专利名称：一种从he染色片提取残微核酸的方法
技术领域：
本发明涉及核酸的提取方法，具体涉及一种从HE染色片提取残微核酸的方法。
背景技术：
HE染色是常用的病理制片方法，广泛用于病理诊断和研究。HE染色片是采用两种生物染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色，其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。一方面，经过HE染色的穿刺组织、细胞涂片(包括痰和尿)、胃肠镜等常规病理染色片的肿瘤细胞中含有碱性染料苏木素和酸性染料伊红，造成偏酸或偏碱的外界条件，从而对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作 用，同时生物染料酸根基团与核酸分子结合，阻抑了磁珠和柱子吸附核酸分子的过程，此外HE染色前细胞经过福尔马林一段时间的固定，使细胞DNA/RNA链被破坏氧化损耗断裂，这些因素直接影响从染色片提取的核酸的质量。另一方面，染色片在制作过程由于碱性水漂洗和弱酸染料的中和，及时中断了福尔马林的氧化破坏后，又被优质的核酸固定剂乙醇固定保护，之后组织细胞中的核酸被生物染料弱酸碱根长期均质化结合，在树脂和封片密闭环境中保护了残存的核酸物质，所以HE染色片细胞中残留尚未损耗断裂的微量核酸，在核酸序列完整性上优于保存在蜡块内的组织细胞。相反，蜡块组织保存的细胞持续的在残留的福尔马林环境中氧化破坏，福尔马林气体很难在密封的石蜡固体环境逸出，数月后就产生大量的核酸碎片，很难得到正常长度的核酸片段，使PCR产物出现二聚体导致特异性扩增失败。对后续满足核酸检测量的需要和检测准确性造成的重大不利影响；不能保证稳定性要求极高的临床检测顺利成功进行下去。目前，常用的核酸提取方法包括磁珠法、溶胞法、自动提取法、硅藻玻璃粉吸附法和低温酶解法等。在中国专利申请97125650. 0中，公开了一种从石蜡包埋组织中提取核酸进行基因扩增的方法，采用二甲苯脱蜡法或水浴脱蜡法，再提取核酸DNA进行基因PCR扩增。在中国专利申请03113637. 0中，公开了一种核酸自动提取机，可以完成血液、精液和其它体液样品定量吸取、转移，试剂自动定量添加、振荡，一次性吸液器的装卸，样品控温加热，离心试管合盖，按需自动分离等一系列提取核酸工序的自动化操作。在中国专利申请89104591. 0中，公开了一种核酸提取新工艺，是用低温酶解法的高效率提取核酸的新方法。在中国专利申请94110993. 3中，公开了一种脱氧核糖核酸(DNA)提取工艺，提出了一种从鱼的性腺体如鱼的精巢中提取DNA的生产工艺。在中国专利申请94106094. 2中，公开了一种核糖核酸(RNA)的提取方法，从新鲜海产品中摘取内脏，低温保存后置入碱性缓冲液中，再向上清中加入聚乙二醇沉淀、溶解后加入有机酸，析出变性蛋白，上清再沉淀、洗涤、干燥，即可得到RNA。在中国专利申请98110654. 4中，公开了一种核酸快速抽提方法，采用乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液，与一定比例的待测标本混合，经反应、浓缩、离心后，即可得到用于PCR或RT — PCR的核酸溶液。在中国专利申请200810200588. X中，公开了一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒，可以从人血浆或血清或尿液中纯化出病毒及革兰氏阴性菌的核酸，可以快速、灵敏的大规模纯化核酸。上述这些技术和工艺均是针对新鲜组织细胞，血液或石蜡组织等检材，没有涉及这些检材后续的HE染色片上的靶细胞残微核酸提取和纯化，因此针对以HE染色片为原材料进行残微核酸的提取还处于空白阶段。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种从HE染色片提取残微核酸的方法，通过利用化学上同离子竞争效应解除核酸分子的弱酸根染料基团的结合，可以针对HE切片中残存的长片段核酸进行有效提取和纯化，获得高质量的核酸。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种染色细胞核酸提纯技术，简称染色核酸提纯(tained nucleus-TN),是从HE染色片提取残微核酸的方法先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对染色片进行脱色，然后用草酸 水溶液漂白，再富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。具体步骤包括
(1)将HE染色片浸入二甲苯30min及以上，轻滑掉盖玻片并取出，继续浸泡HE染色片8 12h，更换入新二甲苯，充分祛除中性树胶，得细胞片；更换入新二甲苯，浸泡15 20min ；
(2)取出细胞片用无水乙醇浸泡l(T20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min,然后依次进行95%乙醇浸泡IOmin ；80%乙醇浸泡5min ；70%乙醇浸泡2min ；自来水洗 2min ；
(3)用1%盐酸酒精苏木素脱色细胞片30min以上；
(4)2%草酸水溶液浸泡细胞片3 IOmin；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，富集细胞片上的靶细胞，并立即转到离心管内；
(5)提取靶细胞核酸即可。操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中。所述的HE染色片为从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。步骤(5)中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。近年来，随着核酸提取技术方法及试剂盒质量的进步，对残微核酸的提取纯化有了极大地进步，但还不能满足HE染色片提取核酸的需求。本发明通过创造，仅以微量的I张HE染色片上的靶细胞为材料，先从HE染色片上祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红染料，富集靶细胞，然后再从富集的靶细胞中提取核酸，能够获得临床迫切需要的，难于在病人身上再次捡取的核酸等，成为解决提取病人肿瘤细胞中的DNA/RNA这一困难的新途径。有益效果与现有技术相比，本发明染色核酸提纯技术的从HE染色片提取残微核酸的方法，先对穿刺组织、细胞涂片(包括痰和尿)、胃肠镜的常规HE染色片进行脱色，然后再进行核酸的提取，能够有效祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红，有效的减少了核酸在提取和保存过程中的降解，从而可以利用各种病理切片穿刺组织、细胞涂片(包括痰和尿)、胃肠镜等常规染色片进行残微的核酸的提取及其后续的分子病理检测，为保存优质核酸，利用核酸找到经济环保的新材料和新资源，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
图I是胃镜HE标本提取的DNA电泳 图2是PCR扩增产物电泳 图3是RNA的Q-PCR的扩增曲线 图4是miRNA的Q-PCR的扩增曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例所使用的材料为从各种手术病理石蜡包埋组织(FFPE)、穿刺组织、胃肠镜活检以及各种细胞涂片(包括宫颈，胸腹水，痰和尿等各种手工或仪器离心制片或印片后获取的细胞涂片)中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。实施例I HE染色片的脱色方法
将染色片浸入二甲苯30min，轻滑掉盖玻片，如盖玻片不能自动滑落可适当延长时间；取出盖玻片，继续浸泡染色片8 12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min ;取出细胞片用无水乙醇浸泡l(T20min,充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇,浸泡15min,然后依次进行95%乙醇浸泡10 min ；80%乙醇浸泡5 min ；70%乙醇浸泡2 min ；自来水稍洗2min ;1%盐酸酒精苏木素脱色，镜下控制至细胞片几近无色，约需lOmin，如仍有颜色或原片染色较深可适当延长脱色时间；2%草酸水溶液浸泡细胞片3min 5min，如仍有颜色或原片染色较深可适当延长时间；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞(含有肿瘤组织的细胞)刮下立即转到离心管内，全过程组织细胞禁止裸露在空气中。HE染色片的脱色方法有很多种试剂可供选择，酸性高锰酸钾氧化加草酸漂白是一种被广泛采用较优良的脱色方法。但因为高锰酸钾的强氧化作用，与细胞之间的作用比较剧烈，在其作用下，非常容易导致细胞的部分或完全脱落，从而使载玻片上的肿瘤细胞的数量减少，影响后续DNA/RNA的提取的得率。选用低浓度盐酸乙醇作脱色剂，作用比较温和，涂片可以褪色干净并保持细胞完整，从而保证了核酸提取的量。采用1%盐酸酒精作为脱色齐U，其原理类似于常规染色中的分化作用。盐酸可使留在细胞上的金属根(即苏木精染液中的媒染剂通常是钾明矾)与细胞分离，并阻止苏木精染料色素根与媒染剂中的铝化合形成蓝紫色沉淀色素。草酸具有漂白作用，而且酸能破坏苏木精的醌型结构，使色素与组织解离。从而达到脱色漂白作用。实施例2
选择2008 2011年20例HE染色片(胃镜标本，江苏省中医院病理科提供)，每例一张，20片试验样用实施例I的脱色工艺进行脱色，富集获得靶细胞，然后利用OMEGA bio-tek公司的E. Z. N. A. Tissue DNA Kit试剂盒从富集的靶细胞中提取DNA，利用QIAGEN RNeasy FFPE Kit试剂盒从富集的肿瘤组织中提取RNA，另20片对照样为未经实施例I的脱色步骤而直接用对应的提取试剂盒进行DNA/RNA提取，结果如图I和表I所示，经脱色后提取的DNA电泳条带比未经脱色的组织提取的DNA电泳条带的完整程度较好，图中，上排为对照样(未经过脱色步骤)的DNA，下排为试验样(经过脱色步骤)的DNA，从左到右各泳道分别为DNA、Ladder、空白对照、DNA。具体数值如表I所示，对试验样和对照样提出的DNA浓度进行T值检验，t=4. 900，t>t0. 05(39)，P < 0. 05，说明两组浓度存在统计学差异，试验样提出的DNA的质量好于对照样。表I核酸质量测定结果
权利要求
1.一种从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对染色片进行脱色，然后用草酸水溶液漂白，再富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。
2.根据权利要求I所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于，具体步骤包括 (1)将HE染色片浸入二甲苯30min及以上，轻滑掉盖玻片并取出，继续浸泡HE染色片8 12h，更换入新二甲苯，充分祛除中性树胶，得细胞片；更换入新二甲苯，浸泡15 20min ； (2)取出细胞片用无水乙醇浸泡l(T20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min,然后依次进行95%乙醇浸泡IOmin ；80%乙醇浸泡5min ；70%乙醇浸泡2min ；自来水洗 2min ； (3)用1%盐酸酒精苏木素脱色细胞片30min以上； (4)2%草酸水溶液浸泡细胞片3 IOmin；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，富集细胞片上的靶细胞，并立即转到离心管内； (5)提取靶细胞核酸即可。
3.根据权利要求I或2所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中。
4.根据权利要求I所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于所述的HE染色片为从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的染色片。
5.根据权利要求I所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于所述的核酸包括 DNA、RNA 和 miRNA。
6.根据权利要求I所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于步骤(5)中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。
全文摘要
本发明公开了一种从HE染色片提取残微核酸的方法，先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对HE染色片进行脱色，再用草酸溶液进行漂白，然后再富集靶细胞进行核酸提取。与现有技术相比，本发明的方法，能够有效祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红，有效的减少了核酸在提取和保存过程中的降解，并富集检测所需的靶细胞，从而可以利用穿刺组织、细胞涂片(包括痰和尿)、胃肠镜等全部常规HE染色片进行残微的核酸提取及其后续的分子病理检测，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
文档编号G01N1/28GK102680295SQ20121015796
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者吴晓斌, 孙怡, 徐慧, 李惠, 谢玲, 赖仁胜, 赵明, 赵苏苏, 郑燕影, 陈劼 申请人:南京紫霄科技有限公司, 江苏省中医院, 赖仁胜