用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备的制作方法

用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备的制作方法
【专利摘要】提供了用于捕获、分离和处理单细胞的微流控装置。所述微流控装置包括细胞捕获室，其具有位于细胞捕获室内的细胞漏斗，从而引导细胞通过细胞捕获室流向一个或多个位于该漏斗下游的细胞捕获器，以接收流动的细胞。所述装置可进一步包括与细胞捕获室一体的辅助室，用于随后处理和分析所捕获细胞的内含物。还提供了细胞捕获和制备方法，其包括使细胞流经室，并使细胞经漏斗流向细胞捕获器，在所述捕获器内捕获预定数目的细胞，中断所述细胞流，使洗涤液流经所述室以从所述室中去除污染物，以及将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
【专利说明】用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备
[0001]发明背景
[0002]1.发明领域
[0003]本发明涉及微流控装置。具体地，本发明涉及微流控装置及其用途，以及用于分析细胞的方法。
[0004]2.相关技术描述
[0005]单细胞代表基本生物单位。然而，大多数生物知识呈现为研究细胞群而非单细胞的结果。难免存在基础和应用问题，如涉及干细胞分化的转录控制、基因表达中的固有噪声和疾病起源的问题，这只能从单细胞水平上来解决。例如，单细胞分析允许直接测量基因表达动力学或清 楚地鉴别共调控的基因，甚至存在会使普通群体测量不清楚的非同步性和异质性时也是如此。类似地，单细胞方法在干细胞研究和癌症生物学中至关重要，其中由于受纯化方案限制而分离的原代细胞群为异质的，并且通常只有少数细胞群是最相关的。因此，高通量单细胞测量技术受关注并在临床和研究环境中具有广泛的应用。
[0006]测量单细胞中转录水平的现有方法包括RT-qPCR(l)、使用数字PCR(2)的单分子计数，或杂交探针(3，4)以及新一代测序(5)。在这些方法中，单细胞RT-qPCR提供了灵敏、特异和动态范围的综合优点，但其受低通量、试剂费用高和难以准确测量低丰度转录本的限制(6)。
[0007]微流控装置使用活动阀门来定位和分离细胞，允许对单个微生物细胞进行分离和基因组扩增(32)。遗憾的是，由于涉及操作阀门机构的手动操作，该装置不能进行高通量分析。此外，所述装置不能使分离的细胞在处理和分析之前从上清液中洗涤出来。反过来这会产生污染事件，并进一步限制该装置的下游应用。
[0008]因此，微流体研究的目标是开发出可对单细胞中的转录进行可扩展分析的综合技术。微流控系统提供了用于单细胞分析的众多优点:测量的经济性、平行化和自动化，以及提高来自小量反应的灵敏度和精确度。过去十年中，人们投入了大量精力用于研发在芯片上集成和可扩展的单细胞遗传分析(7，8)。因此，微流控单细胞基因表达分析的许多基本功能已经在分离包括细胞操作和捕获(9，10)、RNA纯化和cDNA合成(11-13)，以及芯片外细胞分离cDNA合成和预扩增后的微流控qPCR(14)中得到展示。具体地，最近已将微流控qPCR装置(Biomark动态阵列，Fluidigm公司)应用到单细胞研究中(15，16)。尽管这些系统提供了高通量qPCR数据读出，但是它们没有进行前段样品制备，且需要通过FACS或微量移液管进行单细胞分离，然后在分析前进行芯片外处理和起始模板的预扩增。将单细胞分析的所有步骤集成于一个能测量大量细胞的强大系统的关键步骤还有待报道。Toriello等人描述了直接测量单细胞基因表达的集成装置的单独示范，组合了 RNA捕获、PCR扩增和使用集成毛细管电泳的扩增子末端检测的所有步骤(17)。尽管该系统的工程复杂，通量被限制于每轮4个细胞，细胞捕获需要细胞代谢标记，且所述分析不是定量的。
[0009]在许多类型的分析之前，需要分离单细胞或有限数目的细胞，这通常需要使用细胞捕获机构。对于单细胞或少量细胞进行可靠和可扩展分析的目标而言，低捕获通量和低捕获效率成为巨大的挑战。低捕获效率需要成千上万个细胞以使在使用细胞系时少量单细胞测量不成问题，然而，在使用稀少细胞类型如干细胞的原代样品时，这就成为一个大问题。同样，对所捕获细胞和通过所述捕获器的细胞的观察表明，细胞捕获效率取决于细胞大小，其可能潜在地将偏差引入到单细胞测量中。
[0010]发明概述
[0011]本发明部分基于这样的发现，即相比μ L体积的分析，集成微流控装置可用于对每个实验中PL至nL体积(50pL-100nL)的上百(上千)单细胞进行可扩展、高性能、低成本和敏感性分析的高通量分析。所述描述和实例提供了首次实施强大和高通量的单细胞处理和芯片上的核酸扩增，由此取得了微流控生物学分析的主要里程碑。
[0012]本文提供了能够进行可扩展的定量单细胞遗传分析的微流控技术。具体地，本文的示例为集成微流控装置，其用于对每个实验中上百至上千通量的单细胞mRNA和miRNA表达进行高通量RT-qPCR分析。本描述显示，相比μ L体积的分析，该技术提供了具有改善性能、降低成本和更高灵敏度的可扩展的单细胞基因表达测量的有力工具。
[0013]本文提供的实施例公开了完全集成的微流控装置，其能够进行每轮上百单细胞的基因表达的高精度RT-qPCR测量。而且，所述装置的实施方案能够执行所有的单细胞处理步骤，包括细胞捕获、细胞裂解、逆转录和定量PCR。除了更高的通量和降低成本，本文显示纳升(nanoliter)体积处理减少了测量噪声、增加了灵敏度，并提供了单核苷酸特异性。本描述显示将该技术应用于对3300个单细胞进行下述测量:i)K562细胞中miRNA表达，ii)胚胎干细胞中分化期间miRNA和其靶转录本之一的共调控，和iii)原代小叶乳腺癌细胞中单核苷酸变体检测。本文中建立的核心功能提供了这样的基础，各种芯片上的单细胞转录分析将以此为基础发展。在 阅读了下述本发明的具体实施方案描述及其附图后，对本领域技术人员来说，本发明的其他方面和特征将变得很明显。
[0014]可选择地，处理和分析的细胞类型可选自以下一种或多种:滚环扩增、多重置换扩增、同温DNA和RNA扩增、cDNA末端快速扩增(RACE)、简并性寡聚引物PCR、线粒体DNA PCR、基因组PCR、数字PCR、RT-PCR、测序、免疫化学、邻位连接PCR、免疫PCR、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析、杂交研究。
[0015]根据第一实施方案，提供的微流控装置包括:(a)细胞捕获室，其具有至少一个入口和至少一个出口，其中每个入口和出口具有开启和关闭位置，以此当所述入口处于开启位置时流体能够流入细胞捕获室，而当所述出口处于开启位置时流体能够流出细胞捕获室，并且以此当所述入口处于关闭位置时将阻止流体流入所述细胞捕获室，而当所述出口处于关闭位置时将阻止流体流出所述细胞捕获室，其中流经所述细胞捕获室的方向指示了所述细胞捕获室的上游和下游方向；(b)细胞漏斗，其位于细胞捕获室中且可操作地引导细胞通过所述细胞捕获室流向细胞捕获室中的一个或多个期望的位置；和(C)细胞捕获器，其通常位于所述细胞漏斗的下游，以此将所述细胞捕获器定位以接收从所述细胞漏斗向下游流动的细胞。
[0016]所述微流控装置可进一步包括:(a)与流体注入通道流体连通的第二入口，所述上游入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室；和(b)与一个或多个辅助室流体连通的第二出口，所述下游出口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体流出所述细胞捕获室并进入一个或多个辅助室，而在所述关闭位置阻止流体从所述细胞捕获室进入一个或多个辅助室。
[0017]所述微流控装置可进一步包括与流体注入通道流体连通的第二入口，所述第二入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。
[0018]所述细胞捕获室可具有一个入口和一个出口，其中所述入口与流体注入通道流体连通，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。
[0019]所述细胞漏斗可施加力以引导细胞流向所述细胞捕获室中一个或多个期望的位置。通过所述细胞漏斗施加于细胞的力可选自以下一种或多种:机械力、重力、电磁力、静电力、磁力、声学力、水力和光学力。而且，一种或多种上述的力可有助于将细胞引导至期望的位置。例如,物理结构可对流体施加机械力，反过来流体产生水力。通过所述细胞漏斗施加于细胞的力可为水力。
[0020]所述细胞捕获器可选自以下一种或多种:机械力捕获器、水力捕获器、介电泳力捕获器、磁力捕获器、声学力捕获器、亲和力捕获器、光学力捕获器和膜片钳捕获器。所述细胞捕获器可为水力捕获器。
[0021]所述第二出口可与第一辅助室流体连通。所述第一辅助室可与第二辅助室流体连通，其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第一辅助室流向第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第一辅助室流向第二辅助室。所述第一辅助室可与第二辅助室流体连通，且所述第二辅助室与第三辅助室流体连通；其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第一辅助室流向第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第一辅助室流向第二辅助室；其中在所述第二和第三辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第二辅助室流向第三辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第二辅助室流向第三辅助室。
[0022] 所述辅助室的体积可为可膨胀的。所述细胞捕获室的体积可为0.lnL-100.0nL0所述可膨胀的细胞捕获室的未膨胀体积可为0.lnL-100.0nL0所述细胞捕获室的体积可为0.6nL。所述未膨胀的细胞捕获室可为0.6nL。通过初始室的膨胀或通过打开阀门以提供流体流入一个或多个辅助室可增加给定室的有效体积。所述第二辅助室和第一辅助室之间的比率可为5:1。所述第二辅助室和第一辅助室之间的比率可为至少5:1。所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间的比率可为5:1，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可为5:1。所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间的比率为至少5:1，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可为至少5:1。所述第二辅助室和第一辅助室之间，或所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可根据所选的反应混合物、该混合物组分的浓度和待分析物质的浓度而变化。可选择地，所述细胞捕获室可为0.05nL-100.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.05nL_90.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-95.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-90.0nL.可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-85.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-80.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-75.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-70.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-65.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-60.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-55.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-50.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-45.0nL0可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-40.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-35.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-30.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-25.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-20.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-15.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-10.0nL0可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-9.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-8.0nL.可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-7.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-6.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-5.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-4.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-3.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.lnL-2.0nL。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nL-l.0nL.[0023]所述装置可包括1-10个细胞捕获器和对应的细胞漏斗。可选择地，漏斗可与多于一个的专用捕获器结合使用。所述细胞捕获器也可设计为每一个容纳多于一个细胞，且每一个可由一个或多个细胞漏斗来提供细胞。此外，如果待检测的是混合细胞群，细胞捕获器的大小可使其选择特定的细胞类型。而且，所述细胞捕获器和漏斗可设计为排除某些细胞类型或选择某些细胞类型。 [0024]所述细胞漏斗可包括各自具有近端和远端的一对细胞导流板，其中所述近端位于所述捕获室的对侧，且其中所述细胞导流板的每个远端相对于近端在下游方向对角线上成角度，以此所述细胞导流板的远端提供开口，其大小允许在所述细胞导流板的远端之间通过细胞。所述细胞捕获器可大体为杯形或“U”形，或者具有大体为杯形或“U”形的区域，从而细胞可从一侧进入所述“U”形内部而不能通过。所述细胞捕获器可提供流经所述细胞捕获器的流体。可在细胞被捕获于所述捕获器之前、期间和之后流经所述捕获器。该流经可辅助捕获细胞和辅助洗涤所捕获的细胞。而且，所述细胞漏斗或细胞捕获器可具有如任一图la-x、2a-e、12b-1和24所示的结构。
[0025]根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括:(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；(e)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(f)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
[0026]根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括:(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；(e)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所述捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(f)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
[0027]所述方法还可包括处理和分析洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种:滚环扩增、多重置换扩增、同温DNA和RNA扩增、cDNA末端快速扩增(RACE)、简并性寡聚引物PCR、线粒体DNA PCR、基因组PCR、数字PCR、RT_PCR、测序、免疫化学、邻位连接PCR、免疫PCR、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析和杂交研究等。
[0028]所述方法还可包括:(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(C)扩增。
[0029]所述方法还可包括:(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(C)定量扩增。[0030]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(d)分离所述室中预定数目的细胞。
[0031]所述方法还可包括分析所述洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种:滚环扩增、多重置换扩增、同温DNA和RNA扩增、cDNA末端快速扩增(RACE)、简并性寡聚引物PCR、线粒体DNA PCR、基因组PCR、数字PCR、RT_PCR、测序、免疫化学、邻位连接PCR、免疫PCR、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析和杂交研究等。
[0032]所述方法还可包括:(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(C)扩增。
[0033]所述方法还可包括:(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(C)定量扩增。
[0034]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；(d)分离所述室中预定数目的细胞；(e)裂解所述室中的细胞；(f)逆转录通过所述细胞裂解释放的RNA ;和(g)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
[0035]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c) 通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；(d)分离所述室中预定数目的细胞；(e)裂解所述室中的细胞；(f)逆转录通过所述细胞裂解释放的RNA ;和(g)通过定量聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
[0036]根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括:(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；和(e)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
[0037]根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括:(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(C)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；和(e)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
[0038]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；和(c)分离所述室中预定数目的细胞。
[0039]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)分离所述室中预定数目的细胞；(d)裂解所述室中的细胞；(e)逆转录通过所述细胞裂解释放的RNA ;和(f)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
[0040]根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括:(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)分离所述室中预定数目的细胞；(d)裂解所述室中的细胞；(e)逆转录通过所述细胞裂解释放的RNA ;和(f)通过定量聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
[0041]所述方法还可包括将所述细胞引导至细胞捕获室之前的细胞分选步骤。所述方法还可包括在洗涤之前固定所捕获的细胞。固定还可促进对捕获室中细胞的洗涤。【专利附图】

【附图说明】
[0042]在说明本发明实施方案的附图中:
[0043]图1a-1为根据本发明涉及水力细胞捕获器的各种实施方案的细胞漏斗和对应的细胞笼(cell cage)的示意图。
[0044]图1b为根据本发明涉及水力细胞捕获器的各种实施方案的细胞笼的示意图。
[0045]图2a为细胞捕获检测装置示意图。
[0046]图2b为根据本发明一个实施方案的细胞漏斗和细胞捕获器的几何体示意图。
[0047]图2c为根据本发明一个实施方案的优选细胞漏斗和细胞捕获器的几何体示意图。
[0048]图2d为接近具有图2c所示几何体的捕获器的K562单细胞光学显微图。
[0049]图2d为图2c中K562细胞被捕获后的光学显微图。
[0050]图3描绘了化学裂解法和热裂解法相比较的结果图。
[0051]图4为背景信号与来自单细胞的信号的比较图。[0052]图5描绘了细胞裂解物浓度对RT-qPCR的抑制作用的图。
[0053]图6显示了不同RT-PCR稀释物对qPCR性能影响的图。
[0054]图7为根据本发明一个实施方案的微流控装置的示意图。
[0055]图8为描绘了对9个单细胞检测miRNA16和一个无细胞对照的qPCR结果图。
[0056]图9为描绘了来自实验得到的部分被洗脱两次后三个室的洗脱效率测量结果图。
[0057]图10为根据本发明一个实施方案用于单细胞捕获分析的微流控装置的示意图。
[0058]图11为概述图10的微流控装置操作的示意图。
[0059]图12A为根据本发明一个实施方案的微流控装置。比例尺:4mm。所述装置特征为6个样品输入通道，每一个分为50个化合物反应室，总共300个RT-qPCR反应，使用约20 μ L试剂。长方形框表示B中描绘的区域。
[0060]图12Β为对应于图12Α中黑色长方形内区域的阵列单元的光学显微图。
[0061]图12C为具有捕获的单细胞的两个细胞捕获室的光学显微图。
[0062]图12D为注入至图12Α中所描绘装置的单细胞悬浮液的示意图。
[0063]图12Ε为将单细胞从液流中分离以允许洗涤该细胞的细胞捕获器的示意图。
[0064]图12F为在热裂解之前启动气动阀门以使得单细胞分离的示意图。
[0065]图12G为注入逆转录(RT)反应试剂的示意图。
[0066]图12Η为试剂注入管线后用PCR试剂冲洗的示意图。
[0067]图121为在50nL qPCR室中将qPCR试剂与RT产物组合的示意图。
[0068]图13A为图12A显示6个通道中的300个反应的整个装置的荧光图。
[0069]图13B为类似于图12A中图像的处理序列产生的300个实时扩增曲线图。
[0070]图13C为8倍系列稀释的纯化总RNA中GAPDH的芯片上和芯片外RT-qPCR的图。
[0071]图13D描绘了在K562细胞裂解稀释物中GAPDH的实时扩增曲线图。
[0072]图13E描绘了在细胞裂解物稀释系列物中GAPDH的测量CT值的图。
[0073]图14比较了来自K562细胞裂解物的GAPDH在所述装置中进行qPCR之前在图12A的微流控装置中进行RT或在管中进行RT的测量结果图。[0074]图15A为沿着图12A装置的所有6个通道的每个室中细胞位置的示意图。
[0075]图15B为显示图14A所示实验的CT测量结果的散点图。
[0076]图15C为在K562单细胞(N=233)中测量的GAPDH转录本数目的柱状图。
[0077]图16A为显示由Cedex测量的原始样品中细胞大小分布的柱状图。
[0078]图16B为显示由微流控捕获器分离的细胞大小分布的柱状图。
[0079]图17A为在注入微流控装置之前，芯片外PBS洗涤的细胞中GAPDH测量结果的散点图。
[0080]图17B为在注入微流控装置之前，芯片上PBS洗涤的细胞中GAPDH测量结果的散点图。
[0081]图17C为来自上样的纯化RNA且洗涤或未洗涤所述细胞捕获室的GAPDH测量结果图。
[0082]图18A为沿着装置中所有6个通道的每个室中细胞的位置的示意图。
[0083]图18B为对应于图18A)的实验在30个PCR循环后整个装置的荧光图像。
[0084]图19为在hESC细胞聚集体中miR16测量结果的散点图。
[0085]图20A为在K562细胞和hESC中miR_16表达的单细胞测量结果的柱状图。
[0086]图20B为K562细胞和hES`C之间miR-223差异表达的柱状图。
[0087]图20C为相比来自大块细胞裂解物的数字PCR测量结果，根据本发明一个实施方案的微流控装置中由RT-qPCR测量的单细胞miRNA平均拷贝数的图。
[0088]图20D为K562细胞和hESC之间miR-223差异表达的柱状图
[0089]图21A为K562细胞和hESC中miR_16表达的单细胞测量结果的柱状图。
[0090]图21B，C为显示miR-145和0CT4转录本分布的柱状图。
[0091]图21D为显示分离自小叶乳腺癌样品的原代细胞中SPl野生型和SNV突变体转录本的共表达测量结果的散点图。
[0092]图22A为FBS分化7天后CAlS细胞中0CT4的mRNA_FISH的代表性图像。
[0093]图22B为未分化的CAlS细胞的代表性图像。
[0094]图23为显示根据本发明一个实施方案构建的miRNA序列标签文库中每个标签长度处比对标签的百分比的柱状图。
[0095]图24为根据本发明一个实施方案的用于测序和表征单细胞转录组的微流控装置的示意图。
[0096]图25A为说明根据本发明一个实施方案，为了纯化和固定模板(RNA)将功能化的珠子和细胞混合的图像。
[0097]图25B为说明根据本发明一个实施方案，将功能化的珠子堆积于室中的图像。
[0098]图26为根据本发明一个实施方案，用于磁性固定功能化的珠子以结合模板(DNA/RNA)并使多步反应在单个室中发生的微流控装置。
[0099]图27为集成了单细胞处理和微阵列点样以将不同试剂递送给不同反应的微流控装置的示意图。
[0100]图28为根据本发明一个实施方案，用于集成的单细胞数字PCR的微流控装置的示意图。
[0101]图29为图28的微流控装置的示意图，描绘了通过分叉旋转混合器将PCR溶液与模板分子混合。
[0102]图30为根据本发明一个实施方案，用于通过将细胞产物递送至更大的室中以对该其进行连续稀释的微流控装置的示意图。
[0103]图31为根据本发明一个实施方案，用于多路复用单细胞RT-qPCR的微流控装置的示意图。
[0104]详细描述
[0105]为了分离和测量单细胞，已经开发了各种技术。这些技术在它们能够分析的细胞数目和能够进行的平行或多路测量的数目方面差异都很大。
[0106]定义
[0107]如本文所用，“流式细胞术”是基于测量单个粒子的荧光性、光散射和吸光度，用于快速、定量地检测和分选细胞群、细胞器和其他组分的常用技术(18)。流式细胞术使用光学多路复用技术来测量不同属性，每分钟能够处理和测量多达成百上千个细胞。该技术已经用于测量单细胞的物理特性和化学组成(19)。通过将转录报告基因如GFP与关注的基因或miRNA结合并记录每个细胞的荧光，已经使用流式细胞术来测量mRNA (20)和miRNA(21)表达。此前也有报道通过流式细胞术分选单细胞，以通过RT-qPCR用于进一步遗传分析(22)。
[0108]如本文所用，“激光捕获显微切割”(LCM)是可将来自异质样品的纯群体在直接可见下分离用于进一步分析的技术(23)。该技术可应用于组织(23)、细胞学制备(24)和活细胞培养(25)。在LCM中，关 注的细胞在显微镜下可见且使用者限定该区域以与样品的其他部分分离。然后，通过去除周围区域或从样品切离期望的部分，可将这些选定的区域与样品的其余部分分离。由于该方法对待分离的样品为非破环性的，通过该方法分离的细胞可使用任何传统分子生物学技术来测量。
[0109]如本文所用，“微流控装置”是指允许对流述进行精确控制和操作的任何装置，所述流体在几何上限制于其中至少一维空间(宽、长、高)小于Imm的结构中。
[0110]如本文所用，“细胞捕获室”是指在微流控装置内的封闭空间，其中使细胞流经所述装置时，一个或多个细胞可从更大的细胞群中分离出来。每个细胞捕获室将具有至少一个入口和至少一个出口，所述入口允许流体包括含有细胞的流体进入所述室中，所述出口允许流体流出所述室。本领域技术人员应理解，入口或出口可在结构和尺寸方面有很大改变，从最普遍意义上可表征为能够在开启位置和关闭位置之间可逆地切换的孔口，以便在开启位置时允许流体流入或流出所述细胞捕获室，在关闭位置时封闭所述细胞捕获室，从而分离和保留其内容物，由此所述孔口也可介于开启位置和关闭位置之间以允许一些流体流动。
[0111]流体流经细胞捕获室的方向指示了所述细胞捕获室的“上游”和“下游”方向。因此，入口将位于所述室的上游位置，而出口通常将位于所述室的下游位置。然而，本领域技术人员应理解，单独的孔口也可即作为入口又作为出口。
[0112]如本文所用，“入口 ”或“出口”可包括任何口或孔口，由此流体流动限制于流经所述入口、出口或孔口。可有阀门来控制流量，或通过用阻止液流(例如，油)的层分隔所述通道来控制流量。
[0113]“细胞捕获室”可进一步包括通常位于所述“细胞漏斗”下游的“细胞捕获器”，以此所述细胞捕获器被定位以接收(和保留)从所述细胞漏斗向下游流动的细胞。[0114]如本文所用，“细胞漏斗”是指一种设备，其被设计为用于将来自细胞处于分散状态的上游位置的细胞流会聚到细胞捕获室中一个或多个期望的下游位置，所述细胞捕获室具有细胞流的更小横截面。所述细胞漏斗施加力以引导细胞流向细胞捕获室中的一个或多个期望位置。为清楚的目的，本文将“力”定义为导致自由体(例如，细胞)经历速度上变化的任何支配力。漏斗可跨越所述细胞捕获室的整个高和/或宽，或者部分跨越所述高和/或宽。
[0115]图1a-1提供了根据本发明的各种实施方案的示例性机械漏斗的图示。如图1b和e中所示，可通过制作更长的颈缩部12对图1a的基本机械漏斗10进行改进。可以有多个漏斗，如图1d、i和j中的嵌套漏斗IOa和IOb以及图1f中的10c。所述漏斗的角Θ可变化，如图1k中所示例。所述漏斗的颈缩部12可如图1d、e、f、g、k所示为直的,或者如图la、b、h、1、j、k、l所示为斜的。还可通过组合机械力和水力法来额外实现汇集，如图1c所示(即不同流速的不同或相同的流体，可经所述外部通道流入)。漏斗还可包括上游通道如凹槽的横截面变化，其导致细胞在遇到细胞捕获器之前沿着所述通道的宽被定位于特定部分。
[0116]如本文所用，“细胞捕获器”通常指随着时间在预定位置接收和保留细胞的装置。细胞捕获器可包括定位的表面修饰用于化学固定细胞。或者，所述细胞捕获器可为机械力捕获器、水力捕获器(10，26-28)、水力平衡捕获器(29，30)、活动阀调捕获器(2，10，31，32)、介电泳力捕获器(33)、DNA固定捕获器(17)、凝胶封装捕获器(34)、磁力捕获器、声学力捕获器或光学力捕获器(35)。在本发明的各种实施方案中，细胞捕获器通常将直接定位于由漏斗产生的细胞流较小横截面的通道上。根据本发明的各种实施方案，当使用如图1所示的机械漏斗时，捕获器可直接定位于所述漏斗下游开口后方。
[0117]如本文所用，“机械力捕获器”是指诸如笼的细胞捕获器。
[0118]如本文所用，“水力捕获器”是指其中运动流体的力在保留所捕获细胞于其位置上起作用的细胞捕获器。水力捕获器也可由机械力捕获器组成，细胞被捕获并保留于其中。在利用水力捕获器的本发明一些实施方案中，可取的是具有3个或更多进入细胞捕获室的入口，从而可对流体进行调整以便引导细胞到所述捕获器。
[0119]如本文所用，“介电泳力捕获器”是指其中作为介电物体的细胞通过不均匀电场产生的力被保留的细胞捕获器。
[0120]如本文所用，“磁力捕获器”是指利用磁场来保留细胞的细胞捕获器。通常，用磁性粒子标记细胞，然后通过磁场进行定位和保留。然而，磁力捕获器也可用于捕获在合适缓冲液中的非磁性细胞。
[0121]如本文所用，“声学力捕获器”是指这样的细胞捕获器，其中将超声驻波用于产生施加定位和保留细胞的力的静压梯度。
[0122]如本文所用，“光学力捕获器”是指这样的细胞捕获器，其中深聚焦激光束，通常为近红外激光束，被用于将细胞拉向所述光束的方向。
[0123]细胞捕获器的大小可根据所期望捕获细胞的大小、类型、机械特性或数目来变化。根据本发明的各种实施方案，微流控装置还可包括设计用于捕获多种细胞类型的捕获器组合。而且，每个细胞捕获室可包括多个捕获器。在这样的实施方案中，在每个大小上被捕获细胞的频率可用作诊断结论。或者，可对单个捕获器中捕获的细胞群内容物进行处理和分析。
[0124]图lm-x提供了根据本发明的各种实施方案用于水力捕获器中的示例性物理笼的图示。如图lm-x中的笼20所示，所述笼的内部形状可为杯形以容纳球形细胞，或可设计为各种几何形状以容纳独特形状和/或大小的细胞。所述笼可形成基本上跨越所述室的整个高或宽，或者部分跨越所述室的高或宽的堰，或二者兼有。如图1m所示，所述笼的外形可被改变以调节流向捕获器周围的流体流动。如图lo、p、q、r、s和X所示,可增加孔或筛元件22以促进和调节流体流经所述杯。如图1x所示，孔的大小可减小或增大。所述孔可为所述室的整个高或宽，或者部分跨越所述室的高或宽的堰，或二者兼有。笼的大小可制作得如图1t所示更长,如图1u所示更宽,如图1v所示更长且更宽,或者如图1w所示更短和更窄。
[0125]形成所述漏斗的物理结构可为两侧均为斜的，即在漏斗表面的相对侧也为斜的，以便于从所述捕获器中去除细胞，具有如图1k和I所示的Ψ角。其他特征，除捕获器外，可定位于漏斗的下游以进一步调节流体阻抗，如图1h和11中的元件14。
[0126]如本文所用，“流体注入通道”是指流体通过其被引入至所述装置的室中的任何管道。流体注入通道可用于将包括细胞悬浮液、洗涤缓冲液、反应混合物等的任何流体递送至室中。
[0127]如本文所用，“辅助室”是指辅助细胞捕获室的任何室。辅助室可用于处理或分析所捕获的细胞，或其分离的内容物。处理可包括细胞制备步骤，包括培养、洗涤、裂解和分级。分析可包括DNA和RNA扩增和检测，包括线粒体PCR、基因组PCR、数字PCR、RT-PCR、RTq-PCR、多重置换扩增(DNA)、滚环扩增测序、简并PCR、分子倒置探针、分子信标，以及其他DNA/RNA扩增和检测方法、体外转录、连接、免疫化学、报告基因表达分析、杂交研究等。可将几个辅助室以串联和/或并联的方式连接至单个细胞捕获室，从而可对单个细胞捕获室中的内容物进行多重处理。阀门可定位于辅助室和细胞捕获室之间，或位于辅助室之间，以调节室之间的流体流动。
[0128]如本文所用，“可膨胀的”细胞捕获室是指在进行操作以容纳不同体积的流体期间可膨胀或收缩的细胞捕获室。如此，单个室可用于细胞捕获和随后的处理和分析必须在不同体积的流体中进行的目的，从而避免了对多个分离的室的需要。
[0129]可以用几种方式实现可膨胀的细胞捕获室的膨胀。例如，所述室可包括注射器，其中通过使用活塞来调节室的体积。或者，所述室可用能够随着流体添加而膨胀或当流体体积减少时收缩的弹性材料构建。还或者，所述室可由不相混合的液体(如空气或油)来部分限定，从而通过所述液体边界的移动可容纳更大体积的流体。
[0130]本领域技术人员应理解，辅助室可为可膨胀的。因此，微流控装置可由不可膨胀的和/或可膨胀的细胞捕获室和辅助室组合构成。
[0131]如本文所用，“污染物”是指干扰对所述细胞或细胞内容物进行准确和/或精确分析的任何物质。污染物包括但不限于，蛋白、小分子、盐、缓冲剂、RNA、DNA、其他细胞、粒子等。
[0132]如本文所用，“微小RNA” (miRNA)为短的(19_23个核苷酸长度)非编码核糖核酸(RNA)聚合物，其涉及将互补mRNA翻译为蛋白的转录后调控(36)。它们表达为形成自身互补的“发卡”RNA的更大转录本。已经表明miRNA对很多生物途径非常重要，包括增殖(37)、分化(38)和死亡(39)、发育时间(40)和方式(41)、神经系统发育模式(39，42)和抗病毒抗性(43，44)。各种功能作用，结合miRNA表达谱是细胞状态的独特信号的知识(45)，暗示通过研究miRNA表达可深入探究很多疾病如癌症(45-47)和心脏病(48-51)的复杂生化性质，。
[0133]“逆转录定量聚合酶链式反应” (RT-qPCR)为通常用于测量基因表达的分子生物学技术(52-54)。RT-qPCR扩大了传统聚合酶链式反应(PCR)的功能，所述PCR为特异性并以指数方式原位扩增单个或多个拷贝DNA的方法(54)。在RT-qPCR中，通过称为逆转录的过程从RNA模板合成第一链DNA (RT; 54)。通过利用RT酶需要具有DNA-RNA双链，将特异性增加到逆转录步骤。然后使用设计为与期望靶标互补且被称为引物的寡核苷酸来特异性地将一段RNA转录为DNA。合成第一链以后，在荧光报告基因和设计用于扩增此前步骤所转录DNA的引物存在下，进行传统的PCR(54)。然后，每个循坏后均监测该反应，记录荧光，产生了特征性的S形曲线。反应完成后，就可能确定基因的相对起始丰度(54)。利用RT-qPCR测量单细胞mRNA(55，56)和miRNA(57，58)表达水平为大家所认可。本领域技术人员应理解，利用光学多路复用技术策略可以在单个反应中进行多于一个序列的分析。本领域技术人员还应理解，除了所限定序列的定量，可使用RT-PCR来扩增一个或多个基因，用于随后的回收和/或分析。
[0134]尽管本文所述本发明的实施方案通常涉及捕获和分离细胞并随后处理，应理解，根据本发明的各种方面，所述微流控装置可用于捕获和分析除细胞以外的预定数目的其他实体，包括细胞器、病毒、微粒、液滴等。
[0135]实施例1
[0136]实施例1.1材料和方法
[0137]核酸检测和定量
[0138] 通过微阵列分析进行DNA定量是一种分析样品中上千个不同的靶标的多路复用的公认方法。将固定在固体表面上的特异性DNA序列用作溶液中靶分子的探针。使含有这些靶分子的溶液流经微阵列的表面，靶分子通过标准DNA碱基配对结合至固定的探针。通过检测荧光团或银色的或化学发光的靶标来检测和定量探针-靶标杂交。尽管微阵列分析已经用于单细胞，但是为了产生满足分析检测限的靶分子量，其需要扩增步骤(59)。
[0139]单分子成像技术包括荧光原位杂交(FISH;60，61)，单个荧光团成像(62)已经用于直接计数单细胞中的转录本数目。尽管这些方法通过直接观察在其定量转录本丰度的能力上是无与伦比的，但是它们仅能进行光学多路复用并需要高度特化的仪器。
[0140]已经开发了特异性检测和定量miRNA的方法,包括northern印迹杂交(64)、原位杂交(60，61)、单分子成像(62)、微阵列(65，66)、新一代测序(67)和具有茎环RT引物和TaqMan探针的RT_qPCR(68)。由于大的动态范围、高度的特异性和许多单细胞转录本定量方法需要PCR扩增这一事实，为了测量miRNA丰度而选择使用茎环引物和TaqMan探针的RT-qPCR。茎环引物含有自身互补区，因而其自身的“回折”产生了发卡结构。该结构防止引物结合至除分子最末端以外的RNA分子，其防止miRNA前体被扩增(68)。TaqMan探针是设计用于增加qPCR特异性的水解探针出9)。水解探针是在一端标记荧光基团而另一端标记淬灭基团的寡核苷酸。当完整的探针游离于溶液中时，所述荧光基团足够贴近所述淬灭基团，从而所述荧光基团发出的任何荧光均通过荧光共振能量转移(FRET)被所述淬灭基团所淬灭(69)。在PCR期间，该探针结合至其互补序列，通过Taq聚合酶的外切酶活性而被切割，由此分离所述荧光基团和所述淬灭基团出9)。因此，每个循环以后，理想状态是会有两倍的荧光性增加。通过在每个循环后或“实时”测量荧光，就可能确定相对起始丰度。实验中(称为标准)系列稀释已知浓度的内含物产生校正曲线，使得能够计算出分子的最初起始数目。
[0141]制造 [0142]多层软蚀刻技术(MSL)被用于制造装置出3，70)。该制造过程利用了已确立的光蚀刻技术和微电子制造技术上的进展。MSL的第一个步骤是利用计算机绘图软件绘制设计图，然后将其印刷在高分辨率掩膜上。使覆盖有光刻胶的硅晶片暴露于紫外光，其在某些区域通过所述掩膜滤出。根据所述光刻胶是否为负性或正性的，暴露的(负性)或未暴露的(正性)面积将进行交联且所述光刻胶将聚合。未聚合的光刻胶在显影液中是可溶的并随后被冲洗掉。通过组合不同的光刻胶并以不同的速度旋转涂覆，可使晶片形成各种不同形状和高度的图案。然后将该晶片用作模具把所述图案转移至聚二甲硅氧烷(PDMS)。在MSL中，在彼此顶部堆叠以不同模具模制的不同的PDMS层，是用于在重叠的“流动层”和“控制层”产生通道出3，70)。通过以互补的化学计量比率混合密封的预聚合组分和硬化剂组分将两层(或更多层)结合在一起以实现硬化作用。为了制造简易的微流控芯片，“厚”层由含有流动层的模具模制，而“薄”层由含有控制层的模具模制。在两层均部分硬化以后，把流动层从所述模具上剥离，并手动与控制层对准。使这些层结合，然后将该双层片从所述控制模具上剥离，然后打出入口和出口的孔，再将该双层片结合至PDMS的空白层上。在更多的结合时间之后，把完成的元件安装至载玻片上。
[0143]使用芯片外可计算机编程的螺线管控制所述装置中的流体流，其启动压力施加于控制层中的流体。当压力施加于这些管线时，位于重叠的正交控制和流体管线之间的弹性膜向流体通道中偏转，有效地阀调所述流体。这些阀门的不同组合可用于产生蠕动泵、多路复用控制，并分隔所述芯片的不同区域。
[0144]实施例1.2:细胞捕获
[0145]为了提高捕获效率，降低捕获器设计的大小选择性，并试图表征捕获器尺寸如何影响对不同细胞类型的捕获效率，设计了各种不同的捕获器几何体并对两种不同细胞系测试:K562细胞，平均直径18微米的人红白血病细胞系；以及nBAF3，平均直径12微米的鼠pro-B-细胞系。
[0146]制造了 96种不同捕获器几何体，并在6种独立的装置中测试。细胞捕获测试装置的示意图如图2a所示。单个装置能够分析16种不同的捕获器几何体，在单个柱中各自重复83次，各个捕获器分开150微米。使用二元多路分用器(装置的顶部)来选择所需的捕获器几何体，且使用微流体蠕动泵(装置的底部)来泵送细胞流经所述装置。比例尺为500微米。该插图显示了包括两个细胞捕获器的放大区域。筛选几何体的测试参数为:“a”流体聚集器和捕获堰之间的距离，“b”从所述堰移除部分(即，筛元件)的宽度，“c”所移除部分(即，筛元件)的数目，和“d”捕获堰的尺寸。该插图的比例尺为100微米。图2b和2(:分别显示了原始的和优化的捕获器几何体。图2d显示了接近图2c所示捕获器几何体的单个K562的光学显微图。图2e显示了被捕获后的同一细胞。在B-E中的比例尺为100微米。
[0147]优化了制造方案，从而能够可重复地制造出贯穿晶片的高的长宽比(7:2至14:1的范围)。在所有情况下，所述通道包含捕获器，在这些实施方案中，形成堰的捕获笼高为14微米，且所述漏斗由两个10微米宽的障碍物成角度组成。
[0148]细胞捕获器和漏斗之间的距离在22.5至8.5微米之间变化，对应于K562细胞平均直径大约1.25-0.5x范围，以及nBAF3细胞平均直径大约1.9-0.7x范围。对细胞进入细胞捕获室的观察表明，具有捕获细胞距离漏斗8.5微米的几何体使得单细胞填充系数最大化。然而，虽然该距离使填充系数最大化，还观察到阻碍数目的增加，因而选择10.5微米的距离在最终的装置中集成。
[0149]捕获笼的尺寸在12x12微米至20x36微米之间变化。如所预期，随着杯尺寸增加，观察到含有多于一个单细胞的捕获器数目也增加了。
[0150]还测试了去除1、2、3和4个部分以产生宽度在1-6微米(1，2，4，6)范围变化的筛元件。对细胞进入捕获器的观察表明，宽6微米的筛元件允许一些细胞挤压通过所述捕获器。在从捕获器中去除一个或两个部分(即在捕获器中产生一个或两个筛元件)之间没有任何可观测的差异。为了确定是否有足够的流体流经具有筛元件的捕获器，从而所述漏斗能够从该设计中去除，选择具有不同数目筛元件的捕获器进行了无漏斗的测试。在所有情况下，在不是直接位于漏斗下游的捕获器中没有观察到细胞被捕获。
[0151]因此，测试96种不同的捕获器几何体后，位于距离流体聚集器10.5微米处的12x12微米捕获杯，且从捕获堰中去除两个4微米片段，针对K562细胞观察到满意的捕获效率。
[0152]实施例1.3:细胞裂解
[0153]因其易于整合至微流控装置而选择了两种细胞裂解方法:涉及把样品加热至85°C达 7min 的热裂解，或由 Invitrogen SuperScript? III CellsDirect cDNA 合成试剂
盒中提供的热灭活化学裂解缓冲液。为了评估每种方法对从细胞中释放的miRNA的相对效率，并确定所述化学裂解缓冲液`是否会抑制进一步反应，将K562细胞样品系列稀释并使用每种方法裂解。随后，将从这些样品中释放的miRNA逆转录为cDNA，并用qPCR定量每个样品中的量。
[0154]该测试的结果可见于图3中。化学裂解的效率更接近类似于每10-倍稀释约-3.3个循环的预期值。然而，化学裂解所增加的益处，由于使用其需要在最终装置上添加额外的室从而牺牲重要的密度这一事实而被降低。
[0155]实施例1.4:细胞上样和芯片上细胞洗涤
[0156]如图4中所示的初步结果表明，不可能区分背景信号和来自单细胞的信号。然而，排除了该信号仅来自试剂污染的可能性，因为在芯片上细胞没有流经的区域不同于其余背景。该结果显示，在悬浮细胞的介质中存在不可忽视量的游离漂浮miRNA。该问题的解决方案是，在细胞裂解之前用干净的培养介质洗涤捕获器中所捕获的细胞，由此洗涤任何游离漂浮的miRNA、过量的细胞和来自所述芯片的任何其他碎片。
[0157]实施例1.5:RT-qPCR的细胞裂解物抑制作用
[0158]高浓度的细胞裂解物抑制分子生物学反应。为了确定最佳的细胞裂解物稀释度，以便能对样品进行随后的RT和qPCR反应，进行了下述实验。将芯片外制备的IOx系列稀释的K562细胞裂解物(每个捕获室10个细胞至1/1000细胞等同物)上样至常规微流控装置，其含有测试各种细胞裂解物至RT体积稀释比率的一系列室。所有反应均在技术上一式三份进行。将人工合成的来自秀I?隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) (celnir-2)的miRNA种类以0.2ng/nL的恒定浓度加入至逆转录混合物中。进行标准的miRNA脉冲逆转录38，39，将来自该反应的产物稀释5倍，进行芯片上qPCR，分析合成的秀丽隐杆线虫miRNA。
[0159]由于在K562细胞中没有发现分析的miRNA，可推测由于不同浓度的细胞裂解物对RT-qPCR的抑制效果。该实验的结果如图5所示。lnL、2nL、4nL和8nL RT室体积时，在每个捕获室10个细胞的浓度下观测到循环阈值(Ct)的增加。该Ct值的增加直接对应于由于细胞溶裂物的反应抑制。因此，为了解释各种细胞大小和类型，优选约13x稀释的最小RT室体积(0.6nL细胞捕获室进入8nL RT室)来充分稀释所述细胞裂解物，从而下游的RT-qPCR反应不受抑制。
[0160]实施例1.6: RT-PCR 稀释
[0161]测试了 1:2.1至1:21稀释比率的RT-PCR，以确定该稀释度对qPCR性能的影响。将K562裂解物于试管中处理，逆转录，并以不同的稀释度加入至PCR混合物中。[0162]图6显示了不同的RT-PCR稀释度对qPCR性能的影响。从左至右的点表示稀释系数2.1、3、4、5、6、7、8、10、16和21。将所有结果归一化至1: 5，因其在由ASDF提出的方案中使用。由该图可知，在低(1:2.1,1:3)稀释系数下可看到反应抑制。模板的总浓度，以及因此分析的灵敏度随更高的稀释系数而降低。因此5x的稀释系数被用作所述最终装置中的稀释系数。误差线表示两个样品的标准偏差。
[0163]实施例1.7:预扩增验证和洗脱效率
[0164]设计、制造并测试了包括上述指出的设计考虑的装置，以便验证细胞捕获、洗涤和裂解的综合功能，然后进行逆转录和预扩增，并测试样品洗脱策略。该装置的示意图如图7所示。该装置特征在于能够平行捕获10个单细胞，InL细胞处理室，15nL逆转录反应室，75nL PCR预扩增反应室，用于单独分配每个样品的因子多路分用器，以及蠕动泵。
[0165]10个K562单细胞被捕获和裂解。然后将人miRNA16 (hsa-mir_16)逆转录，通过qPCR确定相对拷贝数。该实验的实时PCR曲线如图8所示。所有细胞均表达miRNA16，且所有曲线均出现平均循环阈值26，标准偏差在平均值的ICt内。
[0166]实施例1.8:洗脱方法
[0167]如上所述，用于验证所述生物化学分析的综合功能的设计如图7所示，其包括因子多路分用器以便能够独立地分配每个室，以及微流体蠕动泵。整合了这两个设计特征以测试洗脱方法。由于qPCR测量溶液中DNA的相对起始浓度，用同样的体积洗脱每个室很重要。测试了多种洗脱方法:40000微流体蠕动泵循环，压力驱动流体一段时间，洗脱至Whatman滤纸，然后将DNA重悬于TE缓冲液中，洗脱然后干燥样品并以已知体积重悬，用Harvard Apparatus公司注射泵(PHD2000)将流体注射至所述装置中。各测试结果总结于表1中。所有提供的数据均为10个重复的平均值，误差测量为测量值的标准差。
[0168]表1.测试洗脱方法测量结果的总结
[0169]
【权利要求】
1.微流控装置，其包括: (a)细胞捕获室，其具有至少一个入口和至少一个出口，其中每个入口和出口具有开启和关闭位置，以此当所述入口处于开启位置时流体能够流入细胞捕获室，而当所述出口处于开启位置时流体能够流出细胞捕获室，并且以此当所述入口处于关闭位置时将阻止流体流入所述细胞捕获室，而当所述出口处于关闭位置时将阻止流体流出所述细胞捕获室，其中流经所述细胞捕获室的方向指示了所述细胞捕获室的上游和下游方向； (b)细胞漏斗，其位于细胞捕获室中，且可操作地引导细胞通过所述细胞捕获室流向细胞捕获室中的一个或多个期望的位置；和 (C)细胞捕获器，其通常位于所述细胞漏斗的下游，以此将所述细胞捕获器定位以接收从所述细胞漏斗向下游流动的细胞。
2.根据权利要求1所述的微流控装置，其进一步包括: (a)与流体注入通道流体连通的第二入口，所述上游入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室；和 (b)与一个或多个辅助室流体连通的第二出口，所述下游出口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体流出所述细胞捕获室并进入一个或多个辅助室，而在所述关闭位置阻止流体从所述细胞捕获室进入一个或多个辅助室。
3.根据权利要求1所述的微流控装置，其进一步包括与流体注入通道流体连通的第二入口，所述第二入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。
4.根据权利要求1所述的微`流控装置，其中所述细胞捕获室具有一个入口和一个出口，其中所述入口与流体注入通道流体连通，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞漏斗施加力以引导细胞流向所述细胞捕获室中一个或多个期望的位置。
6.根据权利要求5所述的微流控装置，其中通过所述细胞漏斗施加于细胞的力选自以下一种或多种:机械力；重力；电磁力；静电力；磁力；声学力；水力和光学力。
7.根据权利要求5所述的微流控装置，其中通过所述细胞漏斗施加于细胞的力为水力。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞捕获器选自以下一种或多种:机械力捕获器；水力捕获器；介电泳力捕获器；磁力捕获器；声学力捕获器；亲和力捕获器；光学力捕获器和膜片钳捕获器。
9.根据权利要求8所述的微流控装置，其中所述细胞捕获器为水力捕获器。
10.根据权利要求2所述的微流控装置，其中所述第二出口与第一辅助室流体连通。
11.根据权利要求10所述的微流控装置，其中所述第一辅助室与第二辅助室流体连通，其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从所述第一辅助室流向所述第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从所述第一辅助室流向所述第二辅助室。
12.根据权利要求10所述的微流控装置，其中所述第一辅助室与第二辅助室流体连通，且所述第二辅助室与第三辅助室流体连通，其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从所述第一辅助室流向所述第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从所述第一辅助室流向所述第二辅助室；其中在所述第二和第三辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从所述第二辅助室流向所述第三辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从所述第二辅助室流向所述第三辅助室。
13.根据权利要求2和10-12中任一项所述的微流控装置，其中所述辅助室的体积是可膨胀的。
14.根据权利要求1、2和5-12中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞捕获室的体积为 0.1-100.0nLo
15.根据权利要求1、3-10和13中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞捕获室的未膨胀体积为0.1-100.0nL0
16.根据权利要求14所述的微流控装置，其中所述细胞捕获室的体积为0.6nL。
17.根据权利要求15所述的微流控装置，其中所述未膨胀的细胞捕获室的体积为0.6nL0
18.根据权利要求1、2、5-12、14和16中任一项所述的微流控装置，其中所述第二辅助室和第一辅助室之间的比率为5:1。
19.根据权利要求1、2、5-10、13、15和17中任一项所述的微流控装置，其中所述膨胀的细胞捕获室和未膨 胀的细胞捕获室之间的比率为5:1，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率为5:1。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的微流控装置，其中所述装置包括1-10个细胞捕获器和对应的细胞漏斗。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞漏斗包括各自具有近端和远端的一对细胞导流板，其中所述近端位于所述捕获室的对侧，而其中所述细胞导流板的每个远端相对于近端在下游方向对角线上成角度，以此所述细胞导流板的远端提供开口，其大小允许在所述细胞导流板的远端之间通过细胞。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞捕获器大体为杯形的。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的微流控装置，其中所述细胞捕获器提供流体流经所述细胞捕获器。
24.细胞捕获和制备方法，所述方法包括: (a)使细胞在流体中流经室； (b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器； (c)在所述室中捕获预定数目的细胞； (d)中断流体中的细胞流； (e)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和 (f)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。
25.细胞捕获和制备方法，所述方法包括: (a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器； (c)在所述室中捕获预定数目的细胞； (d)中断流体中的细胞流； (e)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内；和 (f)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除。
26.根据权利要求24和25所述的方法，其中所述方法还包括分析所述洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种:滚环扩增；多重置换扩增；同温DNA和RNA扩增；cDNA末端快速扩增(RACE);简并性寡聚引物PCR ;线粒体DNA PCR ;基因组PCR、数字PCR、RT-PCR ；测序；免疫化学；邻位连接PCR ;免疫PCR ;代谢物分析；酶法分析；报告基因表达分析；和杂交研究。
27.根据权利要求24、25或26所述的方法，其中所述方法还包括: (a)细胞裂解； (b)逆转录；和
(C)扩增。
28.根据权利要求24、25或26所述的方法，其中所述方法还包括: (a)细胞裂解； (b)逆转录；和 (c)定量扩增。
29.细胞分析方法,所述方法包括: (a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nL-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞； (c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和 (d)分离所述室中预定数目的细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述方法还包括分析所述洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种:线粒体PCR ;基因组PCR ;数字PCR ; RT-PCR ; RT-qPCR ;测序；免疫化学；报告表达分析；杂交研究；滚环扩增；多重置换扩增；同温DNA和RNA扩增；cDNA末端快速扩增(RACE);简并性寡聚引物PCR ;线粒体DNA PCR ;基因组PCR ;数字PCR ;RT-PCR ;测序；免疫化学；邻位连接PCR ;免疫PCR ;代谢物分析；酶法分析；报告表达分析；和杂交研究。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法还包括: (a)细胞裂解； (b)逆转录；和 (C)扩增。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述方法还包括: (a)细胞裂解； (b)逆转录；和 (C)定量扩增。
33.细胞分析方法，所述方法包括: (a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞； (c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除； (d)分离所述室中预定数目的细胞； (e)裂解所述室中的细胞； (f)逆转录通过所述细胞裂解所释放的RNA;和 (g)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
34.细胞分析方法,所述方法包括: (a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1-1OOnL ； (b)在所述室中捕获预定数目的细胞； (c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除； (d)分离所述室中预定数目的细胞； (e)裂解所述室中的细胞；` (f)逆转录通过所述细胞裂解所释放的RNA;和 (g)通过定量聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤(f)中所转录的cDNA。
35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其还包括在将所述细胞引导至细胞捕获室之前的细胞分选步骤。
36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其还包括在洗涤之前固定所捕获的细胞。
【文档编号】G01N1/28GK103732731SQ201180072343
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2011年5月27日 优先权日:2011年5月27日
【发明者】卡尔·拉尔斯·真吉斯·汉森, 迈克尔·万因斯伯格, 亚当·怀特, 奥勒哈·彼特里弗, 提姆·利弗, 阿努帕姆·辛哈尔, 威廉·鲍登, 韦罗妮克·勒科特, 丹·达科斯塔, 里奥·吴, 乔治娅·拉塞尔, 达雷克·西科尔斯基 申请人:不列颠哥伦比亚大学