专利名称：林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种林可霉素残留的检测器具，特别是涉及一种林可霉素残留快速检测的试纸条及其制备方法。
背景技术：
林可霉素(lincomycin, LIN)又称洁霉素,是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素，分子式C18H34N206S，分子量406. 53，具有较强的抑菌活性，主要作用于革兰氏阳性细菌，是RNA依赖的乙酰胆碱酯酶抑制剂。LIN不具备突出的毒性，但是它在食品及药物中的残留通过食物链进入人体后易累积，可导致细菌的耐药性，导致对疾病缺乏治疗效率。因此，各国都对林可霉素有限量要求。中国农业部规定了 LIN在牛、羊、猪、禽中的最高残留限量，其中肌肉 lOOyg/kg、脂肪 lOOyg/kg、肝脏 SOOyg/kg、肾脏 MOOyg/kg。
目前国内外对LIN残留限量常用的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法、高效液相色谱质谱串联法(UPLC-MS/MS)、液相色谱/质谱联用技术(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)等。上述方法不仅需要昂贵的仪器设备和复杂繁琐的操作过程，并且对检验人员的技能要求较高,不适合现场监控和大量样本的筛查。因此,急切需要一种快速简便的LIN检测技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供了一种特异性强、敏感性高、快速简便检测林可霉素的试纸条，还提供了该试纸条的制备方法。本发明的技术方案
一种林可霉素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，夕卜层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体纤维层用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素单克隆抗体。所述支撑层用硬质塑胶片条或不吸水的硬纸条制成；所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述外层保护层为吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层的交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧0. 3 0. 7cm。所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“T T”字型排列印迹，或为“丄丄”字型排列印迹，或为“卜P，字型排列印迹，或为“_| ”字型排列印迹。所述试纸条的制备方法包括以下步骤
(I)偶联林可霉素载体蛋白溶液的制备称取12. 6mg林可霉素置于反应器中，加入500 1000 μ L的PBS缓冲液溶解，得到LIN溶液；称取6. 7mg NaIO4置于另一反应器中，用500 1000 μ L双蒸水溶解，得到NaI04溶液；将NaIO4溶液在搅拌下逐滴加入到LIN溶液中，室温搅拌反应2h ；
称取载体蛋白15mg，用5mL PBS缓冲液溶解，得到载体蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，备用JfLIN与NaIO4的反应液在搅拌下逐滴加入到载体蛋白溶液中，4°C搅拌反应2h ;然后加Λ 50 μ L、2mg/mL的NaIO4溶液，室温搅拌反应2h ;最后将反应液装入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3d，每8h换透析液一次，收集反应液，即得到林可霉素的偶联物溶液；
(2)抗林可霉素单克隆抗体的制备；
(3)林可霉素金标抗体的制备；
(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备；
用所得的偶联物溶液在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤·维素膜层上制备对照印迹；百菌清金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。所述林可霉素金标抗体是由以下方法制备的量取50 IOOmL沸腾的O. 01 O. 05%的氯金酸溶液，向氯金酸溶液中加入2 4mL、0. 5 2%的柠檬酸三钠溶液，反应后获得粒径10 15nm的胶体金颗粒；用O. lmol/L的K2CO3调节胶体金溶胶的pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的标记比将抗LIN单克隆抗体加入到胶体金溶胶中，标记IOmin ;力口Λ 20% 的 PEG 10000 至 PEG 10000 的终浓度为 O. 05%，4°C、1500 3000rpm 离心 20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000rpm离心Ih,弃上清液；将获得的初步纯化的金标抗体蛋白混合物用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得LIN胶体金标记抗体；将I :100 500稀释的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，于4°C低温真空干燥，制备LIN金标抗体。本发明的积极有意效果
(I)特异性强，敏感性高。LIN快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性及亲和力影响较小，且具有较高的标记率。(2)操作简便快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品中10秒左右，2分钟内即可判定检测结果。(3)结果显示形象、直观、准确。本发明试纸条以显示红棕色“ I ”(或“十”、“丁”、“丄”、“ ”)印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“ I ”印迹表示在被检测样品中含有LIN，显示两条棕红色“ I I ”印迹表示在被检样品中不含LIN。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性等人为误判。(4)成本低，投资少。使用该试纸条不需另配仪器设备及其它试剂，可随时随地进行检测，检测费用低廉。采用通常的仪器分析费用为300元每头/份，采用进口 ELISA试剂盒的检测费用为50元每头/份，本发明试纸条的检测费用为8 10元每头/份，检测费用大幅下降，可节省大量仪器和设备费用。(5)应用范围广，便于推广。本发明试纸条操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖及个体养殖等方面。本发明在保障食品安全和保护消费者健康方面具有极其重要的意义，具有较好的经济效益和社会效益。(6)本发明应用高碘酸钠制备免疫原及检测印迹，和其他方法相比，高碘酸钠氧化法是糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构被高碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱，反应过程比较温和，可在常温和中性pH条件下进行，易于操作和控制。
图I为本发明试纸条的结构示意 图2为本发明试纸条的俯视结构示意图。
具体实施例方式 以下实施例是为了进一步说明本发明的内容，并不表示对本发明的限制。文中如没有特别说明，其中的百分含量均为质量百分含量。实施例一参见图I、图2。图中I为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层(测试端)，用玻璃纤维棉制成，金标抗体纤维层3用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素的单克隆抗体。纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜制成，吸水材料层5采用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、金标抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水材料层5从右至左依次粘贴在支撑层I上，彼此交界处的纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上设有用偶联LIN的载体蛋白BSA (牛血清白蛋白)溶液印制的检测印迹6和用羊抗小鼠IgG溶液印制的对照印迹7，两条印迹带平行排列，形成组合印迹带“ I I”。8-1为覆盖在吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，在吸附纤维层2和金标抗体纤维层3交界处对应的保护膜8-1上，偏向于吸附纤维层2 —侧O. 5cm处印有标记线9，标记线9的右端印有箭头及max字样，吸水材料层5 (手柄端)上覆盖有黄色保护膜8-2。用于检测印迹的偶联LIN载体蛋白和金标抗体的制备，以及用于对照印迹的羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备方法如下
(I)LIN与载体蛋白的偶联
采用高碘酸钠法，将LIN与载体蛋白进行偶联，制备免疫抗原。称取12. 6mg LIN置于IOmL反应瓶中，用500 μ L PBS溶解；称取6. 7mg NaIO4置于IOmL反应瓶中，用500 μ L双蒸水溶解；然后将NaI04溶液在搅拌条件下逐滴加入到LIN溶液中，室温搅拌反应2h ;称取载体蛋白BSA(或0VA、KLH)15mg置于IOmL反应瓶中，用5mLPBS溶解，然后置于4°C冰箱中2h，备用；之后将LIN与NaI04的反应混合液逐滴搅拌加入到BSA溶液中，4°C搅拌反应2h ;再次向混合液中加入2mg/mL的NaIO4 50 μ L，室温搅拌反应2h ;将反应混合液装入透析袋，用pH=7. 4的PBS溶液透析3d，每8h换透析液一次，收集得到LIN与载体蛋白的偶联物。(2)抗LIN单克隆抗体的制备
用制备的LIN载体蛋白偶联物以2(^g 5(^g/只的用量免疫BALB/c系小鼠，采用背部皮下多点注射，共免疫四次，每次间隔15 30天。第四次加强免疫后3 4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，用75%的酒精浸泡5 lOmin，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心lOmin，收集脾细胞；将I X IO8个脾细胞与2 X IO7 5 X IO7个的NSO瘤细胞混合，1000r/min离心lOmin，弃上清，将细胞沉淀于37°C水浴中缓缓加入40 50%的PEG4000 (pH 8. 5 9. O) O. 7 I. OmL,作用Imin ;然后缓慢加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min离心lOmin，弃上清；将得到的细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，加入4块96孔培养板(ΙΟΟμ 200μ 7孔)中，置于370C>5%的C02培养箱中培养。培养7 10天后，以5 lOPg/mL偶联LIN的载体蛋白包被酶标板(96孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清。融合后得到阳性细胞克隆(0D492=0. 6以上)325孔，阳性率为83% ;挑取强阳性细胞克隆(0D492=1. 8以上)，进行连续三次的有限稀释克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92 98。再次连续三次的有限稀释克隆化，选取强阳性细胞克隆，继续有限稀释克隆化。经鉴定，其分泌的单克隆抗体特异地与LIN反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达109 10，轻链亚型为K或λ，重链亚型为IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3，针对LIN特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体。(3) LIN金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备 以柠檬酸钠还原法制备胶体金溶胶。在50 IOOmL沸腾的O. 01 O. 05%氯金酸水溶液中加入2 4mL O. 5 2%的柠檬酸三钠溶液，反应后获得粒径15nm左右的胶体金。以O. lmol/L的K2C03调节胶体金pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的标记比将待标记的LIN单克隆抗体加入到上述金溶胶中，标记IOmin后，加20%的PEG 10000至终浓度为0. 05%, 4°C、1500 3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000rpm离心Ih,弃上清；获初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得LIN胶体金标记抗体。将I : (100 500)稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4°C低温真空干燥，制备LIN金标抗体玻璃纤维棉。(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备
以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG。取I份小鼠血清加2份PBS (pH=7. 4)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4°C冰箱2h，4°C、1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS (pH=7. 4)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4°C冰箱内用PBS(pH=7. 4)过夜透析，换液2 3次，4°C、12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以5(^g 100 μ g/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3 4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在I :2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其血清，用于试纸条对照印迹的制备。以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG，方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述。(5)试纸条的检测反应原理
当LIN检测试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待检LIN及金标抗体棉中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层中，扩散过程中待检LIN与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上LIN的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联LIN载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标抗体结合，形成红棕色对照印迹“ I ”，即一条红棕色“ I ”印迹为阳性标记；若样品溶液中无LIN，则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联LIN的载体蛋白检测印迹结合，显示红棕色检测印迹“ I ”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG也与金标抗体结合，显示红棕色对照印迹“ I ”，形成两条红棕色“ I I ”，为阴性标记；如果纤维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。(6)检测方法
a.样品液制备检测鸡肉时，将鸡肉样品绞碎后加入少许盐酸，反应5 10min，之后加入缓冲液，振荡I 2min，倒出提取液进行检测。其他肉类样品液的制备与此相似。b.操作方法将试纸条样品端插入样品液中，插入深度不超过标记线，约10秒取出试纸条，水平放置约2分钟，观察结果。c.结果判断如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“ I ”显示，测检结果呈阳性，说明在被检测样品液中含有LIN ;如果检测试纸条上的纤维素膜出现两条红棕色标记“ I
I ”，检测结果呈阴性，待检样品中不含LIN。 实施例二 试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于
支撑层I用不吸水的硬纸条制成，吸附纤维层2用尼龙膜，金标抗体纤维层3吸附有胶体金标记的抗林可霉素的多克隆抗体，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，检测印迹6中偶联LIN的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)，对照印迹7用兔抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制成。实施例三试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于
吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，检测印迹6中偶联LIN的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(0VA)，对照印迹7用羊抗小鼠IgG溶液在纤维素膜上制成。实施例四试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于
吸附纤维层2用聚酯膜，检测印迹6中偶联LIN的载体蛋白为血蓝蛋白。实施例五试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于
纤维素膜层4上设有用偶联LIN的血蓝蛋白溶液印制的检测印迹6，用羊抗小鼠IgG溶液印制的对照印迹7，检测印迹和对照印迹形成的组合印迹为“十十”、“τ ~Γ”、“ I”、“ h卜”和H ”中的任KLH—种。实施例二 五中，检测样品制备、操作方法和结果判定，均同实施例一。实施例六试纸条的敏感性、特异性检测
以实施例一的试纸条进行检测，其他例子中的试纸条试验结果和此相似。(I)用实施例一的试纸条分别检测添加LIN浓度为0ng/g、100ng/g、200ng/g、400ng/g和800ng/g的鸡肉样品20份；室温条件下操作,用肉眼观测判定；结果显示，Ong/mL的样品全部为阴性；100ng/mL及其以上浓度的添加样品全部为阳性。取试纸条分别检测添加LIN浓度为Ong/g和100ng/g的鸡肉样品500份；室温条件下操作，肉眼观测判定；用Ong/g浓度的添加样品计算假阳性率，假阳性率=假阳性样品数/500。用100ng/g浓度的添加样品计算假阴性率，假阴性率=假阴性样品数/500。结果显示，假阳性为3条，假阳性率为彡1% ;假阴性率为0%。(2)用已知阴性鸡肉样品配制林可霉素类药物的标准样，使其终浓度分别为1000ng/g，用实施例一的试纸条进行检测。结果显示除含LIN的样品呈阳性、含克林霉素的样品呈弱阳性外，与其它多种药物均无交叉反应，说明试纸条的反应特异性较强。
权利要求
1.一种林可霉素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体纤维层用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是所述支撑层用硬质塑胶片条或不吸水的硬纸条制成；吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水纸制成。
3.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
4.根据权利要求I所述的试纸条，其特征是其中偶联林可霉素载体蛋白溶液是由以下方法制备的 称取12. 6mg林可霉素置于反应器中，加入500 1000 μ L的PBS缓冲液溶解，得到LIN溶液；称取6. 7mg NaI04置于另一反应器中，用500 1000 μ L双蒸水溶解，得到NaI04溶液；将NaI04溶液在搅拌下逐滴加入到LIN溶液中，室温搅拌反应2h ； 称取载体蛋白15mg，用5mL PBS缓冲液溶解，得到载体蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，备用；将LIN与NaI04的反应液在搅拌下逐滴加入到载体蛋白溶液中，4°C搅拌反应2h ;然后加入50 μ L、2mg/mL的NaI04溶液，室温搅拌反应2h ;最后将反应液装入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3d，每8h换透析液一次，收集反应液，即得到林可霉素的偶联物溶液。
5.根据权利要求I 4任一项所述的试纸条，其特征是所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
6.根据权利要求I 4任一项所述的试纸条，其特征是所述外层保护层为吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层的交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层一侧O. 3 O. 7cm。
7.根据权利要求I 4任一项所述的试纸条，其特征是所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“Τ ~Γ”字型排列印迹，或为“丄丄”字型排列印迹，或为“ h P，字型排列印迹，或为H，，字型排列印迹。
8.权利要求I所述试纸条的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤 (1)偶联林可霉素载体蛋白溶液的制备 称取12. 6mg林可霉素置于反应器中，加入500 1000 μ L的PBS缓冲液溶解，得到LIN溶液；称取6. 7mg NaI04置于另一反应器中，用500 1000 μ L双蒸水溶解，得到NaI04溶液；将NaI04溶液在搅拌下逐滴加入到LIN溶液中，室温搅拌反应2h ;称取载体蛋白15mg，用5mL PBS缓冲液溶解，得到载体蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，备用；将LIN与NaI04的反应液在搅拌下逐滴加入到载体蛋白溶液中，4 °C搅拌反应2h ;然后加入50 μ L、2mg/mL的NaI04溶液，室温搅拌反应2h ;最后将反应液装入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3天，每8h换透析液一次，收集反应液，得到林可霉素的偶联物溶液； (2)抗林可霉素单克隆抗体的制备； (3)林可霉素金标抗体的制备； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备；用所得的偶联物溶液在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制备对照印迹，百菌清金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。
9.根据权利要求8所述试纸条的制备方法，其特征是所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
10.根据权利要求8或9所述试纸条的制备方法，其特征是所述林可霉素金标抗体是由以下方法制备的 量取50 IOOmL沸腾的O. 01 O. 05%的氯金酸溶液，向氯金酸溶液中加入2 4mL、O.5 2%的柠檬酸三钠溶液，反应后获得粒径10 15nm的胶体金颗粒；用O. lmol/L的K2C03调节胶体金溶胶的pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的标记比将抗LIN单克隆抗体加入到胶体金溶胶中，标记IOmin ;加入20%的PEG 10000至PEG 10000的终浓度为O. 05%，4°C、1500 3000rpm离心20min,除去未结合的胶体金颗粒,4°C、15000rpm离心Ih,弃上清液；将获得的初步纯化的金标抗体蛋白混合物用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得LIN胶体金标记抗体；将1 :100 500稀释的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，于4°C低温真空干燥，制备林可霉素金标抗体。
全文摘要
本发明涉及一种林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法。试纸条底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为吸附纤维层、吸附偶联林可霉素的金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上有用林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹以及用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便快速；检测结果显示形象、直观、准确，检测时不需专用仪器设备和专业人员，成本低，投资少，容易推广实施。
文档编号G01N33/577GK102818895SQ20121028164
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者胡骁飞, 张改平, 邢广旭, 职爱民, 王方雨, 张小辉, 杨继飞 申请人:河南省农业科学院