专利名称：乳香药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材指纹图谱的建立方法，尤其是乳香药材HPLC-ELSD指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的乳香药材标准指纹图谱。属于药物分析技术领域。
背景技术：
中药指纹图谱特指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。指纹图谱技术是评价中药质量的重要手段，有利于实现中药现代化。美国食品药品管理局在1996年制定的《FDA关于植物制品的指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。中国国家药品监瞀管理部门于2000年发布了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中 药注射剂实行指纹图谱标准。中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描法(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X-射线衍射法等光谱法。其中色谱法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。乳香为橄榄科植物卡氏乳香树的胶树脂，具有调气活血、定痛、消肿、生肌之功效，临床主要用于治气血瘀滞,心腹疼痛,痈疮肿毒,跌打损伤,风湿痹痛,痛经,产后瘀血刺痛等。乳香所含成分复杂，主要成分含树脂60% 70%，树胶27% 35%，挥发油3% 8%，树脂的主要成分为游离α -乳香酸、β -乳香酸、结合乳香脂酸、乳香树脂烃，树胶为阿糖酸的钙盐和镁盐、西黄芪胶黏素和苦味质，挥发油含菔烯、莰烯、香桧烯、榄香烯、消旋-柠檬烯等。由于受气候、产地等因素的影响，不同乳香药材所含成分也存在一定差异。
发明内容
本发明的目的是提供ー种乳香药材指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的乳香药材标准指纹图谱。本发明通过对乳香药材高效液相色谱指纹图谱的研究，提出了ー种较好的乳香药材质量控制方法，使乳香药材的质量控制更加完善和科学。本发明乳香药材高效液相色谱指纹图谱的建立方法，包括以下步骤
(I)供试品溶液的制备精密称取药材粉末10g，置具塞容器中，加入80% 100%的甲醇IOOml 800ml，超声震荡20min 45min，冷却后取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。(2)高效液相色谱分析色谱柱填料5 μ m Fortis-C18, 520X4. 6mm ;流动相1%冰醋酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式Omin — lOmin —20min —35min —45min —70min —80min—IOOmin — IIOmin — 125min,甲醇 60% — 60% — 75% — 85% — 85% — 88% — 90% — 95% — 100% — 100% ;流速0. 8 ml/min I. 2ml/min ;柱温25°C 40°C;检测器为蒸发光散射检测器,漂移管温度80°C 100°C，气体流速2. O L/min 3. O L/min ;进样量为5 μ I 50 μ I ;记录140分钟的色谱图，得到乳香药材的指纹图谱。(3)标准指纹图谱的确定按照本发明提供的方法，对不同来源的12批乳香药材建立了 HPLC-ELSD指纹图谱，通过分析比较，确定了 15个共有特征峰，以參照物3号峰即11-羰基-β -こ酰乳香酸峰为R峰，计算各共有特征峰与R峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%内，规定值为0. 801 (峰1)、0.813 (峰2)、1.000 (峰R)、1.039 (峰4),1. 096 (峰 5)、I. 188 (峰 6)、I. 225 (峰 7)、I. 297 (峰 8)、I. 354 (峰 9)、I. 468 (峰 10)、I. 538 (峰 11),1. 690 (峰 12),1. 715 (峰 13),1. 856 (峰 14),1. 919 (峰 15)，这些共有特征峰构成了乳香药材的指纹特征，可作为乳香药材的标准指纹图谱。本发明具有如下显著的优点和用途
(1)将乳香药材作为ー个整体对待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系， 注重整体面貌特征，避免了因只測定其中ー个或两个化学成分而判断乳香药材整体质量的片面性，減少了为质量达标而人为处理的可能性。通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差别，为完整、准确评价乳香药材的质量提供了新的对照标准，从而能更好的控制乳香药材的质量；
(2)本发明具有測定方法操作简便、精密度高、稳定性好、重现性好、易于掌握的特点；
(3)流动相配制简单，色谱条件容易实现；
(4)适用于对乳香药材真伪、产地和质量的鉴别和控制。
图I是本发明提供的乳香药材的标准指纹图谱，图中从左到右分别标出了其共有特征峰I至15号；
图2是不同来源的12批乳香药材的HPLC-ELSD指纹图谱。
具体实施例方式对本领域技术人员而言，根据本发明公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主g及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进，但只要使用本发明所述的质量控制方法，均在本发明保护范围之内。实施例一检测乳香药材的指纹图谱 (I)仪器与试剂
仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT四元梯度泵、D⑶_20A5在线脱气机、CT0-10AS柱温箱、SIL-20A自动进样器、LCsolution工作站；Alltech2000ES型蒸发光散射检测器；HT-300型超声振荡器(济宁海腾超声电子设备有限公司);电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。试剂甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)，冰醋酸(分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司)，娃哈哈纯净水。
(2)供试品溶液的制备精密称取药材粉末5g，置具塞容器中，加入90%的甲醇200ml，超声震荡45min，取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。(3)高效液相色谱分析色谱柱填料5 μ m Fortis-C18, 520X4. 6mm ;流动相1%冰醋酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式Omin— lOmin —20min —35min —45min —70min —80min— lOOmin— llOmin— 125min，甲醇60% —60%—75% —85% —85% —88% —90% —95%— 100% —100% ;流速I. Oml/min ;柱温30°C;检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度85°C，气体流速
2.3 L/min ;进样量为 20 μ I。(4)測定精密吸取供试品溶液及对照品溶液各20 μ I注入液相色谱仪，照高效液相色谱法測定，记录140分钟的色谱图，即得乳香药材的指纹图谱，如图I所示。实施例ニ 检测不同来源的12批乳香药材的指纹图谱
(I)取不同来源的12批乳香药材，按实施例一的条件进行检测，得到12批样品的 HPLC-ELSD指纹图谱，如图2所示。通过12批乳香药材的HPLC-ELSD指纹图谱的比较，进行相似度评价，共确定了 15个共有特征峰，以參照物3号峰即11-羰基-β-こ酰乳香酸峰为R峰，计算各共有特征峰与R峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%内，规定值为:0.801 (峰 1)、0.813 (峰 2)、1.000 (峰 R)、1.039 (峰 4)、1·096 (峰 5)、1·188 (峰6),1. 225 (峰 7),1. 297 (峰 8)、1· 354 (峰 9)、1· 468 (峰 10),1. 538 (峰 11),1. 690 (峰 12)、
I.715 (峰13)、I. 856 (峰14)、I. 919 (峰15)，这些共有特征峰构成了乳香药材的指纹特征，可作为乳香药材的标准指纹图谱。(2)相似度评价采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2004A版)对图谱进行评价，相似度评价结果见表I。表I HPLC-ELSD指纹图谱相似度评价结果
权利要求
1.一种乳香药材高效液相色谱法指纹图谱的建立方法，包括以下步骤 (1)供试品溶液的制备精密称取药材粉末10g，置具塞容器中，加入80% 100%的甲醇IOOml 800ml，超声震荡20min 45min，冷却后取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液； (2)指纹图谱的制作色谱分离柱填料为5μ m FortiS-C18, 250X4. 6mm ;流动相为1%冰醋酸水溶液-甲醇；采用梯度洗脱方式Omin — lOmin —20min —35min —45min —70min —8Omin— lOOmin— llOmin— 125min，甲醇60% —60%— 75% —85% —85% —88% —90% —95%— 100%—100% ;流速0. 8 ml/min I. 2ml/min ;柱温25°C 40°C;检测器为蒸发光散射检测器,漂移管温度80°C 100°C，气体流速I. O L/min 3. O L/min ;进样量为5μ I 50 μ I ;记录140分钟的色谱图，得到乳香药材的指纹图谱； (3)标准指纹图谱的确定确定了15个共有特征峰，以参照物3号峰即11-羰基-β-乙酰乳香酸峰为R峰，计算各共有特征峰与R峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的 ±5% 内，规定值为:0.801 (峰 1)、0.813 (峰 2)、1.000 (峰 R)、1.039 (峰 4)、1·096 (峰5),1. 188 (峰 6),1. 225 (峰 7),1. 297 (峰 8),1. 354 (峰 9),1. 468 (峰 10),1. 538 (峰 11)、I.690 (峰12)、1.715 (峰13)、1.856 (峰14)、1.919 (峰15)，这些共有特征峰构成了乳香药材的指纹特征，作为乳香药材的标准指纹图谱。
全文摘要
本发明提供了一种乳香药材高效液相色谱法指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。首先，取乳香药材粉末，加入95%甲醇水溶液，超声提取，并将上清液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。然后，进行高效液相色谱分析，色谱柱为Fortis-C18(5μm，250×4.6mm)，流动相为1%冰醋酸水溶液-甲醇；采用梯度洗脱方式；柱温30℃；检测器为蒸发光散射检测器，漂移管温度81℃；气体流速2.1L/min。吸取供试品溶液进样，得到乳香药材的HPLC-ELSD指纹图谱。通过对不同来源的12批乳香药材HPLC-ELSD指纹图谱的比对，确定其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。利用标准指纹图谱可以有效监控乳香药材的质量。
文档编号G01N30/02GK102809616SQ20121029744
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者李洁, 路杰, 许飞, 崔美兰, 刘杰, 高希波 申请人:山东齐都药业有限公司