专利名称：通过确定焦谷氨酸修饰的mcp-1诊断炎性疾病的方法和谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的筛 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1 (MCP-lNlpE) :MCP-I总浓度的比率作为生物标记监测炎性疾病或炎性相关疾病的治疗的方法，进一步涉及确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相关于MCP-I总浓度的比例的新方法。本发明还提供了用于筛选谷氨酰胺酰基环化酶(glutaminyl cyclase) (QC)抑制剂或者测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的效力的诊断试剂盒及方法。
背景技术：
趋化性细胞因子(趋化因子)是吸引和激活白细胞的蛋白质并且被认为在炎症中起重要作用。趋化因子通过N-末端半胱氨酸残基的表观被分为4个家族(C-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子)。CC-趋化因子(又名β-趋化因子)优先吸引单核细胞至炎症部位。单核细胞浸润被认为是一些疾病病症中的关键事件(Gerard，C. and Rollins，B. J. (2001)Nat. Tmmunol 2,108-115;Bhatia, M. , et al., (2005)Pancreatology. 5, 132-144;Kitamoto,S. , Egashira, K. , and Takeshita, A. (2003) J Pharmacol Sci. 91，192-196)。MCP-1 (单核细胞趋化蛋白-I，CCL2)是趋化因子CC家族成员。在这个家族中，距氨基末端最近的2个半胱氨酸彼此相邻(因此称作C-C蛋白)。与许多其它CC趋化因子一样，MCP-I基因位于人类17号染色体上。结合MCP-I的细胞表面受体是CCR2和CCR5。已发现4 种不同的人类 MCP MCP-1 (CCL2)、MCP-2 (CCL8)、MCP-3 (CCL7)和MCP-4 (CCL13) ο MCP被认为是CC趋化因子的亚家族。所有MCP均展示优先吸引单核细胞但是在它们的表达水平及趋化潜力中显示差异(Luini，W.，et al.，(1994)Cytokine 6, 28-31;Uguccioni, Μ. , et al. , (1995)Eur J Tmmunol 25,64-68)Berkhout, etal.，(1997)JBC0以下示出人类MCP-I的氨基酸序列人类MCP-1 (CCL2) (UniProtKB/Swiss-Prot P13500)蛋白质(信号序列黑体23aa;成熟MCP_l:76aa)SEQ ID NO: IMKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQ RLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKffVQDSMDHLDKQTQT PKT与其是趋化因子β家族成员一致，MCP-I已示出在体外以亚纳摩尔浓度化学吸引及激活单核细胞。升高的MCP-I表达已在各种涉及单核细胞积累和激活的病理学病症中检测到，包括一些炎性和非炎性疾病状态，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、肥胖和迟发型超敏反应。一些研究已经特别揭示MCP-I在如下疾病发展中的关键作用动脉粥样硬化(Gu，L.，et al. , (1998)Mol. Cell 2, 275-281; Gosling, J. , et al. , (1999) J Clin.Invest 103, 773-778);类风湿性关节炎(Gong, J. H. , et al. , (1997) J Exp. Med186, 131-137;Ogata, H. , et al. , (1997) J Pathol. 182, 106-114);胰腺炎(Bhatia, M. , etal., (2005)Am. J Physiol Gastrointest. Liver Physiol 288，G1259-G1265);阿尔茨海默病(Yamamoto, Μ. , et al. , (2005) Am. J Pathol. 166，1475-1485);肺纤维化(Inoshima, I. , et al. , (2004)Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol 286，L1038-L1044);肾纤维化(Wada, T.，et al.，(2004) J Am. Soc. Nephrol. 15，940-948)以及移植物排斥(Saiura, A.，et al.，(2004)Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24，1886-1890)。 另夕卜，MCP-I 可能也在妊娠中毒中起作用(Katabuchi, H. , et al. , (2003) Med ElectronMicrosc. 36，253-262)，有助于与高胰岛素血症和肥胖相关的病理，包括II型糖尿病(Sartipy, P. and Loskutoff, P. J. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 7265-70),作为肿瘤发展(0hta，M.，et al. , (2003) Int. J Oncol. 22, 773-778;Li, S. , et al. ,(2005) JExp. Med 202，617-624)、神经性疼痛(White, F. A. , et al. , (2005)Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A102, 14092-7，Jung et al. J Neurochem. 104，254-63)和艾滋病(Park, I. ff.，Wang, J.F. , and Groopman, J. E. (2001)Blood 97,352-358;Co11, B. , et al., (2006)Cytokine34, 51-55)中的旁分泌因子。MCP-1的成熟形式由谷氨酰胺酰基环化酶(QC)翻译后修饰以具有N-末端焦谷氨酸(pGlu)残基(Proost, P. et al. (1996) J Leukocyte Biol. 59，67-74)。谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺酰残基的分子内环化成为焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu，pE)，释放氨，以及催化N-末端谷氨酰残基的分子内环化成为焦谷氨酸，释放水(Fischer, W. H. and Spiess, J. (1987). Proc Natl Acad Sci US A 84:3628-32, Golololov, M.Y.,et al. (1994)Arch. Biochem. Biophys. 309, 300-7) N-末端pGlu修饰使得蛋白质抗氨基肽酶的N-末端降解，这非常重要，因为MCP-I的趋化能力由其 N-末端介导(Van Damme, J. , et al. , (1999) Chem Tmmunol 72,42-56)。MCP-1 N-末端(残基1-9)的人工延伸或降解导致功能的急剧降低或丧失，尽管MCP-I仍然与其受体(CCR2)结合(Proost, P. , etal. , (1998)，J Immunol 160, 4034-4041; Zhang, Y.J. , et al. , 1994, J Biol. Chem269, 15918-15924; Masure, S. , et al. , 1995, JInterferon Cytokine Res.15,955-963;Hemmerich, S. , et al. , (1999)Biochemistry38，13013-13025，Gong and Clark-Lewis (1995) J. Exp. Med. 181,631-40)。由于MCP-1在一些疾病病症中的显著作用，抗MCP-1策略的开发和应用需要强有力工具，以用于诊断、预后和靶调节生物标记用途。如上所述，引人注目的证据指向MCP-I在阿尔茨海默病(AD)中的作用(Xia，M.Q. and Hyman, B. Τ. (1999) J Neurovirol. 5，32-41)。MCP-1 在衰老斑和在反应性小神经胶质、CNS的定居巨噬细胞中的存在已经在患有AD的患者脑中观测到(Ishizuka，K.，etal., (1997)Psychiatry Clin.Neurosci.51,135-138.Stimulation of monocytesand microglia with Amyloid-β protein (A β) induces chemokine secretion invitro (Meda, L. , et al., (1996)J Immunol 157，1213-1218;Szczepanik, A. M.，etal. , (2001) J NeuroimmunoI. 113,49-62)并且Αβ (1-42)脑室内浸润到小鼠海马中显著增加体内MCP-1。另外，Αβ沉积吸引和激活小神经胶质细胞并且使它们产生炎性介质如MCP-1，MCP-1接着导致反馈以诱导进一步的趋化、激活和组织损伤。在Αβ沉积部位，激活的小神经胶质也吞曬Αβ肽,导致放大的激活(Rogers, J. and Lue, L. F. (2001)Neurochem.Int. 39, 333_340)。
在AD的3xTg小鼠模型中检查趋化因子表达揭示了神经元炎症在斑形成之前，以及MCP-I被上调11倍。另外，MCP-I的上调似乎与第一个细胞内Αβ沉积的发生相关(Janelsins, M. C. , et al. , (2005) J Neuroinf lammation. 2，23) qAD 的 Tg2575 小鼠模型与过表达MCP-I的小鼠模型的杂交育种显示与单转基因Tg2576同窝出生仔畜相比，示出在A β沉积周围的增加的小神经胶质积累，并且这个积累伴有增加量的扩散斑(Yamamoto，Μ.，etal. (2005) Am. J Pathol. 166，1475-1485)。MCP-I水平在AD患者及显示轻度认知损害(MCI)患者的CSF中增加(Galimberti, D.，et al.，(2006) Arch. Neurol. 63，538-543)。另外，MCP-I 显示在具有MCI 和早期 AD 的患者血清中水平增加(Clerici, F. , et al. , (2006) Neurobiol. Aging27， 1763-1768)。粥样硬化病变限制或阻碍冠状动脉血流，是缺血性心脏病相关死亡率的主要原因，导致每年500，000-600, 000例死亡。在1996年在美国有超过550，000个患者及在世界范围内有超过945,000个患者进行了经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)以打开阻塞的动脉·(Lemaitre et al.，1996)。这项技术的一个主要限制是PTCA后血管闭塞问题，在PTCA后立即发生(急性闭塞)和长期(再狭窄):30%的具有次全部损害(subtotal lesions)的患者和50%的具有慢性全部损害的患者在成形术后会发生再狭窄。另外，再狭窄是经历隐静脉旁路移植术的患者中的显著问题。急性闭塞的机理似乎涉及若干因素并且可能来自血管回弹(vascular recoil),导致动脉闭塞和/或血小板沿新打开的血管的损伤长度沉积，随后形成纤维蛋白/红细胞血栓。血管成形术后再狭窄是一种更逐渐的过程并且涉及亚临界血栓的初始形成，伴有从粘附的血小板释放细胞衍生生长因子，随后内膜平滑肌细胞增殖及炎性细胞局部浸润，促使血管增生。重要的是注意到血栓、细胞增殖、细胞迁移和炎症之中的多个过程每个均看起来促使所述再狭窄过程。在美国，30-50%再狭窄率意味着120，000-200，000个美国患者处于再狭窄风险中。如果仅80%的这些患者选择重复血管成形术(剩余20%选择冠状动脉旁路移植术)，这增加了剩余20%的冠状动脉旁路移植术的费用，再狭窄的总费用很容易达到几十亿美元。因此，成功预防再狭窄不仅可以带来显著治疗益处而且显著节约卫生保健成本。尽管不清楚升高的MCP-I表达是否是上述疾病的原因或结果，但是在一些动物模型中获得了应用MCP-I中和抗体或MCP-I受体(CCR2)拮抗剂的治疗益处。在这种情况中，重要的是注意到缺失N-末端区域的氨基酸1-8完全消除了MCP-I激动剂受体活性，清楚表明氨基末端区域对于受体激活是关键的(Gong，J.-H.and Clark-Lewis, I. (1995) J Exp. Med. 161 631-40, Van Damme, J. , et al. , (1999) ChemImmuno172, 42-56)。另外，直至残基9的任何N-末端MCP-I截短均产生具有MCP-I受体拮抗活性的分子。所有现有监测MCP-I水平的测定不能区分NlpE MCP-UNlQ MCP-I和相继N-末端截短的分子。因此它们不反映由全长MCP-I对合适受体(CCL2、CCL5)的实际激动剂刺激程度与拮抗性有效的N-末端截短的或完全失活的MCP-I分子的水平的关系。在体液内，仅可检测到全长MCP-I的N-末端焦谷氨酰修饰的种类。原因是N-末端未修饰分子被定居遍在的氨基肽酶二肽基氨基肽酶4(DP4、DPP4、DPPIV、⑶26)和氨基肽酶P (APP、X-脯氨酰氨基肽酶)快速N-末端降解，分别释放N-末端二肽Gln-PiO或者氨基酸谷氨酰胺。因此其结论是，建立展示活性CCR2受体激动性MCP-I分子的真实水平的测定提供了益处，能改善诊断应用，监测治疗方法及开发与可能涉及MCP-I的疾病或者干扰有关的QC抑制剂。 谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺残基的分子内环化成为焦谷氨酸(pyroglutamate, pGlu, pE),释放氨。QC首先由Messer在1963年从热带植物番木瓜(Carica papaya)的胶乳中分离(Messer, M. 1963Nature 4874,1299)。24年后，相应的酶活性在动物脑垂体中发现(Busby，W. H. J. et al. 1987 J BiolChem 262,8532-8536;Fischer, ff. H. and Spiess,J.1987Proc Natl Acad Sci U S A84，3628-3632)。对于哺乳动物QC，由QC将Gln转化为pGlu可以在TRH和GnRH前体中示出(Busby，W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, ff. H. andSpiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci USA 84,3628-3632)。另外，QC 的初始定位实验揭示与其在牛脑垂体中的推测的催化产物的共定位，进一步改善在肽激素合成中的推测功能(Bockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7,445-453)。相反。植物 QC 的生理学功能不太清楚。在来自番木瓜的酶的情况中，推测了在抗病原微生物的植物防御中的作用(ElMoussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58,556-570)。来自其它植物的推测的 QC最近通过序列比较而鉴别(Dahl, S. ff. et al. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。但是这些酶的生理学功能尚不明确。植物和动物中已知的QC显示显示出对底物的N-末端位置的L-谷氨酰胺的严格特异性并且发现它们的动力学行为遵守Michaelis-Menten方程(Pohl，T. et al. 1991Proc Natl Acad Sci USA 88,10059-10063;Consalvo, A. P. et al.1988 Anal Biochem175，131-138;Gololobov, Μ· Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377,395-398)。但是，将来自番木瓜的QC和来自哺乳动物的高度保守的QC的一级结构相比并不揭示任何序列同源性(Dahl, S. ff. et al. 2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。尽管植物 QC 似乎属于新的酶家族(Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20，27-36)，但是发现哺乳动物QC与细菌氨基肽酶具有显著序列同源性(Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry40，11246-11250)，导致来自植物和动物的QC具有不同的进化起源的结论。最近，已示出重组人类QC以及来自脑提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰基及谷氨酸环化。最惊人的发现是环化酶催化的Glul-转化在大约pH6. O是有利的，而Glnl-转化为pGlu衍生物发生在大约8. O的pH最佳值。因为pGlu-Αβ -相关肽的形成可以通过重组人类QC和来自猪脑垂体提取物的QC活性的抑制而抑制，酶QC是用于治疗阿尔茨海默病的药物开发中的靶。QC的抑制剂也可以用作QC同工酶的抑制剂，它们在W02004/098625、WO2004/098591、W0 2005/039548和WO 2005/075436中描述，这些文献全文援引加入本文，特别是关于抑制剂的结构、它们的用途及它们的生产。用于检测和定量N-末端焦谷氨酸修饰的趋化因子的MCP-lNlpE特异性抗体在国际专利申请PCT/EP2009/060757中描述。本发明人现在发现测量样品中与MCP-I总浓度相关的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的比例提供了一种有效方法，用于诊断或监测炎性疾病或者炎性相关疾病。发明概述根据本发明的第一个方面，提供了诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病的方法，其包括确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。根据本发明的第二个方面，提供了确定谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂在生物学样品内以及作为应用QC抑制剂的治疗中谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制的替代标记(surrogate marker)的效力的方法。根据本发明的第三个方面，提供了确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例的方法，其包括下述步骤 (a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的第一浓度(Ca)；(b)确定所述生物学样品中总MCP-I的第二浓度(Cd);和(c)确定ca/cd的比率,其中第一浓度(Ca)值除以第二浓度(Cd)值。附图简述图I :来自不同物种的成熟MCP-1 (CCL2)蛋白的序列对比。序列对比是用http://www. ch. embnet. org/software/Clustalff. html 提供的 CLUSTAL W(I. 83)多序列对比算法进行。这些序列是人类人类MCP-1 SEQ ID NO: I，chimp :黑猩猩MCP-1 SEQ IDNO: 2, oran :苏门答腊猩猩(Sumatran orang-utan) MCP-1 SEQ ID NO: 3, macac Macacafascicularis (食蟹猴)MCP-1 SEQ ID N0:4，犬Canis familiar is MCP-1 SEQ ID N0:5,猪Sus scrofa MCP-1，SEQ ID N0:6,牛Bos taurus MCP-1，SEQ ID N0:7,马EquuscabalIus MCP-1, SEQ ID N0:8,小鼠Mus musculus MCP-1, SEQ ID N0:9,大鼠Rattusnorvegicus MCP-1, SEQ ID NO:10。图2 :四种人类MCP的对比。序列对比用http://www. ch. embnet.org/software/Clustalff. html 提供的 CLUSTAL W(1.83)多序列对比算法进行。这些序列是MCP-I:人类 MCP-1 (CCL2, SCYA2, MCAF, SMC-CF, GDCF-2, HCll SEQ ID NO: I, MCP-2:人类 MCP-2 (CCL8, SCYA8, HC14)，SEQ ID NO: 11 ；MCP-3:人类 MCP-3 (CCL7, SCYA7, NC28, FIC, MARC)，SEQ ID NO:12 ；MCP-4:人类MCP-4 (CCL13, SCYA13, NCC-1, CKblO), SEQ ID NO: 13。黑体 N-末端残基表示信号序列，其在成熟趋化因子中被去除。箭头标记由谷氨酰胺酰基环化酶催化形成焦谷氨酰衍生物的新生N-末端谷氨酰胺残基。图3 :显示携带N-末端谷氨酰胺酰残基的MCP-I (1-76)与重组人类DP4保温24小时。DP4裂解产物在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。图4 :显示携带N-末端焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基的MCP-I (1-76)与重组人类DP4保温24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-I在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。裂解在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。图5 :示出携带N-末端谷氨酰胺酰残基的人类MCP-I (1-76)被重组人类氨基肽酶P裂解24小时。APP裂解产物在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图6 :示出携带N-末端焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基的人类MCP-1 (1-76)被重组人类氨基肽酶P裂解24小时。N-末端焦谷氨酸形成通过在测定前将MCP-I与重组人类QC保温3小时实现。APP裂解在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。图7 :示出携带N-末端谷氨酰胺酰残基(A)或者焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基(B)的人类MCP-I (1-76)在人类血清中分别降解7和24小时。为了将N-末端谷氨酰胺残基环化成焦谷氨酸，MCP-I在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。另外，Gln1-MCP-I在人类血清中在9. 6μ M DP4抑制剂异亮氨酰-Thiazolidide (Ρ32/98)存在下保温24小时(C)。对于Gln1-MCP-I,裂解产物在O分钟、10分钟、30分钟、I小时、2小时、3小时、5小时和7小时后分析，对于PGIu1-MCP-I，裂解产物在O分钟、30分钟、I小时、2小时、3小时、5小时、7小时和24小时后分析，对于Gln1-MCP-I与异亮氨酰-Thiazolidide组合，裂解产物在O分钟、I小时、2小时、3小时、5小时、7小时和24小时后分析，分析使用Maldi-TOF质谱进行。图8 :示出携带N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基(B)的人类MCP-2(l-76)由重组人类DP4降解24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-2在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。图9 :示出携带N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基(B)的人类MCP-3(l-76)由重组人类DP4降解24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-3在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图10 :示出携带N-末端谷氨酰胺酰(A)或焦谷氨酰(5-氧代-L-脯氨酰)残基(B)的人类MCP-4(l-75)由重组人类DP4裂解4小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨 酸，MCP-4在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在O分钟、15分钟、30分钟、I小时、2小时和4小时后用Maldi-TOF质谱分析。图11 :示出起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-1 (Glnl-MCP-I)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-1 (pGlul-MCP-1)对人类THP-I单核细胞的趋化能力(A)，起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-2(Glnl-MCP-2)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-2 (pGlul-MCP-2)对人类THP-I单核细胞的趋化能力(B)，起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-3(Glnl-MCP-3)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-3 (pGlul-MCP-3)对人类THP-I单核细胞的趋化能力(C)，以及起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-4(Glnl-MCP-4)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-4(pGlul-MCP-4)对人类THP-I单核细胞的趋化能力(D)。图12 :显示人类MCP-I对人类THP-I单核细胞的趋化能力的分析，其是与人类重组DP4在存在(Gld-MCP-l+QC+DP^和不存在(Glr^-MCP-l+DPAQC介导的pGlu形成的情况下保温。另外，示出了 QC抑制剂-1-(3-(1Η-咪唑-I-基)丙基)-3-(3，4_ 二甲氧基苯基)硫脲盐酸盐(QCI) (10 μ Μ)对N-末端pGlu残基形成的影响，及随后的DP4裂解(Gln1-MCP-l+QC+QCI+DP4)。
图13 :显示起自N-末端谷氨酰胺的全长人类MCP-1 (A)、MCP-3⑶、MCP_2 (C)和MCP-4(D)相比于它们各自DP4裂解产物对人类THP-I单核细胞的趋化能力。图14 :用于基于在450nm/540nm测量的吸收值确定A :总hMCP_l和B hMCP-1 NlpE浓度的标准曲线。对于两个标准曲线,使用在大肠杆菌中产生的重组hMCP-1 NlpE0标准曲线是通过 4-Parameter-Logistic-Fit :y=(A2+(Al_A2)/ (1+(χ/χ0) 'p)从测量的吸收数据计算的。图15 :在总 hMCP-1 夹心 ELISA 中 hMCP-lNlpE 和 hMCP-1 的检测比较。图16 :在用OSM和ILl β刺激后由NHDF对总hMCP_l和hMCP-ΙΝΙρΕ的时间依赖性表达。图17 :在用 0SM+IL1 β 刺激及施加 QCI 后由 NHDF 对 A :总 hMCP-Ι 和 B hMCP-lNlpE 的时间依赖性表达。C :hMCP-lNlpE/hMCP-l的比率。图18 :A :在用TNFa+ILlii刺激及施加不同QCI浓度后由A549细胞表达的总hMCP-Ι 和 hMCP-lNlpE。B hMCP-lNlpE/hMCP-l 的比率。图19 :用于确定小鼠MCP-I的标准曲线；基于在450nm/540nm测量的吸收值的A 总mMCPl浓度和B mMCP-lNlpE浓度。对于两个标准曲线，使用在大肠杆菌中产生的重组小鼠 MCP-lNlpE。标准曲线是通过 4-Parameter-Logistic-Fit: y= (A2+ (A1-A2) / (1+ (x/xQ) 'p)从测量的吸收数据计算的。图 20 :在总 mMCP-1 夹心 ELISA 中 mMCP-lNlpE 和 mMCP-1 的检测比较。图21 A :在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI浓度后由RAW 264. 7细胞表达的总 mMCP-1 和 mMCP-lNlpE。B mMCP-lNlpE/mMCP-l 的比率。图22 :在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI后在RAW 264.7细胞的细胞培养上清中如下的Western印迹信号A mMCP-lNlpE和B 总mMCP-1。C 由ELISA确定的mMCP-lNlpE 浓度。图23 A :在用硫代乙醇酸盐刺激和施加不同QCI浓度后在小鼠腹腔灌洗液中总mMCP-1和mMCP-lNlpE的量。B =FACS分析在用抗7/4和Ly6G抗体在腹腔灌洗液中进行双重单核细胞染色后的荧光事件。图24 :用于确定小鼠MCP-lNlpE的标准曲线；A :由MCP-lNlpE抗体克隆348/2C9对mMCP-lNlpE的检测，B :由生物素化MCP-lNlpE抗体克隆348/2C9对mMCP-lNlpE的检测。对于两个标准曲线，使用在大肠杆菌中产生的重组小鼠MCP-lNlpE ο 标准曲线是通过 4-Parameter-Logistic-Fit: y= (A2+ (A1-A2) / (1+ (χ/X0) ~ρ)从测量的吸收数据计算的。图25 :等温滴定量热法测定针对抗原hMCP-1 (1-38)的抗MCP-lNlpE抗体(A MCP-1 NlpE 抗体 348/2C9 及 B :生物素化 MCP-lNlpE 抗体 348/2C9)。图26 :经ELISA测量来自10个健康志愿者的CSF和血清样品中人类MCP-1和人类 MCP-lNlpE。序列表简述表I :序列表
权利要求
1.诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病或其对治疗的应答的方法，包括确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。
2.权利要求I的方法，其中所述确定包括如下步骤 (a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的第一浓度(Ca)； (b)确定所述生物学样品中总MCP-I的第二浓度(Cd);及 (c)确定ca/cd的比率，其中第一浓度(Ca)的值除以第二浓度(Cd)的值。
3.权利要求2的方法，其中ca/cd比率是50%,70%或85%。
4.权利要求2的方法，其中步骤(a)包括 i)将生物学样品与特异于MCP-I的捕获抗体接触， )施加特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的检测抗体， iii)检测所得的免疫复合物，及 iv)定量捕获的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I复合物。
5.权利要求4的方法，其中特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的检测抗体包括由选自下组的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体 348/1D4 (保藏号 DSM ACC 2905); 348/2C9 (保藏号 DSM ACC 2906); 332/4B8 (保藏号 DSM ACC 2907);和 332/4F8 (保藏号 DSM ACC 2908)。
6.权利要求5的方法，其中特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的检测抗体包括由选自348/2C9 (保藏号DSM ACC 2906)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
7.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括 i)将生物学样品与特异于MCP-I的捕获抗体接触， ii)施加特异于MCP-I的检测抗体， iii)检测所得的免疫复合物，及 iv)定量捕获的MCP-I复合物。
8.权利要求7的方法，其中特异于MCP-I的捕获抗体包括 多克隆抗血清山羊抗 hMCPl-AF(R&D Systems, Minneapolis, USA)兔多克隆抗 MCP-I 抗体 abl8072 (Abeam, Cambridge, UK);兔多克隆抗 MCP-1 抗体 ab9669 (Abeam, Cambridge, UK);兔多克隆抗 MCP-1 抗体 abl8072 (Abeam, Cambridge, UK);山羊 MCP-1 抗体(C-17) : sc-1304 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA);多克隆抗血清兔抗 mJE (Peprotech, Hamburg, Germany);兔多克隆抗 mMCP-1 抗体 ab9899 (Abeam, Cambridge, UK); 兔多克隆抗 MCP-1 抗体 ab7202 (Abeam, Cambridge, UK);和 大鼠单克隆 MCP-1 抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, USA)。
9.权利要求8的方法，其中特异于MCP-1的捕获抗体包括多克隆抗血清山羊抗hMCPl-AFο
10.权利要求7的方法，其中特异于MCP-I的检测抗体包括小鼠抗 hMCP-1 (Peprotech, Hamburg, Germany); 小鼠单克隆抗 MCP-1 抗体 abl7715 (Abeam, Cambridge, UK);小鼠单克隆 MCP-1 抗体 sc-32819 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA);抗小鼠 MCP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN USA);仓鼠单克隆 MCP-1 抗体 ab21397 (Abeam, Cambridge, UK); 大鼠单克隆 MCP-1 抗体 ab8101 (Abeam, Cambridge, UK);和 大鼠单克隆 MCP-1 抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, USA)。
11.权利要求4-10任一项的方法，其中复合物的检测通过使用与每个检测抗体特异性反应的二抗进行。
12.权利要求11的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗体或抗兔抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗体。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述二抗是被标记的。
15.权利要求14的方法，其中所述二抗是用辣根过氧化物酶(HRP)标记的。
16.权利要求4-15任一项的方法，其中定量检测的免疫复合物。
17.权利要求4-16任一项的方法，其中捕获的复合物用选自下组的定量手段定量ELISA，如间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、反向ELISA、酶联免疫吸附斑点测定；流式细胞术；多重测定系统；免疫组织化学；免疫沉淀；及Western印迹分析。
18.权利要求17的方法，其中用夹心ELISA作为定量手段定量捕获的复合物。
19.权利要求1-18任一项的用途或方法，其中生物学样品选自血液、血清、尿、脑脊液(CSF)、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、眼泪、胆汁和胰腺分泌物。
20.权利要求19的方法，其中生物学样品是血清。
21.确定谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂在生物学样品内的效力以及作为应用QC抑制剂的治疗中谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制的替代标记的效力的方法。
22.确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例的方法，包括如下步骤 (a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的第一浓度(Ca)； (b)确定所述生物学样品中总MCP-I的第二浓度(Cd);及 (c)确定ca/cd的比率，其中第一浓度(Ca)的值除以第二浓度(Cd)的值。
23.筛选谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的方法，包括如下步骤 (a)保温包含MCP-I和谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的对照样品以及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例； (b)将具有包含MCP-I和谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的混合物的对照样品与谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂一起保温及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例； 从而步骤(b)中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I:总MCP-I的比率相对于步骤(a)中的降低指示谷氨酰胺酰基环化酶抑制。
24.测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的效力的方法，包括将谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂与包含MCP-I和谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的混合物保温，及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。
25.用于诊断炎性疾病或炎性相关疾病的试剂盒，其包括特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I的捕获抗体，特异于MCP-I的捕获抗体，以及根据权利要求1-20任一项的方法使用所述试剂盒的说明。
26.—种在患有、怀疑患有或有倾向患有炎性疾病或炎性相关疾病的对象中监测治疗的效力的方法，包括根据权利要求1-20任一项所述确定在来自测试对象的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。
27.权利要求1-20或26任一项所述的诊断或监测方法，其包括确定在两或多种场合从测试对象取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。
28.权利要求27所述的诊断或监测方法，其包括比较在两或多种场合取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-I相对于MCP-I总浓度的比例。
29.前述任一项权利要求的用途、方法或试剂盒，其中炎性疾病或炎性相关疾病选自神经变性疾病、慢性和急性炎症、纤维化、癌症、代谢疾病、与高胰岛素血症和肥胖相关的其它炎性疾病或病理。
30.权利要求29的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、胰腺炎、阿尔茨海默病、肺纤维化、肾纤维化、妊娠中毒、移植物排斥、神经性疼痛、糖尿病肾病、结肠炎、中风、AIDS和肿瘤。
31.权利要求29或30的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、再狭窄和胰腺炎。
32.权利要求29-31任一项的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断阿尔茨海默病或类风湿性关节炎。
全文摘要
本发明涉及用生物学样品中的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1(MCP-1N1pE)∶MCP-1总浓度的比率作为生物标记监测炎性疾病或炎性相关疾病的治疗的方法，进一步涉及确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的新方法。本发明还提供了诊断试剂盒和筛选谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂或测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂效力的方法。
文档编号G01N33/68GK102947705SQ201180009956
公开日2013年2月27日 申请日期2011年2月18日 优先权日2010年2月18日
发明者H·辛尼斯, M·克莱因施密特, K·甘斯, J-U·拉费尔德, H-U·德穆特, N·陶特 申请人:前体生物药物股份公司