专利名称：类风湿性关节炎的检查方法及类风湿性关节炎检查用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及类风湿性关节炎的检查方法、及用于该检查方法的类风湿性关节炎检查用试剂盒。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis RA)是以关节的滑膜组织为病变主要部位的慢性炎症性疾病，患病率占人口的约I %。类风湿性关节炎，在其初期导致滑膜炎，随后侵袭软骨/骨，恶化时关节被破坏发生变形。另外，症状的经过而言，有关节炎反复缓解/复发、痊愈例或急速恶化例等多种情况。虽然类风湿性关节炎的诊断主要通过症状来进行，但近年来，以患者血清中所含的自身抗体为标志物的诊断方法受到关注。作为这样的自身抗体，已知有类风湿因子(rheumatoid factor)(针对变性IgG的自身抗体)、抗环状瓜氨酸化肽抗体(抗CCP抗体)等(参见非专利文献I)。然而，在迄今为止的报道中，类风湿因子的灵敏度为75 80%、特异性为50 70 %，抗CCP抗体的灵敏度为50 75 %、特异性为85 95 %，不一定能满足需要(参见非专利文献2、3)。非专利文献I :Martinus A. Μ.等，Arthritis Res. Ther. , 4 :87-93, 2002非专利文献2 =Avouac J.等，Ann. Rheum. Dis. 65 :845-851，2006非专利文献3 van Venrooij WJ.等 Ann. N. Y. Acad. Sci. 1143 :268-285,2008
发明内容
因此，本发明的目的在于，基于探索迄今未知的新型标志物从而发现的新型标志物，提供类风湿性关节炎的检查方法及类风湿性关节炎检查用试剂盒。已知在类风湿性关节炎患者中，血中的淋巴细胞被活化、与血管内皮细胞的细胞附着亢进，同时淋巴细胞游走也发生亢进，结果导致淋巴细胞浸润至血管外，该浸润淋巴细胞引起多种炎症。因此，本发明人在探索新型标志物时，着眼于主要集中在细胞与基质附着的区域、尤其是淋巴细胞内细胞附着区域表达的作为高分子细胞骨架蛋白质的踝蛋白(Talin)。踝蛋白是由包含FERM区域的分子量47kDa的N末端区域、和由一束α螺旋形成的分子量190kDa的C末端区域构成的蛋白质。FERM区域从N末端侧进一步分为Fl结构域(domain)、F2结构域、F3结构域三个亚区域。已知在生物体内被I丐蛋白酶(Calpain)剪切下的N末端区域的多肽其中F3结构域与整联蛋白β亚基结合，增强整联蛋白的从细胞内向细胞外的信号传递，使细胞附着或细胞游走亢进。本发明人对类风湿性关节炎患者的血浆或血清中踝蛋白的存在进行了研究。结果意外地发现，类风湿性关节炎患者中，踝蛋白在血浆或血清中以优势地位存在。而且发现，当通过类风湿性关节炎治疗药实现类风湿性关节炎的低疾病活动性或缓解时，踝蛋白量显著降低。本发明是基于上述见解完成的，具体如下所述。(I) 一种类风湿性关节炎的检查方法，其中，包括测定受试动物的血浆中或血清中的踝蛋白量的步骤。(2)上述⑴所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，进一步包括从由上述受试动物采集的血液中得到血浆或血清的步骤。 (3)上述⑴或⑵所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，使用与踝蛋白结合的抗体，测定上述血浆中或血清中的踝蛋白量。(4)上述(I) (3)中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，上述受试动物是人。(5)上述⑴ (4)中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法，是为了诊断类风湿性关节炎或判断类风湿性关节炎治疗药的治疗效果而进行的。(6) 一种类风湿性关节炎检查用试剂盒，用于在上述(I) (5)中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法中使用。(7)上述(6)所述的类风湿性关节炎检查用试剂盒，包含固定有与踝蛋白结合的抗体的固相载体。通过本发明，可提供新型的类风湿性关节炎的检查方法、及该检查方法中使用的类风湿性关节炎检查用试剂盒。
[图I]为表示利用使用了H-18抗体及H-300抗体的夹心ELISA法进行的类风湿性关节炎诊断(实施例I)的ROC曲线的图。[图2]为表示利用使用了H-18抗体及M54246M抗体的夹心ELISA法进行的类风湿性关节炎诊断(实施例2)的ROC曲线的图。[图3]为表示使用了抗CCP抗体的类风湿性关节炎诊断(比较例I)的ROC曲线的图。
具体实施例方式〈类风湿性关节炎的检查方法〉本发明涉及的类风湿性关节炎的检查方法包括测定受试动物的血浆中或血清中的踝蛋白量的步骤。该检查方法还可进一步包括从由受试动物采集的血液中得到血浆或血清的步骤。作为受试动物，只要是可患有类风湿性关节炎的动物就没有特别限制，可根据目的选择。例如，可举出人、大鼠、小鼠、狗、牛、猫、兔、豚鼠等，其中优选人。另外，对于取得血浆及血清的方法没有特别限制，可按照现有公知的方法、例如作为临床检查用样品从血液中取得的血浆、血清的分离方法进行。例如，可通过用EDTA管或肝素管等采集血液、并对其进行离心分离来得到血浆。另外，可通过将血液采集至试管等并进行离心分离来得到血清。
本发明涉及的类风湿性关节炎的检查方法中，测定如上所述得到的血浆中或血清中的踝蛋白量。此处，“踝蛋白量”是指踝蛋白的蛋白质的量。当踝蛋白具有多种同工型(isoform)时,可测定其中任一种。例如，在人的情况下，存在踝蛋白I、踝蛋白2两种同工型。踝蛋白I的mRNA序列、氨基酸序列分别如序列号1、2所示。另外，踝蛋白2的mRNA序列、氨基酸序列分别如序列号3、4所示。受试动物的血浆中或血清中的踝蛋白量可利用免疫化学方法、使用与踝蛋白结合的抗体进行测定。与踝蛋白结合的抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，根据情况，可使用抗体的片段，例如Fab’、Fab、F (ab’)2。这些抗体可利用现有公知的方法制备。作为市售品，可举出H-18抗体(Santa Cruz · Biotechnology公司)、H-300抗体(Santa Cruz Biotechnology 公司)、TA205 抗体(Abeam 公司)、M54246M 抗体(Biodesign公司)等。踝蛋白量的测定可采用公知的酶免疫分析(EIA)、化学发光免疫分析、放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析、胶乳凝集法等方法来实施。具体而言，可举出例如使用抗体及标记抗原的竞争法、组合使用针对抗原的识别部位不同的两种单克隆抗体或多克隆抗体(或单克隆抗体及多克隆抗体)的夹心EIA法、使用固定有抗体的胶乳粒子的胶乳凝集法等。在这些测定法中，根据需要，可将抗原或抗体固定在适当的固相载体上。作为固相载体，可举出例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯酸酯、尼龙、聚缩醛、含氟树脂等合成树脂，纤维素、琼脂糖等多糖类，玻璃、金属等。上述固相载体可形成微孔板状、球状、纤维状、棒状、盘状 、容器状、盒状(cell)、试管等多种形状。上述那样的免疫化学方法中，抗体或抗原根据需要使用经标记的物质。作为所述标记，可举出酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、发光物质(吖啶酯、异氨基苯二酰肼、荧光素等)，此外，可举出放射性同位素(124I、14C、3H)、荧光物质(异硫氰酸荧光素等)等。此外，还可采用组合生物素标记和链亲和素来使用的方法。通过如上所述对受试动物血浆中或血清中的踝蛋白量进行测定、定量，可简便地诊断是否罹患类风湿性关节炎。即，血浆中或血清中的踝蛋白量高于规定的阈值时，可判断为罹患类风湿性关节炎。所述规定的阈值例如可基于未患有类风湿性关节炎的对照动物的血浆或血清中的平均值等设定。另外，通过对给予类风湿性关节炎治疗药前后的踝蛋白量进行测定、定量，可简便地判断该治疗药的治疗效果。即，如果给予类风湿性关节炎治疗药之后的踝蛋白量与给药之前的踝蛋白量相比显著降低，则判断该治疗药是有效的。此处，作为类风湿性关节炎治疗药，可包括现有公知的治疗药以及今后开发出的所有治疗药。作为现有公知的类风湿性关节炎治疗药，可举出例如生物学制剂、非留体性抗炎药(消炎镇痛药)、留体药、免疫抑制剂等。作为生物学制剂，可举出例如嵌合型抗TNF-α抗体制剂、可溶性TNF受体、或完全人型抗TNF-α抗体制剂、抗IL-6受体抗体制剂等。作为非留体性抗炎药，可举出前列腺素产生抑制剂，其被认为虽可减轻关节疼痛或肿胀，但难以抑制疾病自身的恶化和骨、关节的破坏。甾体药由于其优异的抗炎效果而作为类风湿性关节炎的特效药被利用，但其副作用也是问题。免疫抑制剂通过改善类风湿性关节炎患者的免疫异常来抑制类风湿性关节炎的炎症，其目的是诱导缓解，存在遏制类风湿性关节炎恶化的可能性，因此也被称为疾病修饰性抗风湿药。由于效果表现需要时间，所以也被称为迟效性抗风湿药。虽然如上所述存在多种类风湿性关节炎治疗药，但为了判定治疗药的效果的程度、选择最有效的治疗药，本发明涉及的检查方法是有用的。<类风湿性关节炎检查用试剂盒>本发明涉及的类风湿性关节炎检查用试剂盒，用于在本发明涉及的类风湿性关节炎的检查方法中使用。该诊断用试剂盒中，例如，包含固定有与踝蛋白结合的抗体的固相载体。另外，还可包含经标记的二抗和显色基质等。实施例·
以下，利用实施例详细地说明本发明，但如下记载不作任何限制本发明的解释。需要说明的是，以下的实施例1，2、比较例I中，以类风湿性关节炎患者(RA患者)17例、对照14例(变形性关节症患者8例、全身性红斑狼疮患者I例、糖尿病患者I例、健康人4例)为受试者。另外，以下的实施例3中，以RA患者5例为受试者。<实施例1>将各受试者的血液采集至EDTA管中，在室温下以2500rpm的转速进行10分钟的离心分离，由此得到血浆。利用夹心ELISA法测定上述血浆中的踝蛋白量。首先，用磷酸缓冲液(PBS)将识别踝蛋白的N末端的H-18抗体(SantaCruz · Biotechnology公司)稀释为I μ g/mL,然后按照100 μ L/孔的量加入到96孔微孔板中，在4°C下孵育一夜，然后用200 μ L/孔的洗涤液洗涤3次。接下来，将各受试者的血浆按照100 μ L/孔的量加入到96孔微孔板中，在25°C下孵育I小时，然后用200 μ L/孔的洗涤液洗涤3次。接下来，用PBS稀释作为一抗的识别踝蛋白的N末端的Η-300抗体(SantaCruz · Biotechnology公司)，使其为2 μ g/mL,然后按照100 μ L/孔的量加入到96孔微孔板中，在25°C下孵育I小时，用200 μ L/孔的洗涤液洗涤3次。接下来，用PBS稀释作为二抗的HRP标记抗山羊IgG抗体(KPL公司)，使其为2 μ g/mL,按照100 μ L/孔的量加入到96孔微孔板中，在25°C下孵育I小时，然后用200μ L/孔的洗涤液洗涤3次。接下来，按照100 μ L/孔的量将基质加入到96孔微孔板中，在25°C下孵育15分钟，然后使用酶标仪测定波长630nm的OD值。实施例I的ROC曲线如图I所示。ROC分析的结果，图I的ROC曲线下面积(AUC)为0. 954。另外，以OD = 0. 20为界限值时的阳性、阴性分别如下表I所示。[表 I]
RA患者对照合计 —
,、^14O14
H-·抗体阴性3H -17_ 合计 I 17 I 14 I 31 —由该结果可知，利用使用了 H-18抗体及H-300抗体的夹心ELISA法进行的类风湿性关节炎诊断的灵敏度为14/17X100 = 82.4%，特异性为14/14X100 = 100%。<实施例2>
除了使用识别踝蛋白的C末端的M54246M抗体(Biodesign公司)作为一抗之外，与实施例I同样地操作，利用夹心ELISA法测定血浆中的踝蛋白量。实施例2的ROC曲线如图2所示。ROC分析的结果，图2的ROC曲线下面积(AUC)为O. 819。另外，以OD = O. 05为界限值时的阳性、阴性分别如下表2所示。[表2]
权利要求
1.一种类风湿性关节炎的检查方法，其中，包括测定受试动物的血浆中或血清中的踝蛋白量的步骤。
2.如权利要求I所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，进一步包括从由所述受试动物采集的血液中得到血浆或血清的步骤。
3.如权利要求I或2所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，使用与踝蛋白结合的抗体，测定所述血浆中或血清中的踝蛋白量。
4.如权利要求I 3中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法，其中，所述受试动物是人。
5.如权利要求I 4中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法，是为了诊断类风湿性关节炎或判断类风湿性关节炎治疗药的治疗效果而进行的。
6.一种类风湿性关节炎检查用试剂盒，用于在权利要求I 5中任一项所述的类风湿性关节炎的检查方法中使用。
7.权利要求6所述的类风湿性关节炎检查用试剂盒，包含固定有与踝蛋白结合的抗体的固相载体。
全文摘要
本发明涉及新型的类风湿性关节炎的检查方法、及用于该检查方法的类风湿性关节炎检查用试剂盒。本发明涉及的类风湿性关节炎的检查方法的特征在于，包括测定受试动物的血浆中或血清中的踝蛋白量的步骤。该测定例如可利用使用了与踝蛋白结合的抗体的免疫学手段进行。本发明涉及的类风湿性关节炎检查用试剂盒用于在上述检查方法中使用，例如，包含固定有与踝蛋白结合的抗体的固相载体。
文档编号G01N33/564GK102971631SQ20118002413
公开日2013年3月13日 申请日期2011年6月14日 优先权日2010年12月15日
发明者津坂宪政 申请人:株式会社凯蒂生物