述支撑底板由PVC板或其它硬质地而不吸水的材料制成。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和/或所述质控蛋白印迹的形状分别为斑点状或条带状。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹部为斑点状。在某些实施方式中，所述检测蛋白印迹和所述质控蛋白印迹都为条带状。在某些实施方式中，每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SP100蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。在某些实施方式中，所述质控蛋白为可与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者可与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。在某些实施方式中，所述试纸条的结合垫上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒进一步包括至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述五个试纸条。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单个试纸条的容纳部内。在某些实施方式中，所述固定底座的板面上设有突起，所述突起界定至少一个可容纳单个试纸条的容纳部。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括两个或两个以上所述固定底座，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。[0014]在某些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。在某些实施方式中，所述五个试纸条相互平行。在某些实施方式中，所述试纸条的检测膜上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自下组的组成部分固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。
图I为单个试纸条的剖面示例图，其中I指示样品垫，2指示结合垫，3指示检测膜，4指示吸水垫，5指示检测区，6指示质控区，7指示支撑底板。图2为单个试纸条的分解示例图，其中1-7所表示的结构同图I。图3为可以设置单个试纸条的设有突起的固定底座的不例图,其中(a)为俯视图，(b)为剖视图。其中8指示固定底座，9指示突起，20指示容纳部。图4为可与固定底座配合的上盖的示例俯视图，其中10指示上盖，11指示加样口，12指示观察窗口。图5为设有试纸条的固定底座和上盖配合时的结构示意图，其中(a)为俯视图，(b)为剖视图，其中1-12所表示的结构同图I、图2和图4。图6为可以设置多个试纸条的设有突起的固定底座及可与之配合的上盖的示例图，其中(a)为固定底座的示例俯视图，(b)为固定底座的示例剖视图，(C)为上盖的示例俯视图。其中V指示固定底座，8’指示突起，9’指示上盖，10’指示加样口，11’指示观察窗口，20指示容纳部。图7为用试纸条进行检测得到的检测结果示意图，其中13指示检测区内出现的深色带，14指示质控区内出现的深色带。
具体实施方式
本实用新型提供了用于诊断自身免疫性肝病的含有试纸条的诊断试剂盒，所述试纸条能够用于进行样品的层析，并且能够检测样品中存在的被检物质。在某些实施方式中，所述样品可以是人体液样品，例如血液，血浆等。在某些实施方式中，所述样品中存在的被检物质是一种或多种人抗体，例如，AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体。上述这些人抗体被证明与自身免疫性肝病有关，通过检测血液或血浆中是否存在一种或多种这些抗体，可以辅助诊断自身免疫性肝病。这些被检抗体能够特异性结合其对应的抗原，因此，将这些抗体的抗原包被在所述试纸条的检测区，可以检测与之对应的被检抗体。表I中列出了能够与AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-I抗体特异性结合的抗原的示例，以及相关联的疾病。[0025]表I
权利要求1.一种用于诊断自身免疫性肝病的诊断试剂盒，包括五个试纸条，其中所述试纸条包括依次搭接的样品垫(I)、结合垫(2)、检测膜(3)、和吸水垫(4)，以及支撑底板(7)，其中 所述试纸条的结合垫(2)上包被有可与人抗体结合的胶体金标记的蛋白； 所述试纸条的检测膜(3)的检测区(5)上包被有一种检测蛋白印迹； 所述试纸条的检测膜(3)的质控区(6)上还包被有一种质控蛋白印迹；以及 所述试纸条的检测膜(3)上的所述检测蛋白印迹与所述质控蛋白印迹彼此分离，所述检测蛋白印迹相比于所述质控蛋白印迹更靠近于结合垫(2)。
2.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述样品垫(I)是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述结合垫(2)是由玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布制成；所述检测膜(3)是由硝酸纤维素膜制成；且所述支撑底板(7)由PVC板或其它硬质地而不吸水的材料制成。
3.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其特征在于所述检测蛋白印迹和质控蛋白印迹的形状分别为斑点状或条带状。
4.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中每个所述试纸条上的检测蛋白印迹为一种选自下组的物质AMA-M2蛋白印迹、SPlOO蛋白印迹、GP210蛋白印迹、SLA蛋白印迹和LKM-I蛋白印迹，且不同试纸条上包被的检测蛋白印迹不相同。
5.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中质控蛋白印迹为与样品中抗体结合的抗体或蛋白，或者与所述胶体金标记的蛋白结合的抗体或蛋白。
6.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述试纸条的结合垫(2)上还包被有第二种胶体金标记的蛋白，且所述质控蛋白印迹能够结合所述第二种胶体金标记的蛋白。
7.如权利要求I所述的诊断试剂盒，进一步包括至少一个固定底座，所述至少一个固定底座上固定有所述五个试纸条。
8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于所述固定底座的板面上设有突起，其中所述试纸条放置在由所述突起界定的、可容纳单个试纸条的容纳部内。
9.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于所述固定底座的板面上设有突起，所述突起界定至少一个可容纳单个试纸条的容纳部。
10.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其包括两个或两个以上所述固定底座，其中每个所述固定底座上分别固定有至少一个所述试纸条。
11.如权利要求7或10任一所述的诊断试剂盒，其特征在于还包括与所述固定底座和所述试纸条配套使用的上盖，每个所述上盖带有加样口和观察窗口，所述加样口位于所述试纸条的所述样品垫上方，所述观察窗口位于所述试纸条上的所述检测膜上方。
12.如权利要求I所述的诊断试剂盒，其中所述五个试纸条相互平行。
13.如权利要求12所述的诊断试剂盒，其中所述试纸条的检测膜(3)上包被的检测蛋白印迹基本位于同一水平线上，所述试纸条的检测膜(3)上包被的质控蛋白印迹基本位于同一水平线上。
14.如权利要求I所述的诊断试剂盒，进一步包括一种或多种选自下组的组成部分用于固定所述试纸条的固定底座、上盖、干燥剂、滴管、说明书、颜色标签、样品收集管、和样品稀释液。
专利摘要本实用新型提供了一种试剂盒，包括五个相互独立的试纸条，其中每一个试纸条都包括依次搭接的样品垫、结合垫、检测膜、和吸水垫，所述检测膜上设置有相互分离的检测区和质控区，其中检测区包被有检测蛋白，质控区包被有质控蛋白。本申请提供的试剂盒能够用于检测样品中AMA-M2抗体、SP100抗体、GP210抗体、SLA抗体或LKM-1抗体的存在，并且可用于辅助诊断自身免疫性肝病。
文档编号G01N33/576GK202362304SQ20112034745
公开日2012年8月1日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者包骏, 张玥 申请人:上海科新生物技术股份有限公司