专利名称：花芽内源自由态iaa的提取和定量测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物内源IAA的提取与定量测定，特别涉及花芽自由态IAA的提取和利用HPLC技术对自由态IAA的测定。
背景技术：
卩引哚乙酸(Indole-3-aceticacid),简称IAA,纯品为浅黄色结晶。是一种植物体内普遍存在的内源生长素，对植物体各个部位的生长均很重要。对光和空气很敏感，易溶于甲醇、乙酸乙酯；不溶于苯、甲苯、汽油、水及氯仿。它在光和空气中易分解，不耐贮存。高效液相色谱简称HPLC。高效液相色谱的应用范围广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。且有高压、高效、高灵敏度、分析速度快等优点。此外，高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。目前已知的化合物中，有70%以上的的化合物需要用高效液相色谱法进行分离分析才可以产生好的数据结果。目前，测定植物内源IAA的方法有荧光比色法、气相色谱质谱联用法及高效液相色谱法。前两种方法有的需要衍生，易有干扰而重复性差，前处理繁琐，而且仪器昂贵；高效液相色谱法对于植物激素的分离测定具有灵敏、快速和简便等优点。曾有报道黄瓜条、苹果叶、茶树梢、猕猴桃、拟南芥、发酵液等植物样品中植物激素的HPLC方法，但有关芽体的自由态IAA测定方法很少有涉及。而且不同的植物组织生理差异比较大，花芽中的内源激素-IAA含量甚微，又富含极多的酚类及色素类等干扰测定的杂质。本方法拟用80%甲醇做溶剂提取IAA，甲醇-水(含1%醋酸)为流动相，用高效液相色谱荧光法定量测定
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种花芽内源自由态IAA的提取和定量测定的方法。本发明的技术方案对花芽进行精处理，使花芽内部的自由态IAA可以与其他杂质很好的分离开来，同时用HPLC技术进行精确的定量测定，以更好的测定花芽中自由态IAA的含量。本发明的技术方案内容:A.花芽内源自由态IAA的提取技术；B.利用高效液相色谱法对自由态IAA的定量测定。A.花芽内源自由态IAA的提取技术自由态IAA是很活跃的，在有强光和空气的环境中，IAA纯品会出现氧化等反应，影响测定。为了避免光对试验数据的影响，整个试验要在不影响试验进行的弱光条件下进行I).称取大离心管重量(Ml)，取花芽，重量彡O. 8g，立即用液氮研磨成精细的粉末(M)移入大离心管底部，迅速称取重量(M2)，待测芽体重量M = M2-M1 ；2).向大离心管中迅速加8ml 80%甲醇，封口，迅速在振荡仪上振荡30s，然后置于_20°C浸泡提取24h ；
3).第一次提取结束,在8500rpm下进行离心25min ;4).取第一次离心后的上清液移入新离心管中，沉淀物再用6ml 80%甲醇溶解，充分震荡后在_20°C浸泡提取12h ；5).第二次提取结束,在8500rpm下进行离心25min ;6).取第二次离心后的上清液与第一次的上清液合并，沉淀物再用4ml 80%甲醇溶解，充分震荡后在_20°C浸泡提取6h ；7).第三次提取结束,在8500rpm下进行离心25min ;8).取第三次离心后的上清液与第一、二次的上清液合并，弃掉沉淀物；9).分别用 8ml 乙醇(浓度)、16ml 蒸懼水、IOmlSO1^ 甲醇加入 waters C18 (500mg,3ml)固相萃取小柱活化润洗柱体(柱体内液体要保持自然下滴)；10).将第8步中合并的上清液加入waters C18固相萃取小柱过滤处理，收集流出液，处理完再加入6ml甲醇(浓度)淋洗柱体，收集并合并流出液；11).将流出液用旋转蒸发仪在45°C低压蒸馏至干，然后用Iml 80%的甲醇溶解，收集置于2ml离心管；12).用O. 2μπι的微孔滤膜过滤样液，进样；B.选择良好的高效液相色谱条件，利用高效液相色谱法对花芽内自由态IAA的定
量测定。检测步骤和条件如下高效液相色谱仪Waters2695厂家上海优锦电子有限公司型号Waters2695色谱柱Waters sunf ire C18 色谱柱厂家北京金欧亚科技发展有限公司和型号4.6X 150mm流动相甲醇/ 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4. O)；流速1.OmL/min ；柱温20°C；样品温度10°C;进样量20μ I运行时间30min荧光激发和发射波长分别为275nm和345nm。此定量测定方法是对自由态IAA的测定方法之一，不局限在花芽内IAA。
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本发明的优点在于本发明创制的花芽自由态IAA提取技术及测定条件可以在短时间内就可以针对花芽内部的自由态IAA进行分离和定量测定。同时本发明发现并解决了很多自由态IAA提取的问题⑴很多试验忽略了光对IAA的影响，其实自由态IAA是很活跃的，在有强光和空气的环境中，IAA纯品会出现氧化等反应，影响测定。为了避免光对试验数据的影响，本发明在弱光(不影响操作)下进行。(2)在称取芽体样品实际重量的时候，采用差减法。这个方法可以将芽体重量的误差降到最低。因为花芽中IAA含量极低，任何细微的误差影响都需要考虑到。(3)采用三次浸提法。以前的试验很多只是用一次或者两次浸提法，但是花芽中的杂质要远远多于其他组织，这需要增加浸提次数来提高对IAA的提取量。(4)固相萃取小柱的应用极大的提高了纯化速率，节省了大量时间，同时操作简单，IAA分离度好，为大量的纯化自由态IAA提供了保障。以上的细化操作将大大的提高提取的精度。说明书附图
图IIAA标准品(200 μ g/ml)的高效液相色谱峰值； 图2实施例中Od组样品高效液相色谱峰值；图3实施例中6d组样品高效液相色谱峰值；图4实施例中12d组样品高效液相色谱峰值；图5实施例中18d组样品高效液相色谱峰值；图6实施例中24d组样品高效液相色谱峰值；图7实施例中30d组样品高效液相色谱峰值。具体实施技术以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例I试验材料为4-5年生牡丹(Paeonia suffruticosa)品种“鲁荷红”的健壮植株。花芽形态大小要求在(纵径X横径)I. 60cmX0. 6cm以上,每株有6_8枝,每枝条有正常发育的花芽1-2个，顶芽生长良好。材料处理与取样2010年11月10号‘鲁荷红’起苗，单株栽植于直径33厘米、高22厘米盆内，浇足水，将盆埋入大田，共54盆。待日最低气温达10°C时(II月24号)，此时低温处理0d，取9盆作为对照组T。，取样，选取一定数量植株转移至18_25°C的温室中，直至12月31号。其余45个植株移入4°C冷库，开始低温处理。植株的所有处理安排如下(I)对照(Ttl) :4°C下处理 OcL11月24日Ttl组9盆入温室。入室前，对其中8盆采取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80 0C保存，其余搬入温室。(2)处理一(T1) :4°C条件下处理6d后转至18_25°C温室条件下生长。11月30日9盆入温室。入室前，在其中8盆中选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80°C保存。(3)处理二(T2) :4°C条件下处理12d后转至18_25°C条件下生长。12月6日9盆移入温室。入室前，在其中8盆中选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，-80°C保存。(4)处理三(T3) :4°C条件下处理18d后转至18_25°C条件下生长。12月12日9盆移入温室。入室前，在其中8盆中选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，_80°C保存。
(5)处理四(T4) :4°C条件下处理24d后转至18_25°C条件下生长。12月18日9盆移入温室。入室前，在其中8盆中选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，_80°C保存。(6)处理五(T5) :4°C条件下处理30d后转至18_25°C条件下生长。12月24日9盆移入温室。入室前，在其中8盆中选取健壮顶芽64个，剥去鳞片后，液氮速冻，_80°C保存。花芽内源自由态IAA的提取I.整个试验必须确保在弱光下进行，先称取大离心管重量(M1)，取两个牡丹顶芽(一共不超过O. Sg)立即用液氮研磨成精细的粉末(M)移入大离心管底部，迅速称取重量(M2)，待测芽体重量M = M2-M^ 2.向大离心管中迅速加8ml 80%甲醇，封口，迅速在振荡仪上振荡30s (不要太剧烈，防止芽体粉末挂壁)，然后置于_20°C浸泡提取24h。3.第一次提取结束,在8500rpm下进行离心25min。4.取第一次离心后的上清液移入新离心管中(勿吸到下面的沉淀物)，沉淀物再用6ml 80%甲醇溶解，充分震荡后在_20°C浸泡提取12h。5.第二次提取结束，在8500rpm下进行离心25min。6.取第二次离心后的上清液与第一次的上清液合并(勿吸到下面的沉淀物)，沉淀物再用4ml 80%甲醇溶解，充分震荡后在_20°C浸泡提取6h。7.第三次提取结束,在8500rpm下进行离心25min。8.取第三次离心后的上清液与第一、二次的上清液合并(勿吸到下面的沉淀物)，弃掉沉淀物。9.分别用 8ml 乙醇、16ml 蒸懼水、10111180% 甲醇加入 waters C18 (500mg, 3ml)固相萃取小柱活化润洗柱体(柱体内液体要保持自然下滴)。10.将上清液加入waters C18固相萃取小柱过滤处理，收集流出液，处理完再加入6ml甲醇淋洗柱体，收集并合并流出液。
11.将流出液用旋转蒸发仪在45°C低压蒸馏至干，然后用Iml 80%的甲醇溶解，收集置于2ml离心管。12.用O. 2μπι的微孔滤膜过滤样液，进样。实施例2利用高效液相色谱法对牡丹花芽自由态IAA的定量测定色谱条件如下高效液相色谱仪:Waters2695高效液相色谱仪色谱柱Waterssunf ire C18 色谱柱(4· 6 X 150mm, 5 μ m)流动相甲醇/ 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4. O)；流速1.OmL/min ；柱温20°C；样品温度10°C;进样量20μ I运行时间30min荧光激发波长和发射波长分别为275nm和345nm。
检测结果出峰时间表I牡丹花芽自由态IAA在各个低温培育时期后的色谱出峰时间
权利要求
1.一种花芽内源自由态IAA的提取方法，具体步骤为 1)称取大离心管重量(Ml)，取花芽，重量<0.Sg，立即用液氮研磨成精细的粉末(M)移入大离心管底部，迅速称取重量(M2)，待测芽体重量M = M2-M1 ； 2)向大离心管中迅速加80%甲醇8ml，封口，迅速在振荡仪上振荡30s，然后置于-20°C浸泡提取24h ； 3)第一次提取结束,在8500rpm下进行离心25min； 4)取第一次离心后的上清液移入新离心管中，沉淀物再用80%甲醇6ml溶解，充分震荡后在-20°C浸泡提取12h ； 5)第二次提取结束,在8500rpm下进行离心25min； 6)取第二次离心后的上清液与第一次的上清液合并，沉淀物再用80%甲醇4ml溶解，充分震荡后在_20°C浸泡提取6h ； 7)第三次提取结束,在8500rpm下进行离心25min； 8)取第三次离心后的上清液与第一、二次的上清液合并，弃掉沉淀物； 9)分别用无水乙醇8ml、蒸懼水16ml、80*%甲酉享IOml加入watersC18(500mg, 3ml)固相萃取小柱活化润洗柱体； 10)将第8步中合并的上清液加入watersC18固相萃取小柱过滤处理，收集流出液，处理完再加入6ml甲醇(浓度)淋洗柱体，收集并合并流出液； 11)将流出液用旋转蒸发仪在45°C低压蒸馏至干，然后用Iml80%的甲醇溶解，收集置于2ml离心管； 12)用0.2 y m的微孔滤膜过滤样液，进样； 整个步骤要在不影响试验进行的弱光条件下进行。
2.如权利要求I所述的一种花芽内源自由态IAA的提取方法所提取的花芽内源自由态IAA的检测方法，其特征在于采用高效液相色谱法检测，检测步骤和条件如下 高效液相色谱仪:Waters2695高效液相色谱仪 色谱柱Waters sunfire C18 色谱柱(4. 6 X 150mm, 5 u m) 流动相甲醇 / 水(80% 20% V/V ;1% 乙酸；PH :4.0)； 流速1. OmL/min ； 柱温20°C ; 样品温度10°C ; 进样量20iil 运行时间30min 荧光激发波长和发射波长分别为275nm和345nm。
全文摘要
花芽内源自由态IAA的提取和定量测定，涉及本发明涉及植物内源IAA的提取与定量测定领域，本发明的技术方案对花芽进行精处理，使花芽内部的自由态IAA可以与其他杂质很好的分离开来，同时用HPLC技术进行精确的定量测定，以更好的测定花芽中自由态IAA的含量。本发明的优点在于本发明创制的花芽自由态IAA提取技术及测定条件可以在短时间内就可以针对花芽内部的自由态IAA进行分离和定量测定并大大的提高提取的精度。
文档编号G01N30/08GK102680614SQ20121014489
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者劳俊峰, 张金秋, 王春华, 穆平 申请人:青岛农业大学