专利名称：一种呋喃丹农药生物荧光传感器及其检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与环境微生物领域。
背景技术：
随着农业科学的发展，农药被广泛使用。据统计，我国毎年农药的使用总量达50万 60万吨，其中约有80%的农药直接进入到环境中，毎年使用农药的耕地面积在2. 8亿m2以上，而且在未来若干年化学农药在农业生产中依然是重要的作物保护手段。农药是一把双刃剑，在减少了农作物的损失、提高经济效益的同时，农药在农产品中大量残留给人们的生命和财产造了不可估量的损失。呋喃丹农药是目前大量使用的氨基甲酸酯类农药中的ー种高毒性的农药，在农药 市场中占有非常重要的地位。在防治农作物病虫害方面发挥巨大作用的同时，由于不规范的、不合理的使用，给生态环境带来了严重的污染，含有大量农药残留的蔬菜和水果也给人的身体造成了极大的健康隐患。目前对呋喃丹农药的检测方法主要采用GC、HPLC、GC_MS和LC-MS等传统农残检测方法，但需要仪器昂贵、样品前处理复杂、检测周期长，难以现场实时有效的解决农药残留问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种呋喃丹农药生物荧光传感器及其检测方法，它是ー种具有良好特异性以及高灵敏度，能够快速、简单、准确的检测呋喃丹农药残留的生物荧光传感器及其检测方法。本发明的技术方案是
将重组质粒PK-SX12-EGFP转化进大肠杆菌HBlOl中，建立了ー种绿色荧光蛋白基因(GFP)标记的生物荧光检测系统，是将功能基因片段插入pKEGFP-2载体中EGFP基因上游的MCS位置，而pKEGFP-2载体中EGFP基因位于LacZ上游且反向。因此，载体中GFP的表达只受到其上游基因的影响。当环境中存在呋喃丹农药时，可特异性识别功能基因片段，诱导启动GFP蛋白表达，此时检测荧光強度，并且在一定呋喃丹浓度范围内荧光強度严格受到呋喃丹浓度的控制。本发明的制取方法是
I.采用宏基因组学研究方法，使用BamHI限制性内切酶部分酶切菌株H5基因组，将酶切产物分别插入pKEGFP-2基因载体，在大肠杆菌HBlOl中建立了基因组文库并保存。2.利用多功能微孔板检测仪，进行荧光检測。筛选出荧光增强率最高的克隆子，对该克隆子中含有的质粒进行了测序鉴定，确定407bp为具有响应信号的功能基因片段，命名为SX12，序列如下
TTTCGAGGTTGGAGCTGAAGTAAAAGCTGCTTTTTGTGATAAATATCCTGAATTAGAGTCTGCATTTATGGT
GGGACAAGTCGAGGATAAATATCAGGCAGACCTCTATGCGATTGCTCGATTTATTTTAAGTCGTTTAGGTGTTGAAACCGTTTTGGGTGGGGGACAGTGCTCTTATCAACAGGCGGATGAATTCTTTTCACATCGCCGTAATAGTAAAACAGGA
CGAATGGCAACGTTTGTATTTATGCAATAAATCACATCTTTATGCTGTTGATTCGCCTTGTTGTATCTAAAAATGTT
AAACTTGAGCTAATTCATTGGTTTTTAAATTTTCCATGTCTGTTATTGAGCAAATTACTCCCCAAGTTAAAGTTTGT
GTGATTTATCATAGTCCTTATGGTCAT
3.通过PCR技术扩增了末端含有Sail、XbaI酶切位点的功能基因片段SX12，将其插入pKEGFP-2，构建pK-SX12-EGFP质粒，并转入大肠杆菌HBlOl感受态细胞中。4.对pK-SX12-EGFP功能验证。用三个浓度的呋喃丹诱导培养含有pK_SX12_EGFP质粒的大肠杆菌HB101，检测荧光強度(RFU)，其荧光増加率随呋喃丹浓度正相关。本发明的有益效果是利用分子生物学技术，建立了农药呋喃丹降解菌株H5的基因组文库，并筛选出对呋喃丹农药具有响应信号的功能基因片段(命名为SX12)，利用荧光标记技术构建pKEGFP-2载体，构建生物荧光传感器，通过检测荧光强度来对样品中的呋喃丹农药残留定量及定性检测分析，为呋喃丹农药检测提供技术和方法，在农药残留检测领域有极大应用价值。
图I功能基因片段的筛选原理及方法示意图
图2传感器核心功能质粒PK-SX12-EGFP的构建过程示意图 图3呋喃丹高效生物荧光传感器标准检测曲线 RFU (%)是荧光增强率，fg/L是呋喃丹浓度。
具体实施例方式实施例I :
I.基因组文库的构建及功能基因片段的筛选 I. I H5染色体基因组文库构建
按1%接种量转接菌H5悬浮液于LB液体培养基中，37°C培养12小时，碱法提取总DNA，以BamH I 37°C酶切15分钟，琼脂糖凝胶回收分子量为lkb 3kb左右的DNA片段。将回收的DNA片段与经BamH I完全酶切后(37°C 3小时)的质粒载体pKEGFP-2的线性片段混合后，在T4 DNA连接酶的作用下，22°C连接过夜，并转化大肠杆菌HBlOl感受态细胞，构建系列质粒PKEGFP-H5-X，涂布在含有终浓度为100ug/mL卡那霉素的LB固体平板上，37°C过夜培养后，观察克隆子状态以及数量，存于4°C备用。1.2功能基因片段的筛选及测序 I. 2. I初步筛选
用灭菌牙签小心的将I中所述平板中的克隆子挑入含有50uL LB培养基的EP管中，混匀，编号。依次从每个克隆子的重悬液中分别取2uL加入96孔全黑微孔板同一行相邻的奇数孔和偶数孔，微孔板96孔中均是200uL LB培养基，但奇数列每孔含有浓度为O. 2pg/L的呋喃丹农药。由此，每个微孔板可对48个克隆子进行对比分析。当每板加完第48个克隆子后，轻微震荡微孔板3-5下，置于恒温培养箱中，370C，培养I小吋。利用多功能微孔板检测仪，进行荧光检測。多功能微孔板检测仪检测条件检测温度37°C，中度震荡5秒，激发 波长485nm,发射波长528nm (如图I)。
1.2.2 二次筛选
将2. I所述筛选的阳性克隆子，进行2次平行筛选。分别用浓度20fg/L、200fg/L、2pg/L的呋喃丹诱导培养I小时，检测荧光强度。选取其荧光强度增强率最大的12号克隆子HBlOl (含有质粒pKEGFP-H5-12)，接种至LB培养基中，37°C，200rpm,扩大培养并保存，用于下一歩工作。I. 2. 3 测序
将2. 2所述的12号克隆子经过DNA测序分析，确定407bp具有对呋喃丹农药的响应功能，命名该片段为SX12。I. 3呋喃丹农药生物荧光传感器的构建
通过PCR技术，以实施例I中所述的系列质粒中的12号pKEGFP-H5-12质粒为模版扩增功能基因片段SX12。引物为
引物 I 为 5’ -CGCGTCGAITTTCGAGGTTGGAGC-3’
引物 2 为 5’ -GGCTCTAGAATGACCATAAGGACTAT’
反应体系为ExTap premix 20uL,引物I和2各2uL,质粒模板IuL,去离子水15uL。反应条件为95°C变性5min ；
95°C变性 45s ；
55。。退火 Imin ；
72°C延伸IminJji 30个循环；
72°C延伸lOmin，冷却到室温样品于O. 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增了末端含有Sail、XbaI酶切位点的功能基因片段SX12，将此片段在37°C下，用SalI、XbaI双酶切3小时后，利用琼脂糖凝胶回收，将回收片段与经过SalI、XbaI酶切后的质粒pKEGFP-2线性片段混合后，在T4 DNA连接酶的作用下，22°C连接过夜，构建正确的PK-SX12-EGFP质粒，并转入大肠杆菌HBlOl感受态细胞中，构建HBlOl工程菌，如图2。将上述构建的HBlOl工程菌(含pK-SX12-EGFP质粒)，于37°C，200 rpm，过夜培养，按5%的接菌量转接至50mL LB培养基(含100ug/mL卡那霉素)中，37°C，200 rpm，扩大培养14小吋，将扩大培养的菌液倒入灭菌离心管中，4000 rpm离心15min，弃去上清，菌体沉淀用无菌水重悬，并加入终浓度为30 ug/mL的溶菌酶，涡旋混匀。于ー 20°C至室温反复冻融三次，IOOOOrpm离心20 min，取上清，此上清液即为pK_SX12_EGFP非细胞体系，一 20°C保存，备用。使用考马斯亮蓝法对上述PK-SX12-EGFP非细胞体系总蛋白含量进行測定，调整至蛋白含量为I. Omg/mL，此时pK_SX12_EGFP非细胞体系即为呋喃丹农药生物荧光传感器的工作液，命名为H12-E。I. 4 H12-E标准检测方法以及呋喃丹标准曲线的建立 I. 4. I H12-E荧光检测法
检测工作液H12-E
检测仪器多功能微孔板检测仪
检测条件温度37°C ;发射波长528nm。检测步骤取IOOuL H12-E加入到黑色多孔板中，添加被测样品2uL (被测样品要求为水溶剂，无荧光干扰)，轻微震荡3-5次，37°C孵育30min，置于多功能微孔板检测仪中检测。1.4.2 H12-E荧光检测法标准曲线的测定
将呋喃丹原药用去离子水稀释成Ofg/L、lfg/L、10fg/L、100fg/L、lpg/L、lOpg/L浓度梯度备用。用微量移液器准确量取IOOuL H12-E工作液加入到黒色多孔板中(设置平行以及阴性对照)，分别添加上述稀释好的呋喃丹农药2uL，轻微震荡3-5次，37°C孵育30min，置于多功能微孔板检测仪中检测。结果显示荧光值增强率与呋喃丹浓度成正向相关，标准曲线y=l. 0315Ln(x) +0. 8788，R2=0. 991 (如图 3)。I. 4· 3添加回收率的测定
使用Η12-Ε荧光检测法进行检测，在标准曲线范围内，选取50fg/L和100fg/L的呋喃丹标准品为检测样品，其检测结果记为A和B，向50fg/L的呋喃丹标准样品中人为添加呋 喃丹标准品试剂浓度变为100fg/L，其检测结果记为C。添加回收率公式为R= (C-A)/(B — A) X 100%ο按照上文中添加回收率测定方法，反复检测20次，得H12-E荧光检测法的回收率为 86. 7%-102. 4%οH12-E呋喃丹农药生物荧光传感器的应用
在长春市某菜市场，对大白菜、生菜、芹菜和空心菜随机取样。称取大白菜叶、芹菜叶、生菜叶及空心菜叶各20. 0g，置于IOOmL蒸馏水中浸泡15min，并适当搅拌。自然沉降后，取IOOuL所得洗涤液上清，准确加入900uL蒸馏水中，充分混匀，准确吸取2uL，用H12-E呋喃丹农药生物荧光传感器，对农药残留进行检测分析。结果如下表所示。由检测结果可知，被抽取的样品中均含有不同程度的农药残留，残留量大白菜样品〉芹菜样品 > 生菜样品 > 空心菜样品。
RFU检测值RFU增强率％相对呋喃丹含量(fg/L)
大白菜 1296. 72 7. 015 380. 02 生菜 1272. 63 5. 027 56. 24 芹菜 1287. 34 6. 241 180. 62 空心菜 1267. 33 4. 59 36. 95 蒸馏水 1211.72 0 O
数据分析方法样品中农残含量(mg/kg)=H12-E检出含量X样品稀释倍数/1012取材20. Og,用IOOmL水洗涤样品，取IOOuL洗液上清混与900uL蒸馏水，经过以上3步，将样品中农残稀释了 50 X 1000 XlOX 500=0. 25 X 109倍，由此可换算出，大白菜、芹菜、生菜和空心菜样品中实际农残含量分别为0. 095mg/kg、0. 014mg/kg、0. 0451mg/kg、0.0092mg/kg。依据国家最新的食品农残限量标准GB 25193— 2010，本次抽检中的大白菜和芹菜样品农残均超标，其中大白菜样品农残含量严重超标，生菜样品和空心菜样品合格。
权利要求
1.一种呋喃丹农药生物荧光传感器，其特征是将重组质粒PK-SX12-EGFP转化进大肠杆菌HBlOl中，建立了一种绿色荧光蛋白基因标记的生物荧光检测系统，是将功能基因片段插入pKEGFP-2载体中EGFP基因上游的MCS位置，而pKEGFP-2载体中EGFP基因位于LacZ上游且反向。
2.—种呋喃丹农药生物荧光传感器的检测方法，其方法是载体中GFP的表达只受到其上游基因的影响，当环境中存在呋喃丹农药时，可特异性识别功能基因片段，诱导启动GFP蛋白表达，此时检测荧光强度，并且在一定呋喃丹浓度范围内荧光强度严格受到呋喃丹浓度的控制。
全文摘要
一种呋喃丹农药生物荧光传感器及其检测方法，属于分子生物学与环境微生物领域，其特征是将重组质粒pK-SX12-EGFP转化进大肠杆菌HB101中，建立了一种绿色荧光蛋白基因标记的生物荧光检测系统，是将功能基因片段插入pKEGFP-2载体中EGFP基因上游的MCS位置，而pKEGFP-2载体中EGFP基因位于LacZ上游且反向。当环境中存在呋喃丹农药时，可特异性识别功能基因片段，诱导启动GFP蛋白表达，此时检测荧光强度。益效果是利用荧光标记技术构建pKEGFP-2载体，构建生物荧光传感器，通过检测荧光强度来对样品中的呋喃丹农药残留定量及定性检测分析，为呋喃丹农药检测提供技术和方法，在农药残留检测领域有极大应用价值。
文档编号G01N21/64GK102660490SQ20121014869
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者乔玉龙, 于化东, 于源华, 周帅, 张昊, 张晓 , 王保学, 王岩 申请人:长春理工大学