一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，包括以下步骤：运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱。分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。本发明优点在于：本发明采用的激光拉曼光谱为一种非侵入性技术，它不需要任何染料和固定也能反映出每条精子不同个体超微结构、不同成分的散射物质的特性，对精子形态学分析提供了一个新的评估方法。
【专利说明】一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种精子形态与结构分析方法，具体地说，是一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法。
【背景技术】
[0002]目前全世界约有20%育龄夫妇患有不孕症，不孕症中男性原因占50%左右，而在男性不育症中约60%以上原因为少、弱精子症，究其原因尚不完全清楚。目前许多医院的临床医师，还是依赖实验室的常规精液分析指标，选择临床治疗方案。尽管常规精液分析的应用具有悠久的历史，但许多医疗单位至今仍然在使用人工显微镜分析技术；灰度计算机分析精液技术(CASA, Computer-aided sperm analysis)分析方法在临床上虽已经广泛应用多年；而相差显微镜的CASA分析方法因为仪器价格较贵，在医院推广仍很有限。因此精液分析是评价成年男子生育能力和不育症治疗效果的重要手段之一，是常规检测项目，也是存在问题最多的不育评估项目之一。
[0003]最新出版的WH05 (2011年2月)提出的严格精子形态学分析方法标准，使男性精子的形态正常比例标准降到了 4%。对于人类，用显微镜检查分析精子复杂的形态学过程并不是非常有效，会产生各种异常的和功能不完善的精子。重要的是，研究者要分析引起这些缺陷的原因及其对生育可能造成的后果。随着“蛋白组学”技术和方法的快速发展，我们从男性的基础代谢和精子蛋白质组学、受精的机理以及运动功能等研究中获得了认识，学者们提出了公认的原因:精子的不育原因许多来源于精子的功能异常，其中对精子核DNA的损害是目前研究最多，而且是被越来越多地学者承认与胚胎发育质量和胚胎植入至关重要的影响因素之一。
[0004]近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力、精子形态及精子功能有显著相关性，并且可以影响受精卵的分裂以及胚胎的发育。但目前的精子DNA分析方法尚不稳定，因为它不能识别精子固有的分子异常，虽然有各种测试评估DNA完整性的方法，但这些办法都是使用了各种荧光染料，对精子本身有侵入性伤害，例如彗星法、精子染色质扩散法(SCD)及丫啶橙流式细胞仪分析法等都是使用荧光染料。这些使用荧光染料检查后的精子无法再给临床应用提供可替代选择使用的精子。
[0005]随着计算机及其在图像数字处理技术方面的进展，一门崭新的、非侵入性、快速而灵敏的光谱学检测方法，激光拉曼*(Raman)光谱技术在生物医学领域的应用日渐广泛，被逐步应用于各种细胞分类和鉴别研究工作中。在这里不仅可以观察细胞形貌，而且还能检测出表征细胞形态的峰谱，它包含了单纯形貌观察得不到的更丰富的信息，通过这些信息反映出细胞的物质成分和结构的变化，这在生物遗传及临床医学等学科的研究进程中有潜在的应用前景。目前使用激光拉曼光谱系统对单个精子形态分析方法的建立研究尚未见报道
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤:运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱。分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。
[0008]所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤:
(1)选择激光激发波为532nm，激光功率5mW，激发拉曼光谱，曝光时间为IOs；
(2)激光拉曼显微镜扫描参数:入射光调节为反射光，拉曼分析平移，即每个点扫描移动时，控制精度为I um ;
(3)根据精子形态分析标准，依据精子顶体、颈部、尾部大小，即顶体宽度3.1-3.5um，顶体长度为4.5-4.9um，颈部长度为4.0-5.0um划分扫描区域:分别对精子顶体前区(质膜)定点扫描3个点、顶体中间(DNA核区)定点扫描4点、顶体后区(赤道板部)定点扫描3点、颈部(线粒体区)部定点扫描7点、尾部(微管区域)定点扫描8点，五个划分区域共定点扫描23点进行扫描，并重复扫描三次，将获得精子拉曼数据谱峰，分析其峰谱变化和位移。
[0009]本发明优点在于:
1、本发明采用的激光拉曼光谱为一种非侵入性技术，它不需要任何染料和固定也能反映出每条精子不同个体超微结构、不同成分的散射物质的特性，与激光的频率和激光的强度无关；
2、本发明通过对四种不同形态的精子进行拉曼光谱的比较研究，发现不同形态的精子均有各自的拉曼特征谱峰，对不同形态的精子特征拉曼谱峰的研究十分有意义，采用激光拉曼光谱仪可对精子形态学分析提供了一个新的评估方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]附图1是精子顶体、颈部、尾部大小。
[0011]附图2是根据精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域。
[0012]附图3是四例检测样本的精子形态学染色图谱。
[0013]附图4是正常可育者精子的拉曼光谱:a、顶体区域的拉曼光谱；b、精子颈部区域的拉曼光谱；c、精子尾部区域的拉曼光谱。
[0014]附图5是原发不育男性(确诊为IVF完全不受精)精子拉曼光谱，a、顶体区域的拉曼光谱山、精子颈部区域的拉曼光谱；c、为精子尾部区域的拉曼光谱。
[0015]附图6是圆头精子拉曼光谱，a、圆头精子顶体区域多点重复的拉曼光谱；b、可育者精子顶体区域多点重复的拉曼光谱。
[0016]附图7是断头精子拉曼光谱，(I)顶体区域的拉曼光谱，(II)精子颈部区域的拉曼光谱，(II1-1V)为精子尾部区域的拉曼光谱。(波长532nm)。
[0017]附图8-12是正常精子与死精子的激光拉曼扫描峰谱，红色(下)为正常精子的激光拉曼扫描峰谱，蓝色(上)为死精子的激光拉曼扫描峰谱。其中图8是顶体前区，图9是核区，图10是顶体后区，图11是颈部，图12是尾部。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
实施例
[0019]一、研究材料和方法
1、实验设备
1.1激光拉曼光谱系统
色散型共聚焦拉曼光谱仪(Senterra R200-L),德国Bruker公司生产，具有光谱分辨率≤1.5CHT1，横向分辨率〈lum，纵向分辨率〈2 um，配有波长分别为785nm、633nm和532nm的三种激光器，三维自动化控制平台等重要性能。
[0020]1.2西班牙CASA分析仪
1.3 Eppendorf 5424小型高速离心机
1.4检测样本
选取在医院特需门诊就诊的男性精液样本。
[0021](A)已育男性(已生育一男孩，现年18岁)一例；
(B)原发不育患者(原发不育12年，曾在生殖中心接受IVF治疗，确诊为IVF完全不受精)一例;
(C)圆头精子症患者一例(患者为原发不育5年)，精液形态学分析均为100%圆头精
子;
(D)严重(98%)畸形精子症(精子形态学分析，可见大部分精子为颈部开始头尾分离，即使头尾连接也是歪颈)，患者一例。
[0022]以这四例典型病例为研究对象。本组研究以生育者的正常形态精子为对照。四位受检者均被告知实验目的并签署知情同意书。
[0023]表1四例样本精液分析基本情况表
【权利要求】
1.一种非侵入性精子形态和超微结构分析方法，其特征在于，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤:运用色散型共聚焦拉曼光谱仪进行分析，选择激发拉曼光谱，将精子细胞置反射光镜下中，通过一定的激发功率和曝光时间可采集到精子细胞的化学基团光谱；分别对精子顶体、颈部、尾部大小划分扫描区域重复扫描三次，即可获得拉曼数据谱峰，分析其波形变化和位移；最后将采集到的精子形态的拉曼光谱，应用RRUFF拉曼数据库检索，得到精子形态各区域的拉曼光谱。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的精子形态和超微结构分析方法包括以下步骤: (1)选择激光激发波长为532nm，激光功率5mW，激发拉曼光谱，曝光时间为IOs； (2)激光拉曼显微镜扫描参数:入射光调节为反射光，拉曼分析平移，即每个点扫描移动时，控制精度为Ιμπι; (3)根据精子形态分析标准，依据精子顶体、颈部、尾部大小，即顶体宽度3.1-3.5um,顶体长度为4.5-4.9um，颈部长度为4.0-5.0um划分扫描区域:分别对精子顶体前区，即质膜定点扫描3个点；顶体中间，即DNA核区定点扫描4点；顶体后区，即赤道板部定点扫描3点；颈部，即线粒体区部定点扫描7点；尾部，即微管区域定点扫描8点，五个划分区域共定点扫描23点进行扫描，并重复扫描三次，将获得精子拉曼数据谱峰，分析其峰谱变化和位移。
【文档编号】G01N21/65GK103698311SQ201210368263
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2012年9月28日
【发明者】李铮, 刘锋, 朱勇, 何琳, 刘宇飞 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院