高灵敏拉曼光谱检测dna的一种方法
【专利摘要】本发明涉及一种高灵敏拉曼光谱检测DNA的方法。该方法利用磁珠表面上的链替代聚合和银增强作用实现信号的双重放大。磁珠用于分子信标的固定和链替代产物的分离。在目标DNA与分子信标杂交后，信标环被打开，引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物通过引物与信标茎端的杂交与磁珠连接，诱导DNA链聚合反应而释放目标分子，被释放的DNA分子与另一磁珠上的分子信标杂交而产生另一聚合循环。在循环链替代聚合完成后，分离链替代产物，并在纳米复合物表面沉积银纳米壳层，增强染料的拉曼信号。利用拉曼信号与目标DNA浓度与序列的相关性进行DNA分析。这一方法检测DNA的浓度范围是10-13-10-8mol?L-1，并可区分完全配对的目标DNA和单碱基错配的DNA，具有一定的应用价值。
【专利说明】高灵敏拉曼光谱检测DNA的一种方法
一、【技术领域】
[0001]本发明为一种高灵敏拉曼光谱检测DNA的方法。它通过磁珠表面上的链替代聚合和银增强作用进行双重信号放大，利用外磁场分离磁珠上的链替代产物，用拉曼光谱进行高灵敏DNA检测。
二、【背景技术】
[0002]DNA是遗传信息的承担者，DNA分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关。因此，对特定序列的DNA进行分析并进行碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断等方面具有深远的意义。DNA杂交是核酸浓度检测和结构分析的重要手段。DNA杂交检测技术包括荧光、化学发光、电化学和表面等离子共振等，其中荧光分析技术可以进行多种DNA的同时检测。但自身的光猝灭、复杂的操作和不同信号的光谱重叠限制了荧光分析技术的应用。虽然半导体量子点有相对窄的光谱带，其自身的毒性也是一个广泛关注的问题。因此需要发展新颖的分析技术。
[0003]表面增强拉曼光谱检测技术可以弥补荧光检测技术的缺陷。由于其很窄的光谱带、低的光猝灭和自身猝灭，拉曼光谱检测DNA的方法已得到发展。其中之一是利用众所周知的金纳米颗粒进行固定。这一过程需要很长的温育时间、重复的洗涤步骤，并要克服干扰物的非特性吸附。因此本发明建立了一种简便、灵敏的DNA拉曼光谱检测方法。
三、
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:以磁性纳米颗粒为基底固定识别探针分子信标，通过分子信标探针与目标DNA分子，并随后与引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物的杂交将纳米复合物连到磁性纳米颗粒上，利用链替代聚合和银增强作用实现双信号放大，建立一种不需要清洗步骤的检测DNA的灵敏方法。
[0005]本发明通过以下技术方案来实现:
[0006]将目标DNA分子与固定在磁珠表面的分子信标探针进行杂交，打开分子信标环，加入引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物，通过引物与分子信标茎端的杂交将复合物连接到磁珠上，在聚合酶与dNTP存在下诱导DNA链发生聚合反应而释放目标DNA分子，被释放的目标DNA分子与固定在另一个磁珠上的分子信标杂交，产生另一个聚合循环。在循环链替代聚合完成后，利用磁珠分离链替代产物，并在产物连接的纳米复合物表面沉积一层银纳米壳层，增强染料的拉曼信号。检测标准DNA溶液与样品获得的拉曼信号，进行DNA浓度检测与单碱基错配的判别。
[0007]上述的识别探针通过羧基与氨基的共价键合将一端带有氨基的分子信标固定在羧基功能化的磁性纳米颗粒上而获得；引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物可由带有巯基的引物与拉曼染料在银纳米颗粒上的组装制得。
[0008]DNA的高灵敏拉曼光谱检测涉及磁珠表面上的链替代聚合和银增强作用进行双重信号放大(图1)，其具体步骤如下:[0009]I)通过羧基与氨基的共价键将一端带有氨基的分子信标固定在羧基功能化的磁性纳米颗粒上，获得识别探针。同时将带有巯基的引物组装在银纳米颗粒上，进一步组装带巯基的拉曼染料，制得引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物。
[0010]2)将目标DNA分子与识别探针混合，在磁珠表面进行杂交后，打开分子信标环，引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物与分子信标茎端进行杂交，在聚合酶与dNTP存在下，在磁珠表面诱导DNA链聚合反应，并释放目标DNA分子，发生循环链替代聚合，实现第一次信号放大。
[0011]3)在外加磁场的作用下将链替代聚合的产物从混合物中分离出来，与银增强溶液混合，在银纳米颗粒外围沉积一层银壳，以增加拉曼染料的信号强度，获得第二次信号放大。
[0012]4)检测被增强的拉曼染料信号，利用DNA的标准溶液获得检测的工作曲线，从工作曲线进行DNA的分析。
[0013]本方法检测DNA的原理:
[0014]通过目标DNA与固定在磁性纳米颗粒表面的分子信标杂交，打开分子信标，让分子信标的茎端与组装在拉曼染料-银纳米复合物上的引物结合，引发DNA链发生聚合反应而释放目标DNA分子，产生循环链替代聚合信号放大。在分离链替代产物后，在纳米复合物表面沉积一层银纳米壳层，进一步放大染料的拉曼信号，利用被增强的拉曼信号进行DNA浓度检测与单碱基错配的判别。
[0015]本发明与现有技术相比，具有以下特点:
[0016]本发明用制备的拉曼染料-银纳米复合物为示踪探针，利用双重信号放大，通过拉曼光谱检测，建立了一种高灵敏的拉曼光谱检测DNA的方法。相对于现有的检测方法，有以下特点:
[0017](I)通过拉曼光谱检测，操作简单。
[0018](2)拉曼光谱检测在磁性纳米颗粒上进行，不需要重复的洗涤步骤，并且磁性纳米粒子价格低廉。
[0019](3)设计了一种拉曼染料-银纳米复合物为示踪标记探针，可通过银增强作用进行拉曼信号放大。
[0020](4)利用链替代聚合反应使目标DNA可以循环使用，实现放大信号。
[0021](5)双重信号放大提高了检测灵敏度。
四、【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1.拉曼光谱检测DNA方法的示意图
五、【具体实施方式】
[0023]实施例1:引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物的制备
[0024]将200mL 1.0mM硝酸银溶液煮沸后，在搅拌下加入5mL 35mM柠檬酸钠溶液，混合液继续搅拌加热I小时，得到银纳米粒子的胶体溶液，避光4°C保存。进一步在ImL银纳米粒子的胶体溶液中加入100 μ L巯基修饰的引物(10 μ Μ)，搅拌18个小时后，在8000转/分钟下离心15分钟纯化三次，将得到的引物修饰银纳米粒子重新分散在ImL IOmM PBS溶液中。然后，在此溶液中加入4μ L ImM 4-巯基苯甲酸溶液，搅拌12小时后离心纯化三次，得到引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物，重新在ImL IOmM PBS溶液中待用。
[0025]实施例2:磁珠表面分子信标的固定
[0026]将50 μ L羧基化的磁性纳米颗粒分散到ImL PBS (0.01Μ, pH 7.4)中，滴入200 μ L0.1M 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺盐酸盐溶液，400 μ L 0.05Μ N-羟基琥珀酰亚胺溶液和150 μ L 5.4 μ M分子信标，室温下搅拌4小时，利用磁场分离出磁性纳米颗粒，用水清洗几次，得到分子信标修饰的磁性纳米颗粒，重新分散在ImL PBS (0.01Μ,pH7.4)中4°C保存待用。
[0027]实施例3:拉曼光谱检测DNA
[0028](I)在10 μ L分子信标修饰的磁性纳米颗粒分散液中滴入10 μ L不同浓度的DNA溶液、5 μ L引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物溶液、2 μ L聚合酶(4U)和dNTPs (每个核苷酸均为12 μ Μ)，在37°C温育100分钟，然后用磁场分离固定在磁性纳米颗粒表面的链替代产物；
[0029](2)将链替代产物与10 μ L含I: I银增强溶液A与B混合物混合，银增强反应2分钟后进行拉曼检测。
[0030](3)记录不同浓度DNA溶液与样品的拉曼信号，获得DNA检测的工作曲线，并求出样品中的DNA浓度。
[0031](4)通过比较相同DNA浓度下的拉曼信号可进行单碱基错配或不配对DNA序列的判别。
【权利要求】
1.本发明涉及一种高灵敏拉曼光谱检测DNA的方法。这个方法利用在磁珠表面上的链替代聚合和银增强作用来实现信号的双重放大。在目标DNA分子与固定在磁珠表面的分子信标探针杂交后，分子信标环被打开，引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物通过引物与分子信标茎端的杂交连接到磁珠上，诱导DNA链发生聚合反应而释放目标DNA分子，被释放的目标DNA分子与固定在另一个磁珠上的分子信标杂交，产生另一个聚合循环。在循环链替代聚合完成后，利用磁珠分离链替代产物，并在产物连接的纳米复合物表面沉积一层银纳米壳层，增强染料的拉曼信号。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法在磁珠表面结合链替代聚合和银增强作用来实现双重信号放大。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的方法用磁珠表面结合的分子信标探针与目标DNA分子杂交而打开信标茎端，从而通过引物与茎端的杂交将引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物连接到磁珠上。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于引物可诱导DNA链发生聚合反应而释放目标DNA分子，进一步产生另一个聚合循环，从而实现信号放大。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于在拉曼染料-银纳米复合物表面沉积一层银纳米壳层，增强拉曼检测信号。
6.一种利用链替代聚合和银增强作用双信号放大的拉曼光谱检测DNA的方法，其具体分析步骤如下:(1)在反应混合物中，目标DNA分子首先与固定在磁珠表面的分子信标探针杂交，打开分子信标环。(2)引物修饰的拉曼染料-银纳米复合物与被打开的分子信标茎端进行杂交；(3)在聚合酶与dNTP存在下，进行循环链替代聚合；(4)用外加磁场分离固定在磁性纳米颗粒表面的链替代产物，进行银增强反应；(5)检测被增强的染料拉曼信号，利用DNA的标准溶液获得检测的工作曲线；(6)从工作曲线求出样品中不同DNA的浓度。
【文档编号】G01N21/65GK103529011SQ201210232538
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2012年7月6日
【发明者】鞠熀先, 高丰雷, 朱珠, 雷建平 申请人:南京大学