专利名称：食品及加工品中萝卜成分检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域：
本发明属于植物源性成分DNA检测技术，具体地说是一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术对食品加工品中植物源成分——萝卜进行快速筛选与检测的试剂盒和方法，萝
卜源成分快速检测方法包括DNA的提取、实时荧光PCR扩增和结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。
背景技术：
萝卜是一种具有辛辣气味、质脆味美的蔬菜。萝卜和其他辛辣植物如蒜米、大葱等形态差异大，分类上属于不同植物科属。根据形态很容易进行鉴别，但食品在进行加工处理后中，往往失去可鉴别的形态特征，为鉴别带来不便。一些企业为了节约成本往往会以次 充好甚至掺杂相近成分，食品经多次混合加工后消费者难以目测辨别食品是否已掺加了萝卜，降低消费者的生活质量。花旗参、人参等中药保健品和蒜米制品等食品加工品中都有疑
似萝卜掺假的报道，而且用萝卜掺假后不易从感官判别，严重损害消费者的利益。食品中是否混有萝卜源性成分，没有一个公认的判定方法或标准，消费者的生活质量难以保障。2010年，韩国驻华大使馆向我国有关部门通报了我国输韩蒜泥制品中存在掺杂萝卜原料进行加工的情况，出口韩国的蒜泥制品中有检出萝卜成分掺假，损害我国的国际声誉。为保障消费者权益维护我国的出口贸易声誉，避免消费市场继续出现用萝卜进行掺假的情况，需要开发一种快速有效的检测萝卜的方法。
发明内容
本发明的目的是针对萝卜orfB基因设计一组特异性引物，建立一种快速筛选和检测萝卜中基因成分实时荧光PCR检测方法，以克服基于外部形态或蛋白的检测方法在食品加工产品检测中的局限性，为食品中可能含萝卜产品检测提供有效工具。本发明的主要原理为设计一组可以特异地识别萝卜序列的两个引物和一个探针，完善检测方法和实验体系通过实时荧光PCR反应使靶DNA累积到IO9 101°拷贝，经过荧光扩增曲线Ct值判别扩增结果。本发明根据萝卜的保守序列设计了一对特异性引物和探针，成熟的实验体系可保证在蒜泥、食品保健品等食品加工制品中检出萝卜成分。使用该方法可灵敏、特异地检出食品加工品中的萝卜成分。该方法可以直接用荧光PCR观察扩增曲线进行判读，简单而快速，特别适用于一些检测一线的单位。本发明涉及的快速检测萝卜源性成分的试剂盒包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两种特征性部分；反应预混液Real time Mix 10 U L、10 U mol/L 上游引物 0. 5 U L、10 U mol/L 下游引物0.5111、10111]101/1探针1111和模板成分211 I,力口 ddH20(灭菌双蒸水)补足至25 y I ；实时荧光PCR扩增检测用的萝卜引物和探针，其序列如下上游引物5，-TCACCTGGGCAirCITTC-3，；
下游引物5 ’ -CTGACTTCGTTCGTTAGAAG-3 ’ ；TaqMan 探针 5，-FAM-TCAATTACCGAGACCTGGACATACAA-TAMRA-3，。阳性对照DNA为含有萝卜源性成分的DNA提取液。实时荧光PCR检测可能含有萝卜成分的食品加工产品中萝卜成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)(I)待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或等同采用相同提取方法的DNA提取试剂盒。(2) PCR 扩增A.在扩增反应管中加入 Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L 上游引物 0. 5 ii L、
10V- mol/L下游引物0. 5 ii L、10 ii mol/L探针I ii L、ddH20(灭菌双蒸水)补足至25 ii I,混匀；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2 ii L (约200ng)，混匀；C.在荧光PCR仪中进行PCR反应35-40个循环，程序为940C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)结果检测 实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，方由Ct值判断结果。根据荧光信号的Ct值进行判断，当待测样品的基因检测Ct值大于或等于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出萝卜基因，样品中不含有萝卜源性成分。当待测样品的结构特异性基因检测Ct值小于或等于36，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出萝卜基因，样品中含有萝卜源性成分。当待检测样品结构特异性基因检测Ct值大于36小于45，应重做实时荧光PCR检测，若重做后Ct值仍小于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出萝卜基因；若重做后Ct值大于45，且阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出萝卜基因。
图I用荧光定量PCR技术检测某待测含萝卜成分样品DNA，样品的扩增曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例I按照以下程序进行检测(I)待测可能含萝卜成分样品DNA的提取A.称取0. Ig样品，转至I. 5mL离心管中。加入600 U L预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 u L，上下颠倒充分混匀，抽提2min ；C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L缓冲液,上下颠倒混匀10次；E.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加A 200 u L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；I.将离心柱放置在一个新的I. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 ii L洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测含萝卜成分食品加工混合样品PCR扩增A.在扩增反应管中加入荧光PCR反应预混液Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L上游引物0. 5 u L、10 u mol/L下游引物0. 5 u L、10 u mol/L探针I u L、ddH20(灭菌双蒸水)补足至25iU，混匀；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2 ii L (约200ng)，混匀；C.在荧光PCR仪中进行PCR反应35-40个循环程序为940C 3min ； (94°C 15s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)结果检测实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，由Ct值判断结果。根据荧光信号的Ct值进行判断，待测样品的结构特异性基因检测Ct值位于28，阳性对照和空白对照结果正常，判断为样品中检出萝卜基因。
权利要求
1.快速检测萝卜源性成分的试剂盒包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两种特征性部分；反应预混液Real time Mix 10 y L、10 y mol/L上游引物0. 5 y L、10 y mol/L下游引物0.L、10ii mol/L探针I U L和模板成分I,加ddH20(灭菌双蒸水)补足至25 U I ； 上下游引物及探针序列 上游引物 5 ’ -TCACCTGGGCATTCTTTC-3，； 下游引物 5’ -CTGACTTCGITCGTTAGAAG-3’ ；TaqMan 探针 5’ -FAM-TCAATTACCGAGACCTGGACATACAA-TAMRA-3’。
阳性对照DNA为含有萝卜源性成分的DNA提取液。
2.萝卜成分快速检测方法包括食品DNA的提取、实时荧光PCR扩增和结果判定。
其中食品DNA提取 A.称取0.lg-0. 2g样品，转至I. 5mL离心管中。加入600 y L预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ； B.在管中加入等体积酚/氯仿600yL，上下颠倒充分混匀，抽提2min ； C.12000g离心5min,吸取上清到一新的离心管中,加入与上清等体积的沉淀液,混勻，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀； D.在沉淀中加入60ii L RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L缓冲液,上下颠倒混勻10次； E.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ； F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入·200 u L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次； G.在离心柱中加入200ii L 70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次； H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液； I.将离心柱放置在一个新的I.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 ii L洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。
实时荧光PCR扩增 在荧光PCR仪中进行PCR反应35-40个循环，程序为940C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s) X35-40cycles ； 结果判定 实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，方由Ct值判断结果。
当待测样品的基因检测Ct值大于或等于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出萝卜基因，样品中不含有萝卜源性成分。
当待测样品的结构特异性基因检测Ct值小于或等于36，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出萝卜基因，样品中含有萝卜源性成分。
当待检测样品结构特异性基因检测Ct值大于36小于45，应重做实时荧光PCR检测，若重做后Ct值仍小于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出萝卜基因；若重做后Ct值大于45，且阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出萝卜基因。
全文摘要
本发明属于食品及其加工品的植物源成分——萝卜源性成分的快速筛查与检测的技术和试剂盒，具体是使用实时荧光PCR技术检测食品中萝卜的物种特异性基因orfB的物种特异性片段。本发明针对orfB基因的保守序列，设计特异性引物和探针，采用实时荧光PCR技术，快速、灵敏、特异地检测orfB基因，从而筛选产品中是否含萝卜源成分。该快速筛查试剂盒和检测技术用于检测混合样品中可能混有的萝卜成分，可以对可疑掺假或掺杂的含萝卜的样品进行核酸扩增反应。该方法快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。
文档编号G01N21/64GK102758019SQ201210268330
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘彩霞, 孙敏, 徐彪, 梁成珠, 高宏伟, 龚方 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心