专利名称：抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法。
背景技术：
抗毒素、抗血清(Antitoxin/Antiserum)是指采用特定的抗原免疫动物后,再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体(IgG)或抗体片段[F(ab’ )2]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。由于抗毒素、抗血清原料来源于马匹血浆，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除了要控制免疫马匹的饲养环境和马匹血浆质量外，在抗毒素、抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的关键问题。目前国内外较为成熟的病毒灭活、去除方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂及去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产抗毒素、抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。有机溶剂及去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。参照欧洲药品管理局(EMEA)和我国国家食品药品监督管理局发布的，针对人血液制品的相关技术法规，需要在抗毒素、抗血清生产工艺中增加有机溶剂及去污剂处理灭活病毒的步骤，其中有机溶剂选用磷酸三丁酯，去污剂选用 Triton X-IOO0该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微。但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。因此， 经有机溶剂及去污剂(磷酸三丁酯/ Triton X-100)灭活的抗毒素、抗血清制品中Triton X-100的残留量测定，是涉及其质量控制的关键指标之一。由于目前在抗毒素、抗血清制品中并无Triton X_100残留测定的通用方法，因而难于有效控制经有机溶剂及去污剂灭活病毒的抗毒素、抗血清制品的质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种经有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清中 Triton X-100残留量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量，并且方法准简便、快速。本发明通过下列技术方案实现一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液、供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗毒素/抗血清中Triton X-100的残留量，其特征在于所述对照品溶液与供试品溶液的制备经过下列各步骤(1)将对照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL溶液中含有5 20 μ g的Triton X-100的对照品溶液；
(2)取供试品抗毒素、抗血清O.5 lmL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，后用体积浓度为5 10%的甲醇溶液清洗，再用ImL甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液。所述采用高效液相色谱法进行测定的色谱条件为反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水溶液为流动相，并采用紫外检测器，其检测波长为220 240nm。所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9 : I 7 : 3。所述步骤(2)中固相萃取柱的活化是先用ImL的甲醇通过固相萃取柱，再用ImL 水通过固相萃取柱，即得活化的固相萃取柱。所述甲醇为市购的分析纯产品。所述步骤(2)中的固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱，为ProElut PLS、 Oasis HLB, BOND ELUT PLEXA 中的一种。所述步骤(2)中的供试品抗毒素/抗血清是指经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清。本发明能对破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的Triton X-100残留量进行测定。本发明采用高效液相色谱法对Triton X_100残留量进行测定，在免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物质，对高效液相色谱系统尤其是色谱柱的损害较大，因此需在预处理中进行提纯，除去大分子物质，而Triton X-100在免疫球蛋白制品中的残留量极低，处于ppm极，在预处理的过程中容易损失，影响测定的准确性，所以抗毒素、抗血清中Tri ton X-100的残留量测定是一个技术难点。为了避免Triton X-100在处理过程中的损失，用水和甲醇清洗预活化的固液萃取柱，且用量不可过大，以ImL为宜。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，从根本上解决了现有技术因免疫球蛋白制品中，含有大量的大分子物质，以及Triton X-100在检测过程中损失大，难于检测出 Triton X-100残留量的准确值等问题，有效地除去供试品中的大分子物质及杂质，最大限度地降低被测物Triton X-100的损失，确保测定结果的准确性，同时本发明提供的方法准确、快速、简便。
具体实施例方式通过以下的实施例对本发明做进一步阐述，但本发明的保护范围并不限于下列实施例所述内容。实施例I
破伤风抗毒素中Triton X-100残留量的测定
仪器1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站 2、Mettler AE 240 电子天平
试剂与试药=Triton X-100对照品(购自Sigma公司，批号118K0095);甲醇为色谱纯 (美国Fisher化学试剂公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。经过下列各步骤(1)将对照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL溶液中含有10μ g的Triton X-100 的对照品溶液；
(2)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品-破伤风抗毒素O. 5mL,过预先
活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为5%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱Oasis HLB ;固相萃取柱的预先活化是先用ImL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用ImL水通过固相萃取柱；
(3 )分别吸取步骤(I)所得对照品溶液与步骤(2 )所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到破伤风抗毒素中 Triton X-100的残留量为I. 5μ g/mL。其中，色谱条件为反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水=8 2体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为 230nm的紫外检测器,色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。实施例2
抗狂犬病血清中Triton X-100残留量的测定
仪器1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240 电子天平
试剂与试药=Triton X-100对照品(购自Sigma公司，批号118K0095);甲醇为色谱纯 (美国Fisher化学试剂公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。经过下列各步骤
(1)将对照品TritonX-100溶解于水中，制成每ImL含5 μ g的Triton X-100对照品溶液；
(2)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品——抗狂犬病血清lmL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为7%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱ProElut PLS ;固相萃取柱的预先活化是先用ImL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用ImL水通过固相萃取柱；
(3 )分别吸取步骤(I)所得对照品溶液与步骤(2 )所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗狂犬病血清中Triton X-100的残留量0. 9 μ g/mL。其中，色谱条件为反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水=9 I体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为 220nm的紫外检测器,色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。实施例3
抗蛇毒血清中Triton X-100残留量的测定
仪器1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站
2、Mettler AE 240 电子天平
试剂与试药=Triton X-100对照品(购自Sigma公司，批号118K0095);甲醇为色谱纯 (美国Fisher化学试剂公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。经过下列各步骤
(I)将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每ImL含20 μ g的Triton X-100对照品溶液；
(2)取经过常规有机溶剂/去污剂法灭活后的供试品-抗蛇毒血清O. 5mL,过预先
活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为10%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液；其中，固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱BOND ELUT PLEXA ;固相萃取柱的预先活化是先用ImL的甲醇溶液通过固相萃取柱，再用ImL水通过固相萃取柱；
(3 )分别吸取步骤(I)所得对照品溶液与步骤(2 )所得供试品溶液，按常规采用高效液相色谱法进行测定后，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗蛇毒血清中 Triton X-100的残留量为2. I μ g/mL。其中色谱条件为反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水=7 3体积比的混合溶液为流动相，并采用检测波长为 240nm的紫外检测器,色谱柱的理论板数按Triton X-100计算不低于1500。
权利要求
1.一种抗毒素/抗血清中Triton X-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行计算， 得到抗毒素、抗血清中Triton X-100的残留量，其特征在于所述对照品溶液与供试品溶液的制备经过下列各步骤Cl)将对照品Triton X-100溶解于水中，制成每ImL溶液含有5 20 μ g的Triton X-100的对照品溶液；(2)取供试品抗毒素/抗血清O. 5 lmL，过预先活化好的固相萃取柱，先用水清洗，再用体积浓度为5% 10%的甲醇溶液清洗，再用ImL的甲醇洗脱，收集洗脱液即为供试品溶液。
2.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱法测定的色谱条件为反相液相色谱柱，以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以甲醇水溶液为流动相，并采用紫外检测器，其检测波长为220 240nm。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9 : I 7 : 3。
4.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述步骤(2)中的固相萃取柱的活化是先用ImL的甲醇通过固相萃取柱，再用ImL水通过固相萃取柱，得活化的固相萃取柱。
5.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述步骤(2)中的固相萃取柱为亲水亲脂平衡型固相萃取柱，为ProElut PLS, Oasis HLB, BOND ELUT PLEXA中的一种。
6.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于所述步骤(2)中的供试品抗毒素/抗血清是指经过有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清。
全文摘要
本发明提供一种抗毒素/抗血清中TritonX-100残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液与供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再通过峰面积与溶液浓度的比例进行常规计算，得到抗毒素、抗血清中TritonX-100的残留量。该法能有效除去大分子物质及杂质，并且在测定过程中有效防止被测定物TritonX-100的损失，确保测定结果的准确性，同时本发明提供的方法快速、简便，能客观地评价制品质量。
文档编号G01N30/89GK102590427SQ20121004373
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者吴笛, 杨冬, 罗靖雄 申请人:玉溪九洲生物技术有限责任公司