专利名称：抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法
技术领域：
本发明涉及对生腱蛋白-C A2结构域(A2domain of tenascin-C, TNC A2)特异性的抗体。另外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸，及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成该抗体的方法和在疾病的治疗中使用它们的方法。
背景技术：
生腱蛋白C和抗生腱蛋白C抗体生腱蛋白是在脊椎动物中找到的，较大多聚体细胞外基质(ECM)糖蛋白的一个高度保守的家族。已经在哺乳动物中鉴定出四种生腱蛋白旁系同源物(paralogue)，称作生腱蛋白-C、生腱蛋白-R、生腱蛋白-X和生腱蛋白-W。生腱蛋白家族蛋白质共同的一级结构，其包含N端七段重复、表皮生长因子(EGF)样重复、纤连蛋白III型结构域重复和C端纤连蛋白样球状结构域。经由N段寡聚化结构域，亚基个体装配成三聚体，或在生腱蛋白-C的情况中，装配成六聚体。
哺乳动物生腱蛋白-C单体通常具有由所有生腱蛋白-C同等型共享的14.5个EGF样重复和8个纤连蛋白III型结构域重复。然而，通过可变剪接，能独立包括或排除多至9个另外的纤连蛋白III型结构域重复(结构域Al至D)，产生多种生腱蛋白-C同等型(参见例如 Hsia and Schwarzbauer, J Biol Chem280, 26641-26644 (2005))。生腱蛋白-C在发育的胚胎中瞬时表达，但是在成年组织中实际上缺失。然而，它在经历重塑过程的组织中再现，包括某些病理状况，诸如伤口愈合、炎症和癌症(综述Chiquet-Ehrismann&Chiquet, J Pathol200, 488-499(2003))。重要的是，生腱蛋白-C在大多数恶性实体瘤中高度表达，包括脑、乳房/乳腺、结肠、肺、皮肤和其它器官的肿瘤(综述Orend and Chiquet-Ehrismann, CancerLetters244, 143-163 (2006))，在那里它可以由转化的上皮细胞以及肿瘤微环境中的基质细胞表达(Yoshida et al., J Pathol 182，421-428 (1997)，Hanamura et al., Int JCancer73, 10-15(1997))。特别地，含有可变剪接结构域Al至D的生腱蛋白-C “较大同等型”在侵入性癌瘤中表达，而在健康成年组织中几乎检测不到(Borsi et al.，Int J Cancer52, 688-692(1992), Carnemolla et al., Eur J Biochem205, 561-567(1992))。它的表达样式使得生腱蛋白-C (特别是它的可变剪接结构域)成为肿瘤靶向应用的一种有希望抗原，而且因此开发了针对该蛋白质中数种结构域的一些抗体(参见例如Brack et al., Clin Cancer Resl2, 3200-3208 (2006)或 EP1817345，描述针对生腱蛋白-CAl 结构域的抗体；Silacci et al., Prot Eng DesSell9, 471-478 (2006)或 EP1173766，描述针对生腱蛋白-C C结构域的抗体；Wang et al.，Hybridoma29, 13-16 (2010),描述针对生腱蛋白C D结构域的抗体；或Balza et al.，FEBS332，39_43 (1993)，描述针对人生腱蛋白不同结构域的数种抗体)。最近，还描述了一种识别人生腱蛋白-C A2结构域中特定表位的抗体(W02009/089998)。抗体糖基化
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性，包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定生物学活性。此类特性可以不仅取决于寡糖的存在或缺乏，而且还取决于寡糖的特定结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如，某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用来介导糖蛋白自血流的快速清除，而其它寡糖结构可以被抗体结合，并且触发不想要的免疫反应。(Jenkins et al., Nature Biotechnoll4, 975-81 (1996))。IgGl型抗体(即癌症免疫疗法中最常使用的抗体)是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于CH2域间，与多肽主链形成广泛的接触，并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely et al.，Glycobiology5，813-822 (1995);Jefferis et al., Tmmunol Revl63,59-76(1998);Wright and Morrison, TrendsBiotechnoll5，26-32(1997))。蛋白质工程研究显示了 Fe γ R与IgG CH2结构域的下部铰链区相互作用。Lund et al.，J.1mmunol.157:4963-69 (1996)。然而，Fe Y R 结合还需要 CH2 区中的寡糖存在。Lund et al., J.1mmunol.157:4963-69 (1996) ; Wright andMorrison, Trends Biotech.15:26-31 (1997)提示,或是寡糖和多肽二者直接促成相互作用位点，或是维持活性CH2多肽构象需要寡糖。因此可以探索寡糖结构的修饰，作为提高IgGl和Fe Y R之间相互作用亲和力和提高IgGl的ADCC活性的一种手段。一种获得单克隆抗体效力大幅升高的方式是通过工程化改造它们的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能，如记载于Umafsa et al.，NatBiotechnol 17，176-180 (1999)和美国专利 N0.6，602，684 (W099/54342)，在此通过提及而完整收录其内容。1Umafia等显示了 β (1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)(—种催化两分型寡 糖形成的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高在那些细胞中生成的抗体的体外ADCC活性。生产细胞系中的GnTIII过表达产生富含两分型寡糖(通常也是非岩藻糖基化的且是杂合物类型的)的抗体。如果在GnTIII之夕卜，生产细胞系中还过表达甘露糖苷酶II (ManII)，那么获得富含复合物类型的两分型非岩藻糖基化寡糖的抗体(Ferrara et al., Biotechn Bioeng93, 851-861 (2006))。与具有未修饰聚糖的抗体相比，这两种类型的抗体显示强烈增强的ADCC，但是只有其中大部分N-聚糖属于复合物类型的抗体能够诱导显著的补体依赖性细胞毒性(Ferraraet al.,Biotechn Bioeng93, 851-861 (2006))。Asn297 碳水化合物的组成改变或其消除也影响抗体Fe域对Fe Y受体(FcyR)和补体Clq蛋白的结合，这分别对于ADCC和 CDC 是重要的(Umana et al., Nat Biotechnoll7, 176-180(1999) ;Davies etal.,Biotechnol Bioeng74,288-294(2001);Mimura et al., J Biol Chem276, 45539-45547(2001) ;Radaev et al., J Biol Chem276, 16478-16483(2001);Shields et al., J BiolChem276, 6591-6604(2001);Shields et al., J Biol Chem277, 26733-26740(2002);Simmons et al., J Tmmunol Methods263, 133-147 (2002))。发明概述本发明提供了特异性结合生腱蛋白-C A2结构域、具有高亲和力和/或增强的效应器功能的抗体。在一个方面，本发明涉及特异性结合TNC A2的抗体，其包含SEQ ID N03，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45 和 47 所列至少一个(即一
个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)。在一个实施方案中，该抗体包含选自 SEQ ID N03，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45 和 47的三个重链CDR (即HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和/或三个轻链CDR (即LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。在一个更特别的实施方案中，该抗体包含选自SEQ ID N055，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89和91所列重和轻链可变区序列的抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区，特别是重和轻链可变区二者。在一个实施方案中，该抗体包含Fe区，特别是IgG Fe区。在又一个实施方案中，该抗体是全长抗体，特别是IgG类抗体。在另一个实施方案中，该抗体包含人抗体恒定区。在一个实施方案中，该抗体是人的。在一个实施方案中，该抗体糖工程化改造成具有Fe区中经过修饰的寡糖。在一个实施方案中，与非糖工程化抗体相比，该抗体具有Fe区中比例升高的非岩藻糖基化和/或两分型寡糖(bisectedoligosaccharide)。在又一个实施方案中，该抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fe受体结合亲和力。在一个特别的实施方案中，升高的效应器功能是升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方案中，该抗体以低于约I μ M、优选低于约ΙΟΟηΜ、最优选低于约InM的Kd值结合人TNC A2。在一个实施方案中，该抗体是亲和力成熟的。在一个实施方案中，该抗体结合人组织中的TNC A2。在其它方面，本发明还涉及与该抗体有关的多肽、多核苷酸、宿主细胞、和表达载体。在又一个方面，本发明涉及制备该抗体的方法。在又一个方面，本发明涉及使用该抗体的方法，特别是用于治疗以TNC A2表达为特征的疾病(诸如癌症)。附图简述
图1显示亲和力成熟抗TNC A2Fab片段结合人(hu)TNC A2的基于表面等离振子共振(SPR)的动力学分析。为克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_07D8(D)、克隆2B10_01F7(E)和克隆2B10_6H10(F)呈现了经过加工的动力学数据集。平滑线呈现数据对1:1相互作用模型的整体拟合。图2 (A)显示2B10抗TNC A2Fab片段结合人、鼠和猕猴TNC A2的基于SPR的动力学分析。小图(B)显示2B10抗TNC A2人IgG结合人、鼠和猕猴TNCA2的基于SPR的动力学分析，如实施例7所述。图3(A)显示正常(上部小图)和肿瘤(下部小图)人子宫组织的免疫组织化学图像，100倍(左边小图)和400倍(中间小图)放大倍数，用与FLAG片段融合的Fab片段中2B10可变区(SHD2B10-FLAG)染色。右边小图:对照，100倍放大倍数。⑶显示各种人组织样品中TNC A2的表达水平，依据免疫荧光表面积％，用与FLAG片段融合的Fab片段中2B10可变区(SHD2B10-FLAG)染色。来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品用SHD2B10-FLAGFab片段染色，如实施例8所述。图4㈧至(N)，显示人组织的免疫组织化学图像100倍(左边小图)和400倍(中间小图)放大倍数，用SHD2B10-小鼠IgG染色，如实施例8所述。以100倍放大倍数显示用同种型对照抗体染色(右边小图)。上部小图:正常组织，下部小图:肿瘤组织。(A)脑，(B)乳房/乳腺，(C)结肠，(D)肾，(E )肝，(F)肺，(G)卵巢，(H) mm, (I)前列腺，(J)骨骼肌，(K)皮肤，(L)小肠，(M)胃，(N)子宫。图5显示2B10衍生人IgG对U87MG成胶质细胞瘤肿瘤细胞上表达的TNCA2的结合，通过流式细胞术测定(见实施例9)。显示了用不同浓度的2B10IgG处理的细胞的均值荧光强度，与未处理细胞和仅仅用二抗染色的细胞(阴性对照)比较。图6显示野生型2B10人IgG的纯化和分析。A)蛋白A亲和层析纯化步骤。B)大小排阻层析纯化步骤。C)分析性SDS-PAGE。实验规程如实施例1所述。图7显示糖工程化2B10人IgG的纯化和分析。A)蛋白A亲和层析纯化步骤。B)大小排阻层析纯化步骤。C)分析性SDS-PAGE。D)分析性大小排阻层析。实验规程如实施例I所述。图8显示野生型(wt)和糖工程化(ge)形式的抗TNC A2抗体2B10对U87MG细胞上的TNC A2的结合。发明详述1.定义 出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述，它是解离和结合速率常数(分别为UP km)之t匕。如此，等同的亲和力可包含不同的速率常数，只要速率常数之比保持相同。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)(例如⑶R)中具有一处或多处改变(例如氨基酸突变)的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。典型地，亲和力成熟的抗体与亲本抗体结合相同表位。术语“抗生腱蛋白-C A2抗体”和“结合生腱蛋白-C A2结构域的抗体”指能够以足够亲和力结合TNC A2，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向TNC A2的抗体。在一个实施方案中，根据例如通过放射免疫测定法(RIA)的测量，抗TNC A2抗体结合无关的、非TNC A2的蛋白质的程度小于该抗体对TNC A2的结合的约10%。在某些实施方案中，结合 TNC A2 的抗体具有彡 ΙμΜ、彡 ΙΟΟηΜ、彡 ΙΟηΜ、彡 InM、彡 0.1nM、彡 0.0lnM、或彡 0.0OlnM(例如10_8M或更少，例如10_8M到10_13M，例如10_9M到I(T13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗TNC A2抗体结合在来自不同物种的TNC A2中保守的TNC A2表位。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。还包括具有Fe区的抗体片段，和包含与免疫球蛋白Fe区等同的区域的融合蛋白。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、单链抗体分子(例如scFv )、双抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。对于例如嵌合抗体，非抗原结合构件可以自极其多种物种，包括灵长类诸如黑猩猩和人衍生。人源化抗体是嵌合抗体的一种特别优选的形式。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类:IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4 JgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y、和μ。在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它 嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体 '及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞因子分泌；免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU 索弓 I,如记载于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。术语“与免疫球蛋白的Fe区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fe区的天然存在等位变体及具有产生替代、添加、或删除的变化，但是没有实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如，可以在没有实质性生物学功能损失的情况中自免疫球蛋白Fe区的N端或C端删除一个或多个氨基酸。可以依照本领域中已知的一般规则来选择此类变体，使得对活性具有最小的影响。(见例如Bowie，J.U.等，Science247:1306-10 (1990))。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)(或⑶R)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成:FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fe区的重链的抗体。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化改造成容许生成具有经修饰寡糖的抗体。在某些实施方案中，已经对宿主细胞进一步操作以表达升高水平的一种或多种具有β (I, 4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III (GnTIII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、Ρ3Χ63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞、和植物细胞等等，而且还有转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κ I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR;三个在VH中(H1、Η2、Η3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。除了 VH中的⑶Rl外，⑶R—般包含形成高变环的氨基酸残基。“高变区”(HVR)又称为互补决定区(CDR)，而且这些术语在本文中提及形成抗原结合区的可变区部分时可互换使用。此特定区域已经由Kabat等，美国卫生与公众服务部(U.S.Dept, of Health and HumanServices), “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，(1983)及由 Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而，任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内，如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表I中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基编号会随CDR的序列和大小而有所变化。给出抗体的可变区氨基酸序列时，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的 CDR。表1:Q)R 定义权利要求
1.一种特异性结合生腱蛋白c A2结构域(TNC A2)的抗体，其中所述抗体糖工程化改造成具有升高的效应器功能。
2.一种特异性结合生腱蛋白C A2结构域(TNC A2)的抗体，其中所述抗体包含至少一种选自下组的重或轻链互补决定区(CDR):SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:7，SEQID NO:9, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19，SEQID NO:21,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31,SEQID NO:33,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:43,SEQID NO: 45 JPSEQ ID NO: 47，或其组合。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，该重链可变区包含(a)选自SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO: 5，和 SEQ ID NO: 7 的重链 CDRl ；(b)选自SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID N0:23，和 SEQ ID N0:25 的重链 CDR2 ;和(c)重链CDR3SEQ ID NO: 27。
4.权利要求1至3任一项的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含(a)选自SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 31JPSEQ ID NO: 33 的轻链 CDRl ；(b)选自SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID N0:43,和SEQ ID NO:45的轻链CDR2 ;和(c)轻链CDR3SEQ ID NO:47。
5.权利要求1至4任一项的抗体，其中所述抗体不包含选自SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO:7 的重链 CDRl、选自 SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:15 和 SEQ ID N0:21 的重链CDR2、为 SEQ ID NO:27 的重链 CDR3、为 SEQ ID NO:29 的轻链 CDRl、为 SEQ ID N0:35 的轻链CDR2、和为SEQ ID NO:47的轻链CDR3的组合。
6.权利要求1至5任一项的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自 SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:67 JPSEQ ID NO:63 的氨基酸序列。
7.权利要求1至6任一项的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自 SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:77，SEQ IDNO:81，SEQ ID NO:85 JPSEQ ID NO:89 的氨基酸序列。
8.权利要求1至7任一项的抗体，其中所述抗体不包含这样的重链可变区和轻链可变区的组合，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO: 59，所述轻链可变区包含氨基酸序列 SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:57。
9.权利要求1至8任一项的抗体，其中所述抗体包含Fe区或与免疫球蛋白Fe区等同的区域。
10.权利要求9的抗体，其中所述Fe区是IgGFe区。
11.权利要求1至10任一项的抗体，其中所述抗体是全长IgG类抗体。
12.权利要求1至11任一项的抗体，其中所述抗体包含人恒定区。
13.权利要求1至12任一项的抗体，其中所述抗体是人抗体。
14.权利要求1至13任一项的抗体，其中所述抗体包含糖工程化Fe区。
15.权利要求14的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fe区中比例升高的非岩藻糖基化寡糖。
16.权利要求14或15的抗体，其中所述Fe区中至少约20%至约100%的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。
17.权利要求14至16任一项的抗体，其中与非糖工程化抗体相比，所述抗体具有所述Fe区中比例升高的两分型寡糖。
18.权利要求14至17任一项的抗体，其中所述Fe区中至少约20%至约100%的N连接寡糖是两分型的。
19.权利要求14至18任一项的抗体，其中所述Fe区中至少约20%至约50%的N连接寡糖是两分型、非岩藻糖基化的。
20.权利要求1至19任一项的抗体，其中所述抗体具有升高的效应器功能和/或升高的Fe受体结合亲和力。
21.权利要求20的抗体，其中所述升高的效应器功能是升高的ADCC。
22.权利要求1至21任一项的抗体，其中所述抗体是亲和力成熟的。
23.权利要求1至22任一项的抗体，其中所述抗体以低于约Iμ M的Kd值结合人TNCΑ2。
24.权利要求1至23任一项的抗体，其中所述抗体结合人组织中的TNCΑ2。
25.一种分离的多核苷酸，其编码形成依照权利要求1至24任一项的抗体一部分的多肽。
26.—种分离的多肽,其由权利要求25的多核苷酸编码。
27.一种组合物，其包含第一分离的多核苷酸和第二分离的多核苷酸，该第一分离的多核苷酸编码包含选自SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO:67 JPSEQ ID ΝΟ:63的序列的多肽，该第二分离的多核苷酸编码包含选自 SEQ ID NO: 55，SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO: 69，SEQ ID NO: 73，SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:85 JPSEQ ID NO:89 的序列的多肽。
28.—种载体,其包含权利要求25的多核苷酸。
29.—种宿主细胞，其包含权利要求25的多核苷酸、权利要求27的组合物、或权利要求28的载体。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过处理，表达升高水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。
31.权利要求30的宿主细胞，其中所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，该融合多肽包含GnTIII的催化结构域和ManII的Golgi定位结构域。
32.权利要求30或31的宿主细胞，其中所述宿主细胞经过进一步处理，表达升高水平的一种或多种具有ManII活性的多肽。
33.一种生成特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体的方法，所述方法包括 a)在容许该抗体表达的条件下在培养基中培养权利要求29的宿主细胞， 和 b)回收该抗体。
34.一种生成特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体的方法，所述方法包括 a)在容许该抗体表达和所述具有GnTIII活性的多肽修饰所述抗体Fe区上存在的寡糖的条件下在培养基中培养权利要求30至32任一项的宿主细胞，和 b)回收该抗体。
35.一种特异性结合生腱蛋白C A2结构域的抗体，其中所述抗体通过权利要求33或34的方法来生成。
36.一种抗体偶联物，其包含权利要求1至24任一项的抗体和细胞毒剂。
37.一种药物组合物，其权利要求1至24任一项的抗体和药学可接受载体。
38.权利要求37的药物组合物，其进一步包含别的治疗剂。
39.权利要求1至24任一项的抗体，其作为药物使用。
40.权利要求1至24任一项的抗体，其用于治疗以TNCA2表达为特征的疾病。
41.权利要求40的抗体，其中所述疾病是癌症。
42.权利要求1至24任一项的抗体，其用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解。
43.权利要求1至24任一项的抗体在制造药物中的用途。
44.权利要求1至24任一项的抗体在制造用于治疗以TNCA2表达为特征的疾病的药物中的用途。
45.权利要求44的用途,其中所述疾病是癌症。
46.权利要求1至24任一项的抗体在制造用于诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的药物中的用途。
47.一种治疗具有以TNC A2表达为特征的疾病的个体的方法，包括对该个体施用有效量的权利要求1至24任一项的抗体或权利要求37或38的药物配制剂。
48.权利要求47的方法，进一步包括对该个体施用别的治疗剂。
49.权利要求47或48的方法，其中所述疾病是癌症。
50.一种诱导肿瘤细胞或肿瘤基质细胞的细胞裂解的方法,所述方法包括使所述肿瘤细胞或肿瘤基质细胞与权利要求1至24任一项的抗体接触。
51.权利要求50的方法，其中所述细胞裂解是通过该抗体的抗体依赖性细胞毒性诱导的。
52.一种诊断个体中的疾病的方法，所述方法包含对该个体施用有效量的诊断剂，其中所述诊断剂包含权利要求1至24任一项的抗体和标记物，该标记物容许检测所述诊断剂和TNC A2的复合物。
53.如本文描述的发明。
全文摘要
本发明提供了针对生腱蛋白-C A2结构域的抗体及其使用方法。
文档编号G01N33/53GK103168049SQ201180049335
公开日2013年6月19日 申请日期2011年8月10日 优先权日2010年8月13日
发明者A.弗里莫瑟-格伦德舍伯, R.霍塞, C.克莱恩, E.莫斯纳, V.G.尼科里尼, P.尤马纳 申请人:罗切格利卡特公司