检测胃癌细胞中mt2a表达状态的引物对、试剂盒以及dats在mt2a表达中的应用的制作方法

检测胃癌细胞中mt2a表达状态的引物对、试剂盒以及dats在mt2a表达中的应用的制作方法【专利摘要】本发明提供一种检测胃癌细胞中MT2A基因核酸表达状态的引物对、试剂盒以及DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。所述引物对包括第一引物对或第二引物对，所述第一引物对包括第一MT2A引物和作为内参引物的GAPDH引物，所述第二引物对包括第二MT2A引物和作为内参引物的β-actin引物。【专利说明】检测胃癌细胞中MT2A表达状态的引物对、试剂盒以及DATS在MT2A表达中的应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种检测胃癌细胞中MT2A基因表达状态的引物对、检测胃癌细胞中MT2A基因的试剂盒以及DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。【
背景技术：
】[0002]目前，胃癌仍然是严重威胁国人健康的主要癌种之一，全球胃癌的发病率在所有肿瘤中位于第二位，死亡率仍居第一位，并且中国地区胃癌患者比例占全球的44%。这其中的主要原因一方面是吸烟、饮食、嗜酒、腌制品等不良生活习惯以及如幽门杆菌等微生物感染，另一方面是缺乏有效的胃癌早期诊断和预后评价的指标。虽然传统的放化疗和手术能延缓胃癌患者的生存期，临床病理资料也提示肿瘤期对预后有一定的指导作用，但处于同一分期的胃癌患者的预后也不尽相同，这就要求我们系统寻找更有效的肿瘤标志物来进行胃癌的早期诊断和预后评价。[0003]目前的研究表明，胃癌细胞中的MT2A基因参与了肿瘤的发生、发展及演进过程，进一步研究发现，MT2A基因在胃癌中的表达下调与患者的预后不良有关，因此，MT2A可能是胃粘膜屏障的保护性因素之一。【
发明内容】[0004]本发明的目的在于提供一种检测胃癌细胞和组织中MT2A基因表达状态的引物对，其包括第一引物对或第二引物对，所述第一引物对包括第一MT2A引物和作为内参引物的GAPDH引物，所述第二弓丨物对包括第二MT2A弓丨物和作为内参引物的β-actin引物，其中，所述第一MT2A引物的上游引物核苷酸序列为:[0005]5’-ATGGACCCCAACTGCTCGT-3’，下游引物核苷酸序列为:[0006]5’-ACGGTCACGGTCAGGGTTGT-3’，扩增片段长度为269bp;所述GAPDH引物的上游引物核苷酸序列为:[0007]5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0008]5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增片段长度为472bp;所述第MT2A引物的上游引物核苷酸序列为:[0009]5’-AACCTGTCCCGACTCTAGC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0010]5’-GGAATATAGCAAACGGTCACG-3’，扩增片段长度为318bp;所述β-actin引物的上游引物核苷酸序列为:[0011]5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0012]5’-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’，扩增片段长度为150bp。[0013]本发明还提供了一种胃癌细胞中MT2A基因的核酸检测试剂盒，其含有上述第一引物对或第二引物对。[0014]本发明还提供了一种胃癌细胞中MT2A基因的蛋白检测试剂盒，其特征在于，含有Westernblot蛋白检测试剂盒或免疫组织化学染色(IHC)蛋白检测试剂盒。[0015]另外，为了诱导胃癌细胞中MT2A基因的表达，本发明还提供了一种DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。[0016]采用本发明提供的引物对及核酸检测试剂盒对胃癌细胞样本进行MT2A基因的核酸检测，结果表明，MT2AmRNA低表达或不表达广泛存在于胃癌细胞系中(与正常永生化胃粘膜细胞系GESl相比，胃癌细胞系中MT2A的低表达或不表达率为11/13,84.6%，见图1A)和20例配对的胃癌(T)样本(与配对癌旁形态学正常组织(N)相比，MT2A的低表达或不表达率为17/20，85%，见图1B)。[0017]采用Westernblot蛋白检测试剂盒对胃癌细胞样本进行MT2A基因的蛋白检测，结果表明，MT2A在常见的7种胃细胞系(6种胃癌细胞系和1种永生化胃粘膜细胞系GES1)中发现MT2A蛋白水平的低表达率为85.7%，6/7，见图2A，而在相应5例配对的胃癌组织中，癌⑴中较配对癌旁(N)组织中MT2A的低表达率为100%，10/10，见图2B。[0018]采用IHC蛋白检测试剂盒对正常胃细胞和胃癌细胞样本进行MT2A基因的蛋白检测，结果表明，在171例正常胃粘膜的IHC染色中，MT2A基因表达阳性率为76.0%;在118例癌前病变的肠化胃粘膜组织中，MT2A基因表达阳性率为50.8%;而在684例胃癌组织中，MT2A基因表达阳性率仅为22.4%，P<0.001，见图3A，3B。[0019]本发明具有如下优点:利用本发明所述的引物对及核酸或蛋白检测试剂盒来检测胃癌中MT2A基因的表达状态，结果表明，MT2A基因的低表达状态对于胃癌细胞与组织具有特异性，MT2A基因的表达状态可以作为胃癌诊断中新的分子标志(见图3C)。本试剂盒首次选用MT2A基因作为目标基因，具有首创性。因此，应用本发明提供的引物对及试剂盒来检测胃癌细胞中MT2A基因表达状态可作为胃癌诊断、疗效观察及预后判断等的有效手段，而且操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。[0020]另外，关于DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。本发明人通过DATS处理可以诱导MT2A在胃癌细胞系中的重新表达。[0021]首先，以DATS不同浓度(OμΜ，25μΜ、50μΜ、100μΜ)处理胃癌细胞系BGC82312h，以RT-PCR检测MT2AmRNA的表达，结果如图4所示，以318bp的MT2A扩增产物实时定量结果显示:100μM处理后获得的ΜΤ2Α表达量为未加药组的5.4倍，并通过WesternBlot的蛋白检测发现蛋白表达量随着DATS给药浓度的增加而明显增加，其中IOOyM处理组较未处理组增加了17.8倍(见图4Α);同样，以25μΜDATS处理BGC823不同时间(Oh,0.5h,2h,6h,12h)，随着处理时间的延长，MT2A无论在mRNA还是蛋白水平都有明显的增加，其中12h的DATS处理较0h，MT2AmRNA的表达量上调了5倍，蛋白水平增加了6.4倍(见图4B)。[0022]此外，通过蛋白免疫荧光技术，我们发现增加DATS的处理浓度或延长处理时间，可明显诱导MT2A的荧光蛋白表达(见图5、图6，绿色荧光显示，蓝色为细胞核染色)，其中，处理25μMDATS处理12h后，MT2A的荧光蛋白增加了8.6倍，而在100μMDATS处理组较未处理组增加了18.7倍的绿色荧光表达量。[0023]本发明具有如下优点:MT2A在胃癌中的广泛性低表达可能参与了胃癌发生、发展的生物学过程，作为大蒜素的有效抗肿瘤成分DATS，可明显诱导MT2A在mRNA和蛋白水平的表达，具有DATS处理时间与浓度的正向依赖关系，这为DATS抗肿瘤的分子机制研究提供了一定的科研思路。【专利附图】【附图说明】[0024]图1表示MT2AmRNA在胃癌细胞与组织中低表达。图1中，A:MT2AmRNA在胃癌细胞系低表达(与正常永生化GESl细胞相比，84.6%，11/13)；B:MT2AmRNA在20对胃癌组织中低表达(与配对正常组织相比，85.0%，17/20，N代表正常配对组织，T代表胃癌组织)。[0025]图2表示MT2A蛋白在胃癌细胞与组织中低表达。图2中，A:MT2A蛋白在胃癌细胞系中低表达(与正常永生化GESl细胞相比，85.7%,6/7)；B:MT2A蛋白在5对胃癌组织中低表达(与配对正常组织相比，100%,10/10，N代表正常配对组织，T代表胃癌组织)。[0026]图3表示MT2A蛋白低表达与胃癌患者预后不良密切相关。图3中，A:MT2A在胃粘膜恶性病变过程中表达逐渐降低(P<0.001)。B:(a)MT2A在正常胃粘膜中强表达；(b)MT2A在肠化生的癌前病变组织中中强表达；(c)MT2A在中分化胃癌中中低表达；(d)MT2A在低分化胃癌中不表达。C:低表达MT2A的胃癌患者预后不良(P<0.001)。[0027]图4表示DATS诱导MT2A的表达增加。图4中，A:随着DATS处理浓度的增加，MT2A的mRNA和蛋白表达也明显的增加。其中以实时定量PCR的结果显示，100μMDATS处理较未处理者相比，MT2A的表达量上调了5.4倍。蛋白的灰度扫描发现100μMDATS处理较未处理者相比，MT2A提高了17.8倍。B:随着25μMDATS处理时间的延长，MT2A的mRNA和蛋白表达也明显的增加。其中以实时定量PCR的结果显示，DATS处理12h组较未处理者相比，MT2A的表达量上调了5倍。蛋白的灰度扫描发现DATS处理12h组较未处理者相比，MT2A提高了6.4倍。[0028]图5表示DATS处理时间的增加，诱导MT2A荧光蛋白的表达上调。图5中，DATS处理12h后较未处理组能明显上调MT2A的荧光蛋白表达，荧光表达量增加了8.6倍。[0029]图6表示DATS浓度的增加，诱导MT2A荧光蛋白的表达上调。图6中，免疫荧光实验显示随着DATS给药浓度的增加，MT2A的荧光蛋白的表达也明显增加，其中IOOyMDATS处理组的荧光蛋白表达量较未处理组增加了18.6倍。【具体实施方式】[0030]本发明提供的检测胃癌细胞中MT2A基因表达状态的引物对包括第一引物对或第二引物对，所述第一引物对包括第一MT2A引物和作为内参引物的GAPDH引物，所述第二引物对包括第二MT2A引物和作为内参引物的β-actin引物，其中，所述第一MT2A弓丨物的上游引物核苷酸序列为:5’-ATGGACCCCAACTGCTCGT-3’，下游引物核苷酸序列为:5’-ACGGTCACGGTCAGGGTTGT-3’，扩增片段长度为269bp;所述GAPDH引物的上游引物核苷酸序列为:[0031]5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0032]5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增片段长度为472bp;所述第二MT2A引物的上游引物核苷酸序列为:[0033]5’-AACCTGTCCCGACTCTAGC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0034]5’-GGAATATAGCAAACGGTCACG-3’，扩增片段长度为318bp;所述β-Actin引物的上游引物核苷酸序列为:[0035]5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’，下游引物核苷酸序列为:[0036]5’-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’，扩增片段长度为150bp。[0037]其中，所述第一引物对和所述第二引物对均可以用于检测胃癌细胞中MT2A基因表达状态。在本发明的实施例中，所述第一引物对用于不同胃癌细胞系和新鲜配对的胃癌组织中MT2AmRNA表达状态的检测，所述第二引物对用于DATS加药处理后的胃癌细胞中MT2A基因表达状态的检测。本发明并不限于这些实施例。[0038]本发明提供的胃癌细胞中MT2A基因的核酸检测试剂盒含有所述第一引物对或所述第二引物对。[0039]其中，所述核酸检测试剂盒还可以含有半定量PCR反应所需的下列成分:10XBuffer、2.5mMdNTP>TaqE、模板(template)和ddH20。其中的template为胃细胞系的cDNA和胃癌配对组织的cDNA。具体地，在实施例1(I)半定量PCR反应中使用的template为13株胃细胞系的cDNA(12株胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、PAMC82、MKN45、AGS、SNUUSNU7、SNU16、RF_1、RF-48、N87,以及I株正常永生化胃粘膜细胞系GES1)和20例新鲜配对的胃癌组织的cDNA。[0040]所述核酸检测试剂盒还可以含有实时定量PCR反应所需的下列成分:20XPassiveReferenceDye染料、2XMIXPCRbuffer(包括:2XPCRBuffer,2.5mMdNTP和TaqE)、template和ddH20。其中的template为DATS处理BGC823胃癌细胞系所获得的cDNA。具体地，在实施例2(2)实时定量PCR反应中使用的template包括DATS以不同浓度(0、254]?、5(^]\1和10(^]\0处理860823胃癌细胞12h所获得的cDNA和25μMDATS处理不同时间(0、0.5h、2h、6h、12h)所获得的cDNA。[0041]另外，为检测胃癌细胞中MT2A基因的蛋白表达状态，本发明还提供了两种不同蛋白检测试剂盒，即Westernblot蛋白检测试剂盒和免疫组织化学蛋白检测试剂盒。[0042]其中，所述Westernblot蛋白检测试剂盒可以含有Westernblot检测所需的下列成分:MT2A的抗体(例如为蛋白分子量为15kD，abl2228，abeam，美国)、β-Actin的内参抗体(例如为蛋白分子量为43kD，A5441，Sigma，美国)、蛋白电泳液、蛋白转移液、蛋白洗膜液、蛋白封闭液和蛋白显色液以及需检测的相关蛋白，所述需检测的相关蛋白包括:胃细胞系的蛋白、胃癌配对组织的蛋白和DATS处理BGC823胃癌细胞系所获得的蛋白。具体地，在实施例l(2)WeSternblot蛋白检测中需检测的相关蛋白包括:6种胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、MKN45、N87和I种正常永生化胃粘膜细胞系GESl与配对的5对新鲜胃癌组织的蛋白，在实施例2(I)的Westernblot蛋白检测中需检测的相关蛋白包括:不同浓度的DATS(0,25μΜ、50μΜ、100μΜ)处理BGC82312h所获得的蛋白和25μMDATS处理BGC823不同时间(0,0.5h、2h、6h、12h)所获得的蛋白。[0043]具体地，本发明的Westernblot蛋白检测试剂盒需要MT2A的抗体(例如为abl2228、abeam公司、美国，稀释比例为1:800，以IXPBST-(内含0.1%(体积比)的Triton-X-100的PBS稀释抗体)，β-Actin的内参抗体(例如为Α5441，1:10000同上稀释，Sigma,美国),蛋白电泳液(例如为Tris碱3g、甘氨酸14.4g、SDSlg,用去离子水定容到1L),蛋白转移液(例如为Tris碱，2.375g、甘氨酸11.25g、200ml甲醇，加至IL去离子水)，蛋白洗膜液(例如为IXPBST:13.7mMNaCl.0.27mMKCl、ImMNa2HP04、0.2mMΚΗ2Ρ04、0.1%(ν/ν)Triton-X-100)、蛋白封闭液(例如为5%的脱脂奶粉溶于1XPBST)和HRP标记的相同种属的二抗(1:2500稀释,稀释液为IXPBST)和蛋白显色液(例如为superSignalOWestDuraStableperoxideBuffer:superSignaliffestDuraLuminocEnhancersolution=l:1,AmershamBiosciences,英国X[0044]采用上述Westernblot蛋白检测试剂盒进行Westernblot蛋白检测的系统中，首先检测MT2A蛋白在胃癌细胞与组织中的表达差异，所选取的材料为常见的6种胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、MKN45、N87和I种正常永生化胃粘膜细胞系GES1。经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白电泳，总蛋白上样量为50μg，将50μg需检测的相关蛋白加入2XSDS(50mMTris.Cl,pH6.8；IOOmMDTT；2%SDS;10%甘油；0.1%溴酚蓝)凝胶加样缓冲液，100°C变性lOmin，按顺序加样，进行上述电泳液电泳80V105min。电泳结束后，经湿式电转仪(Bio-Rad)用上述转膜液进行转膜(PVDF膜，Pharmacia公司)，冰浴350毫安恒流转膜2h，5%脱脂牛奶室温封闭Ih;然后孵育一抗MT2A(abl2228，abCam,美国)、β-Actin的稀释液(A4551，Sigma，美国)4°C过夜。次日，用上述蛋白洗膜液清洗30min后，加入相应种属的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育lh，最后进行蛋白显色，定影，观察杂交信号。[0045]所述IHC染色蛋白检测试剂盒可以含有IHC检测所需的下列成分:MT2A的抗体(例如为E918-0133、Invitrogen公司、美国)，及免疫组化相关试剂(二甲苯、酒精、5%脱脂奶粉、3%H202、IXPBS、同种属的二抗、DAB显色系统及苏木素核染料和树脂封片剂)、以及胃组织芯片样本。具体地，在实施例1(3)IHC染色蛋白检测中使用的胃组织芯片样品包括:684例胃癌样本，118例癌前病变的肠化生样本和171例正常胃粘膜样本。[0046]具体地，采用上述IHC染色蛋白检测试剂盒进行IHC染色蛋白检测的系统中，MT2A的一抗制备(例如为E918-0133、Invitrogen公司，美国)，稀释比例1:50，以一抗稀释液稀释。所选取的材料为胃组织芯片样品，其中包括684例胃癌样本，118例癌前病变的肠化生样本和171例正常胃粘膜样本。将芯片进行80°C烤片2h后，通过二甲苯脱蜡15min，2次，100%,95%，90%,80%酒精梯。C水化各5min，3%H202修复15min，5%脱脂奶粉(Ig脱脂奶粉溶于20mlIXPBS:)室温封闭lh，上述一抗稀释液孵育，4°C过夜，次日，用IXPBS清洗芯片残余一抗5min,清洗3次,再进行二抗室温孵育30min,DAB显色3_5min,苏木素复染细胞核lmin，用80%，90%,95%,100`%酒精脱水各5min，二甲苯透明30min，树脂封片等对MT2A蛋白染色进行评估。通过2位专业病理科大夫双盲试验对MT2A的染色范围与强度进行评估，汇总。[0047]本发明还提供一种DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。其中，DATS的结构式为:Ch2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2:英文名:diallyltrisulfide，简称DATS，中文名:二烯丙基三硫化物。[0048]以下利用实施例对本发明进行更具体地说明。[0049]实施例1[0050]本实施例用于说明本发明提供的引物对及试剂盒能够检测胃癌细胞中MT2A基因的表达状态。[0051](I)用于说明本发明提供的引物对及核酸检测试剂盒能够检测胃癌细胞与组织中MT2A基因的核酸表达状态。[0052]分别提取相关细胞与组织的RNA并进行半定量PCR，用于检测MT2AmRNA在不同胃癌细胞与组织中的表达状态。[0053]加入Trizol(TrizolTMReagent,Invitrogen公司)裂解提取胃癌细胞和组织的RNA(具体为12株胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、PAMC82、MKN45、AGS、SNUUSNU7、SNU16、RF-1、RF-48、N87，以及I株正常永生化胃粘膜细胞系GES1)和20例新鲜配对的胃癌组织的RNA)。裂解液经氯仿抽提(每ImlTrizol加0.2ml氯仿),异丙醇沉淀(每ImlTrizol加入0.5ml),75%乙醇(每ImlTrizol加入Iml)洗盐，沉淀干燥后以适量DEPC-H2O溶解，1%Argrose胶鉴定，紫外分光光度计测OD值，-20°C保存。取5.0μg总RNA逆转录为cDNA，过程如下:加入0.5μ101180((11')15，701:变性101^11，然后加入6.(^15XFirstStrandBuffer,2.0μ12.5mMdNTPsmix,0.5μIRnasin(40U/μI)和Ι.ΟμΙMMLV(200U/μI)，混匀后37°C孵育lh，最后70°C15min终止反应。MT2A等基因反应体系:10XBuffer5μ1，dNTP(2.5mM)l.5μI,目的上游引物(第一ΜΤ2Α引物的上游引物)(5μΜ)0.3μ1，下游引物(第一ΜΤ2Α引物的下游引物)(5μΜ)0.3μ1，GAPDH引物的上游引物(5μΜ)0.4μ1，GAPDH引物的下游引物(5μΜ)0.4μ1，TaqE(5U/μ1)0.8μ1，templateIμ1，补ddH20至25μI。扩增反应程序如下:95V预变性5min，94°C变性45s，57V退火45s，72V延伸lmin，28个循环，最后72°C延伸10min，4°C，10h，PCR反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳并经测序确认。[0054]结果如图1A所示:在相应的13株胃细胞系中，有11株胃癌细胞系中MT2AmRNA的表达明显低于正常永生化细胞系GES1，其低表达率为84.6%,11/13;在相应配对的20例胃癌样本中发现，癌(T)中MT2A的mRNA表达明显低于配对的癌旁形态学正常组织(N)，其低表达率为17/20，85%，见图1B。[0055]同样，我们在蛋白检测系统进一步发现MT2A的蛋白在胃癌细胞与组织中明显降低。[0056](2)用于说明本发明提供的Westernblot蛋白检测试剂盒能够检测胃癌细胞与组织中MT2A基因的蛋白表达状态(具体为6个胃癌细胞系BGC823、MGC803、SGC7901、MKN45、AGS、N87和I株正常永生化胃粘膜上皮细胞系GESl的蛋白及5对新鲜配对的胃癌组织的蛋白)。[0057]将50μg需检测的相关蛋白加入2XSDS(50mMTris.Cl,pH6.8；IOOmMDTT；2%SDS；10%甘油；0.1%溴酚蓝)凝胶加样缓冲液，100°C变性lOmin，顺序加样，进行蛋白电泳(电泳液配方为Tris碱3g、甘氨酸14.4g、SDSlg，用去离子水定容到1L)。电泳结束后，经湿式电转仪(Bio-Rad)冰浴进行恒流350毫安转膜2h(PVDF膜，Pharmacia公司)(转膜液配方为Tris碱，2.375g、甘氨酸11.25g、200ml甲醇，加至IL去离子水)，5%脱脂牛奶(Ig的脱脂奶粉溶于20mlIXPBST)室温封闭Ih;孵育一抗MT2A稀释液(ab12228，abCam，美国)，稀释比例为I:800,以IXPBST稀释抗体:13.7mMNaCl、0.27mMKClUmMNa2HPO4^0.2mMΚΗ2Ρ04、0.1%(ν/ν)Triton-X-100)和β-Actin(A4551，Sigma)，稀释比例为1:10000，以上述IXPBST稀释抗体，4°C孵育过夜。次日，以IXPBST蛋白洗膜液清洗30min，然后加入相同种属的HRP标记的二抗室温孵育lh，最后用蛋白显色液显影，定影，观察杂交信号。[0058]结果如图2A所示，显示在常见的胃癌细胞系(BGC823、MGC803、SGC7901、AGS、N87，MKN45)中MT2A的蛋白表达较正常永生化胃粘膜细胞系GESl明显降低，MT2A的低表达率为6/7，85.7%，接着在5例配对胃癌样本中显示癌中MT2A的蛋白表达明显低于癌旁形态学正常组织，MT2A的低表达率为100%，10/10，见图2B。[0059](3)用于说明本发明提供的IHC染色蛋白检测试剂盒能够检测胃癌细胞与组织中MT2A基因的蛋白表达状态。[0060]组织阵列为本室采用高纯度的石蜡制备的高质量芯片，每个标本含2个重复点阵。标本来源于1997年至2007年北京大学临床肿瘤学院的胃癌病例手术切除后的石蜡包埋组织。术前未经放化疗，肿瘤的病理分期根据nCC的ρ--Μ法。随访时间为从手术日期至病例死亡或2007年12月I日为止，随访时间为I至120个月(平均57个月)。免疫组化染色采用两步法，ΜΤ2Α(Ε918-0133、Invitrogen，美国)，来自商业化抗体。胃组织芯片样本，其中包括684例胃癌样本，118例癌前病变的肠化生样本和171例正常胃粘膜样本。将芯片进行80°C烤片2h，二甲苯脱蜡15min，2次，100%,95%，90%,80%酒精依次水化各5min，经3%H202封闭内源性过氧化物酶修复15min及5%脱脂奶粉封闭Ih后，滴加一抗(1:50，一抗稀释液稀释)，4°C孵育过夜；滴加二抗，室温孵育30min；DAB显色3_5min，苏木素复染细胞核lmin，80%,90%,95%，100%酒精依次脱水各5min，二甲苯透明30min，树脂封片。[0061]结果如图3A所示，在171例正常胃粘膜中，MT2A高表达的占76%，弱表达的占16.4%，不表达的占7.6%;而在癌前病变的118例胃粘膜肠化生组织中，MT2A高表达占50.8%，弱表达的占26.3%，不表达的占22.9%;在684例胃癌组织中MT2A高表达的仅为22.4%，弱表达的占5.4%，不表达的占72.2%。MT2A在胃癌组织中表达明显下调，具有明显的统计学意义(P<0.001)。在相应的组织染色图3B中，我们也能看到，MT2A在正常胃粘膜中，强阳性表达(a);在肠化组织中，中强度表达(b);在中分化胃癌中，中度表达(c);在低分化胃癌中，不表达(d)。而且进一步发现，低表达MT2A的胃癌患者预后较MT2A高表达的患者预后差，具有明显的统计学意义(图3C，P<0.001)。[0062]实施例2[0063]本实施例用于说明DATS能够上调胃癌细胞中MT2A基因的表达。[0064](I)通过上述实施例1中的半定量PCR和WesternBlot蛋白检测的操作步骤，我们以DATS不同处理浓度和处理时间，分别检测MT2A的mRNA(318bp)和蛋白(15kD)表达水平，其中半定量PCR和WesternBlot蛋白检测中所使用的template分别为不同浓度的DATS(0、25μΜ、50μΜ、100μΜ)处理BGC82312h所获得的cDNA或蛋白以及25μΜDATS处理BGC823不同时间(0h、0.5h、2h、6h、12h)所获得的cDNA或蛋白。[0065]结果如图4所示。随着DATS处理浓度的增加，MT2AmRNA的蛋白表达明显增加，通过灰度扫描检测，100μM的DATS处理，较未给药组，MT2A表达上调了7倍。蛋白的灰度扫描发现ΙΟΟμΜDATS处理较未处理者相比，ΜΤ2Α提高了17.8倍(图4Α)。在以DATS不同时间处理检测MT2A的表达状态是发现，随着处理时间的增加，MT2A的表达也增加。其中以DATS处理12h较Oh比较，发现MT2AmRNA水平增加了6.6倍，蛋白水平增加了6.4倍(图4B)。[0066](2)MT2A的实时定量PCR检测，用于检测DATS(不同时间或不同浓度)处理胃癌细胞对MT2AmRNA表达的影响。[0067]随后，我们对细胞系中DATS对MT2AmRNA的表达水平进行了全定量PCR。采用iCycleriQTMReal-TimePCRDetectionSystem(Bio-Rad)系统，25μI反应体系包括:templateIμI,20XPassivereferenceDye1.25μ1,5μM第二MT2A引物的上游引物和下游引物各1μI以及150bp长度的β-actin上下游引物各Iμ1(5μM)，2.5mMdNTPlyI,2XPCRbuffer(Takara)12.5μ1,2.5UTaqE(Takara)，补ddH20至25μI。PCR循环参数为:95°C预变性5min，94°C40s,57°C,30s,72°C,40s,82°C(末点检测)，30s(45cycles)；95°C,10s，75。。，60s，95。。，60s，50。。，60s。采用标准曲线法分析数据，150bp长度的β-actin引物作为内对照。[0068]结果如图4所示，以实时定量PCR的结果显示，100μMDATS处理较未处理者相比，MT2A的表达量上调了5.4倍。而在DATS处理12h组较未处理者Oh相比，MT2A的表达量上调了5倍。[0069](3)MT2A的免疫荧光检测，用于检测DATS不同浓度或处理不同时间对MT2A荧光蛋白的表达影响。[0070]将贴壁生长的对数期细胞滴在盖玻片上，爬片生长24h，以不同DATS浓度OμΜ、25μΜ、50μΜ、100μM处理12h，或以25μMDATS处理12h，用IXPBS洗2次；4%多聚甲醛固定15min，PBS洗I次；加入0.2%PBST(Triton-X-lOO)于37°C孵育15min，PBS洗I次;依次加入适量体积的胎牛血清封闭，4°C反应lh，用FITC标记的MT2A(1:50PBST稀释，后期显示绿色)，4°C孵育lh，用IXPBS快洗2次，用lOyg/mlDAPI进行细胞核复染(蓝色)lmin,最后用含2%小牛血清的PBS洗6次,3min/次,甘油封片，突光显微镜下观察蛋白分子的表达和在细胞浆或细胞核中的定位。[0071]结果如图5所示，在细胞核染色程度一致的前提下，DATS处理12h的MT2A的荧光蛋白表达明显高于DATS处理Oh组，大约为Oh组的8.6倍。随着DATS不同浓度处理BGC823胃癌细胞，结果如图6显示，MT2A的荧光蛋白表达增加与DATS给药浓度呈正比，尤其在100μMDATS处理后荧光蛋白的表达量大约为未处理组的18.6倍。【权利要求】1.一种检测胃癌细胞中MT2A基因核酸表达状态的引物对，其特征在于，包括第一引物对或第二引物对，所述第一引物对包括第一MT2A引物和作为内参引物的GAPDH引物，所述第二引物对包括第二MT2A引物和作为内参引物的β-actin引物，其中，所述第一MT2A引物的上游引物核苷酸序列为:5’-ATGGACCCCAACTGCTCGT-3’，下游引物核苷酸序列为:5’-ACGGTCACGGTCAGGGTTGT-3’，扩增片段长度为269bp；所述GAPDH引物的上游引物核苷酸序列为:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列为:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，扩增片段长度为472bp；所述第二MT2A引物的上游引物核苷酸序列为:5’-AACCTGTCCCGACTCTAGC-3’，下游引物核苷酸序列为:5’-GGAATATAGCAAACGGTCACG-3’，扩增片段长度为318bp；所述β-actin引物的上游引物核苷酸序列为:5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’，下游引物核苷酸序列为:5’-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’，扩增片段长度为150bp。2.一种胃癌细胞中MT2A基因的核酸检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述的第一引物对或第二引物对。3.根据权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，还含有半定量PCR反应所需的下列成分:10XBuffer、2.5mMdNTP、TaqE、模板和ddH20，其中所述模板为胃细胞系的cDNA和配对胃癌组织的cDNA。4.根据权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，还含有实时定量PCR反应所需的下列成分:20XPassivereferenceDye染料、2XMixPCRbuffer、模板和ddH20,其中所述模板为DATS处理胃癌细胞系所获得的CDNAJy^iiZXMixPCRbuffer包括2XPCRbuffer,2.5mMdNTP和TaqE。5.一种胃癌细胞中MT2A基因的蛋白检测试剂盒，其特征在于，含有Westernblot蛋白检测试剂盒或免疫组织化学染色蛋白检测试剂盒。6.根据权利要求5所述的蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述Westernblot蛋白检测试剂盒含有Westernblot检测所需的下列成分:MT2A的抗体、β-Actin的内参抗体、蛋白电泳液、蛋白转移液、蛋白洗膜液、蛋白封闭液和蛋白显色液以及需检测的相关蛋白，所述需检测的相关蛋白包括:胃细胞系的蛋白、配对胃癌组织的蛋白和DATS处理胃癌细胞系所获得的蛋白。7.根据权利要求5所述的蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述免疫组织化学染色蛋白检测试剂盒含有免疫组织化学染色检测所需的下列成分:MT2A的抗体、二甲苯、酒精、5%脱脂奶粉、3%H202、IXPBS、同种属的二抗、DAB显色系统及苏木素核染料和树脂封片剂和胃组织芯片样本。8.一种DATS在上调胃癌细胞中MT2A基因表达中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述DATS的结构式为CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2。【文档编号】G01N33/68GK103571933SQ201210265253【公开日】2014年2月12日申请日期:2012年7月27日优先权日:2012年7月27日【发明者】吕有勇,潘元明,李文梅,崔建涛,邢蕊申请人:北京市肿瘤防治研究所