专利名称：川芎茶调颗粒制剂指纹图谱的测定方法
技术领域：
本发明属中药技术领域，涉及一种川芎荼调颗粒制剂指纹图谱的测定方法，具体地说是用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱鉴别方法来测定川芎茶调颗粒制剂中特征成分的方法。
背景技术：
川芎茶调颗粒原方出自于宋《太平惠民和剂局方》，具有疏风止痛作用，用于风邪头痛，或有恶寒、发热、鼻塞。此方主要由川芎、荆芥、防风、细辛、白芷、宪活、薄荷、甘草组成 (参见，林晓兰.川芎茶调颗粒临床应用情况分析[J].北京中医，2004，23 (3) =190-192), 其疗效确切。据信川芎茶调颗粒具有抗血小板凝聚，缓解小血管痉挛，改善心脑组织供血供氧，从而达到活血化瘀，活络通脉，疏风止痛之功效。可适用于血管性、神经性、紧张性、颈椎病等引起的各种头痛及偏头痛；适用于风寒感冒、恶寒、发热、鼻塞及鼻窦炎等病症。预防脑溢血发作，脑血栓形成以及改善脑血管疾病后遗症。中国药典2010年版一部第472-274页分别收录了川芎茶调丸和川芎茶调散两种中药成方制剂，其配方为川芎120g、白芷60g、羌活60g、细辛30g、防风45g、荆芥120g、薄荷 240g、甘草60g。川芎茶调丸是使各药材粉碎成细粉后混匀，用水泛丸制成；川芎茶调散则是使各药材粉碎成细粉后直接混匀即可。然而药典收载的两个制剂仅做TLC鉴别，并不作进一步的质量控制，例如并不作含量测定。CN1739612A(中国专利申请号:200510032127. 2，
公开日:2006-03_01，发明名称 疏风止痛的中药制剂及其制备方法和质量控制方法)公开了用于疏风止痛的主要组成成分为川芎、白芷、宪活、细辛、防风、薄荷、荆芥、甘草的川芎荼调滴丸或微丸或微丸胶囊或胶囊或软胶囊，这些制剂的质量控制方法，包括用TLC法进行鉴别，用HPLC法以阿魏酸为指标进行含量测定。其中TLC法条件包括用硅胶G薄层板，以氯仿-石油醚(60 90°C ) (8 9.5 0. 5 2)为展开剂，置紫外光灯(300-400nm)下检视供试品色谱中的荧光斑点。HPLC 法的色谱条件是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以冰乙酸-甲醇-水(0. 5 5 30
50 50 70)为流动相，检测波长为295 355nm，理论板数按阿魏酸峰计不低于2000，并以阿魏酸采用外标法进行定量。中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20 世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA. Guidance of Industv Botanical Drug(Draft) 2000August)。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照西药(合成药)质量控制模式的质量标准不能恰当地反映中药内在的质量。从现行单一指标性成分的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的质量控制方法的转化，已是发展的趋势。中药现行的定量评价方法利用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分、活性成分或指标成分，而大多数品种仅有一般的检查项目。显然，这些质量标准的设置是模仿了化学药品的模式。其它国家如英国、印度、美国草药典、日本药局方中的汉药及德国Commission E编辑的德国草药专论等也采用了基本相同的内容。对于化学药品而言， 其药效成分为结构清晰的单一化合物，构效关系明确，其有效成分含量和纯度可直接表达其安全及有效性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效(活性)成分或指标成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。例如，黄芪所含的黄芪甲苷(aastraga Ioside IV)是当前被选择为质量标准的鉴别和含量测定的最为常见的目标，但并没有依据证明黄芪甲苷与黄芪的功能主治的明确联系。同样，黄连、黄柏、三棵针均含小檗碱，一般都以它作为检测的目标，但是三者的功能主治却截然不同。复方制剂的情况就更加复杂。中医这种不是一对一的非线性的理论和实践说明中药质量应该采用某种宏观的综合的质量评价手段。川芎荼调颗粒是由川芎等8种药材制成的颗粒剂，具有疏风止痛作用，用于风邪头痛，或有恶寒、发热、鼻塞，其治疗效果已经得到临床的验证，然而是否能够保证川芎茶调颗粒的质量，是决定川芎茶调颗粒疗效的基础。如果仅用一、二种有效成分来说明川芎茶调颗粒的内在质量，存在着中药质量控制的片面性，更不用说以无药效成分为质量控制了。因此，要控制川芎茶调颗粒的质量，只针对其一、二个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体从宏观上予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征中药质量。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法， 目前已经得到国际公认。现在，对该品中阿魏酸、甘草酸等的测定方法较多，但如何能够从更宏观的角度采用指纹图谱鉴别方法，对川芎茶调颗粒中的各种化学组分进行控制却未见报道，也是本领域技术人员期待。
发明内容
本发明的目的是提供一种川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，通过此测定办法，可控制川芎茶调制剂质量。本发明人发现具有特定测定条件的测定方法可以有效的用于控制川芎茶调制剂质量。为此，本发明第一方面提供了一种川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，其是照高效液相色谱法测定，包括以下步骤(a)川芎茶调制剂供试品的制备精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取， 提取液离心，上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干， 用70%甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；(b)色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A 为乙腈；流动相B为0. 01 0. 2%甲酸水溶液，检测波长230 280nm ；(c)测定精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱。在本发明中，所述“高效液相色谱法”的一般操作规范可以不作限定。在第一方面
6方法的一个实施方案中，所述的高效液相色谱法可以是记载于包括但不限于下列文件中的方法中华人民共和国药典2010年版二部附录VD、中华人民共和国药典2010年版一部附录VID、中华人民共和国药典2005年版二部附录VD、中华人民共和国药典2005年版一部附录VID等。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，回流提取所用溶剂是20 80%乙醇，优选30 70%乙醇，例如40 60%乙醇，例如约50%乙醇。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，回流提取的时间为10 60分钟， 例如20 40分钟，例如约30分钟。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，所述正丁醇是水饱和的正丁醇。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)为精密称取样品5g，研细，精密加入 25ml 50 %乙醇溶液，加热回流30分钟，放冷，补重，摇匀，离心(例如10分钟，例如4000转/ 分钟)，吸取上清液IOml置蒸发皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水饱和正丁醇萃取三次， 每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70 %甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用0. 45 y m微孔滤膜滤过，即为供试品。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中，经微孔滤膜滤过后，所得供试品可以任选地根据需要作进一步的稀释。根据本发明第一方面的方法，其中在进行步骤(a)操作时，还可以另外进行对照品溶液的配制的操作。在一个实施方案中，包括阿魏酸对照品溶液的制备步骤精密称取阿魏酸对照品适量，加70%甲醇制成每Iml含0. 5mg的对照品溶液，摇匀，即得。在一个实施方案中，包括甘草酸铵对照品溶液的制备步骤精密称取甘草酸铵对照品适量，加70%甲醇制成每Iml含0. 5mg的对照品溶液，摇匀，即得。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱的长度为150mm 250mm,例如约 150mm、200mm、250mm。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱的柱径为4mm 5mm，例如约4. 6mmo根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述色谱柱填料的粒度为2
10u m,例如约5 u mo根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述流动相B为0.02 0. 1%甲酸水溶液，优选约0. 05%甲酸水溶液。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述检测波长240 270nm，优选 250 260nm，优选约 254nm。根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中，所述梯度洗脱程序为
权利要求
1.川芎茶调制剂特征指纹图谱的测定方法，其是照高效液相色谱法测定，包括以下步骤(a)川芎荼调制剂供试品的制备精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取，提取液离心，离心上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干， 用70%甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；(b)色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为O. 01 O. 2%甲酸水溶液，检测波长230 280nm ；(c)测定精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱。
2.根据权利要求I的方法，其特征在于步骤(a)中回流提取所用溶剂是20 80%乙醇、回流提取的时间为10 60分钟、和/或正丁醇是水饱和的正丁醇。
3.根据权利要求I的方法，其中步骤(a)为精密称取样品5g，研细，精密加入25ml 50%乙醇溶液，加热回流30分钟，放冷，补重，摇匀，离心，吸取上清液IOml置蒸发皿中，蒸干，用5ml水溶解，分次用水饱和正丁醇萃取三次，每次25ml，收集正丁醇萃取液，蒸干，用 70%甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，用O. 45 μ m微孔滤膜滤过，即为供试品。
4.根据权利要求I的方法，其特征在于步骤(b)中色谱柱的长度为200mm 300mm、 色谱柱的柱径为4mm 5mm、色谱柱填料的粒度为2 10 μ m、流动相B为O. 02 O. I %甲酸水溶液、和/或检测波长240 270nm。
5.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)中，所述梯度洗脱程序为
6.根据权利要求I的方法，其中步骤(b)中，所述色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱长250mm，柱径4. 6mm,填料粒度5 μ m ;采用梯度洗脱，流动相A为乙腈； 流动相B为O. 05%甲酸水溶液；检测波长254nm ;流速lml/min ;柱温20°C。
7.根据权利要求I的方法，其中以甘草酸铵的相对峰面积为100%计，相对峰面积大于 3%的峰有22个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt = I. 00计，各峰相对保留时间分别约为峰IRt = O.11，峰12Rt ==O.65，峰2Rt ==O.17，峰13Rt ==O.72，峰3Rt ==O.23，峰14Rt ==O.74，峰 4Rt =O. 26，峰 15Rt ==O. 75，峰 5Rt =O. 30，峰 16Rt ==O. 79，峰 6Rt =O. 38，峰 17Rt ==O. 87，峰 7Rt =O. 46，峰 18Rt ==O. 94,峰 8Rt =O. 47，峰 19Rt ==O. 98,峰 9Rt =O. 49，峰 20Rt ==I. 00,峰 IORt ==O. 52，峰 21Rt=I. 01,峰 IlRt ==O. 58，峰 22Rt=I. 04。
8.根据权利要求I的方法，其中以甘草酸铵的相对峰面积为100%计，相对峰面积大于;的峰至少有15个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt = I. 00计，各峰相对保留时间分别约为峰 2Rt =O. 17,峰 12Rt =O. 65，峰 3Rt =O. 23，峰 13Rt =O. 72，峰 6Rt =O. 38，峰 16Rt =O. 79，峰 8Rt =O. 47，峰 18Rt =O. 94,峰 9Rt =O. 49,峰 19Rt =O. 98,峰 IORt ==O. 52，峰 20Rt =I. 00,峰 IlRt ==O. 58，峰 2IRt =I. 01，峰 22Rt ==I. 04。
9.根据权利要求I至8任一项的方法，其中所述川芎茶调制剂的原料药材组成包括川芎120重量份，白芷45 - 75重量份，宪活45广一 75重量份，甘草45 75重量份，防风33- 56重量份，细辛22 38重量份，薄荷180 300重量份，荆芥90 150重量份。
10.根据权利要求9的方法，其中所述川芎茶调制剂是由包括以下步骤的方法制备的(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备用；(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(I)所得药液合并；(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；(4)将步骤(2)所得挥发油均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，再任选地均匀掺入药学可接受的辅料，制成制剂，即得。
11.一种川芎茶调制剂，该制剂的原料药材组成包括川芎120重量份，白芷45 75重量份，宪活45 75重量份， 甘草45 75重量份，防风33 56重量份， 细辛22 38重量份，薄荷180 300重量份，荆芥90 150重量份；并且该制剂按照权利要求I至8任一项的方法测试，具有以下特征的指纹图谱以甘草酸铵的相对峰面积为100%计，相对峰面积大于3%的峰有22个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt = I. 00计，各峰相对保留时间分别约为峰 IRt = 0.11，峰 12Rt = 0.65，峰2Rι = 0.17，峰13Rι =0.72，峰3Rι = 0.23，峰14Rι = 0.74，峰4Rt = 0.26，峰15Rt = 0.75，峰5Rι = 0.30，峰16Rι = 0.79，峰6Rι = 0.38，峰 17Rι = 0.87，峰7Rt = 0.46，峰18Rt = 0.94，峰8Rι = 0.47，峰19Rι = 0.98，峰9Rι = 0.49，峰20Rι = 1.00，峰10Rt = 0.52，峰21Rt = 1.01，峰11Rι = 0.58，峰22Rι = 1.04。
12.根据权利要求11的川芎茶调制剂，其按照权利要求I至8任一项的方法测试，具有以下特征的指纹图谱以甘草酸铵的相对峰面积为100%计，相对峰面积大于10%的峰至少有15个，以甘草酸铵峰的相对保留时间Rt =1.00计，各峰相对保留时间分别约为峰 2Rt =O. 17,峰 12Rt=O. 65，峰 3Rt =O. 23，峰 13Rt=O. 72，峰 6Rt =O. 38，峰 16Rt=O. 79，峰 8Rt =O. 47，峰 18Rt=O. 94，峰 9Rt =O. 49,峰 19Rt=O. 98，峰 IORt =O. 52， 峰 20Rt=I. 00，峰 IlRt =O. 58， 峰 2IRt=1. 01,峰 22Rt =I. 04。
13.根据权利要求11的川芎茶调制剂，其是由包括以下步骤的方法制备的(1)取川芎、白芷、羌活、细辛、防风、甘草，加水煎煮，煎液滤过，药液备用；(2)薄荷、荆芥提取挥发油，备用；其水溶液滤过，滤液与步骤(I)所得药液合并；(3)将步骤(2)所得合并药液，浓缩，干燥，制成浸膏粉；(4)将步骤(2)所得挥发油均匀掺入到步骤(3)所得浸膏粉中，再任选地均匀掺入药学可接受的辅料，制成制剂，即得。
14.根据权利要求11至13任一项的川芎茶调制剂，其中所述制剂选自颗粒剂、片齐IJ、硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂等。
全文摘要
本发明涉及川芎茶调颗粒制剂特征指纹图谱的测定方法，包括以下步骤(a)川芎茶调制剂供试品的制备精密称取川芎茶调制剂适量，加溶剂回流提取，提取液离心，上清液蒸发干燥，再用水溶解，然后用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液，蒸干，用70％甲醇溶解，用微孔滤膜滤过，即为供试品；(b)色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈；流动相B为0.01～0.2％甲酸水溶液，检测波长230～280nm；(c)测定精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到川芎茶调制剂的特征指纹图谱。本发明川芎荼调制剂例如颗粒剂的HPLC特征指纹图谱分析方法操作简单，精密度高，重复性好，适用于川芎茶调制剂例如颗粒剂的质量控制。
文档编号G01N30/06GK102590423SQ20121004465
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者唐靖雯, 张丽艳, 李孟林, 梁斌, 梅基雄, 潘梅, 谢宇 申请人:贵州威门药业股份有限公司