专利名称：非标记荧光pcr结合hrma检测副溶血弧菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种非标记荧光PCR结合高分辨率熔解曲线(HRM)分析检测副溶血弧菌的方法，属于微生物检测领域。
背景技术：
副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus),是一种嗜盐性细菌,系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，主要来自海产品。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。荧光PCR检测技术大致分为两大类:荧光探针法(标记荧光PCR)和通用型的荧光染料法(非标记荧光PCR)。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本要高很多。而后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，其优点是:无需另外设计荧光探针，简便易行，成本较低。其中，荧光染料又分为非饱和染料(如Sybr Green)和饱和染料(如 LC Green 等)。相对Sybr Green等非饱和染料来说，Eva Green、LC Green、SYT09等饱和染料具有以下优点:①饱和的染料对PCR反应没有任何抑制作用，因此可以在PCR反应之前加入，而其它非饱和荧光染料若较多加入到反应液中会抑制PCR反应，因此只能限量加入，从而对荧光PCR反应的指示收到限制。② DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，Tm值较高，在DNA双链高温熔解时，饱和突光染料结合核酸更稳定。高分辨熔解曲线分析(high-resolution melt analysis, HRMA)技术是近几年来在国外兴起的一种用于物种鉴定的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解曲线分析，即可完成对物种鉴定、基因分型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作。HRMA利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录熔解曲线，从而对样品进行检测。虽然带HRM模块的荧光PCR仪与普通荧光PCR仪购买价格相差不大，但其温度均一性要高很多。如普通定量PCR仪温度均一性±0.25 °C，温度分辨率为0.1 °C，而Rotor-Gene 6000温度均一性为±0.01° C，温度分辨率为0.02° C。其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，加上饱和性染料(LC Green、Eva Green等)的出现,使得HRM这一技术的普及使用成为可能。
目前，副溶血弧菌的检测方法主要有传统的培养后分离鉴定方法和分子检测方法。其中传统的副溶血弧菌分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，国际上通常以美国FDA颁布的“细菌学分析手册”作为经典方法。我国也参照制定颁布了副溶血弧菌检验国家标准(GB/T4789.7-2008)，规范了副溶血弧菌传统培养检测方法和分子检测方法。但传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长、易漏检等缺点。分子检测方法中，包括了常规PCR方法，但是常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂而且极易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法。为了达到上述目的，本发明采用以下方案:一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤:A、根据副溶血弧菌TLH基因设计引物对；B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；C、应用软件对PCR扩增产物进行扩增曲线和HRMA分析。进一步地，本发明按以下反应步骤进行:(I)采用PRMER等软件，根据GeneBank发布的序列，针对副溶血弧菌TLH基因设计的引物对， 设计非标记荧光PCR扩增副溶血弧菌上游引物序列为:5 ‘-GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3’序列，其下游引物为:5 ‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。(2)标准品模板的制备以常规PCR方法扩增副溶血弧菌TLH基因。PCR产物经1%凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。(3)非标记荧光PCR扩增和HRM分析提取副溶血弧菌样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用带HRMA模块的荧光定量PCR仪(包括Corbett Rotor公司的Gene 6000、Roche公司LightCycler 480等)对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物的Tm值和基因型。在所述突光定量PCR反应中所采用的反应液,包含下列成分:
PCR 反应液(IOX)2 UL
dNTPs混合液(各2.5禮) 1.5 2.5 μ L
权利要求
1.一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤: A、根据副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因设计引物对； B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增； C、应用带HRM模块的荧光PCR仪软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值熔解曲线图谱。
2.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述引物对的上游引物序列为:5 ‘-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，所述引物对的下游引物序列为:5 ‘-TGTGCCTTGATGAACTCGTTC-3’。
3.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中所述非标记荧光PCR扩增过程是在反应液中进行的，其中制备20 μ L的反应液由以下组分组成:PCR 反应液(IOX)2 PL(INTPs 混合液(各 2.SmM) 1.5 2.5 μ ITaq 聚合酶(511/μ L)O i O 6 uL上游引物(ΙΟμΜ)0.5 1.0 PL下游引物(ΙΟμΜ)0.5 1.0 μ LDNA模版I μ L荧光染料(20 X)I uL水补齐至A PL 。
4.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的荧光染料为DNA饱和性染料。
5.根据权利要求4所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的DNA饱和性染料为Eva Green染料、LC Green PLUS染料、SYTO 9染料中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于所述 dNTP 混合液由 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 组成的混合液。
7.根据权利要求1或3所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤B中非标记荧光PCR扩增的扩增反应按以下步骤进行: (1)921: 961:预变性308； (2)92°C 96°C变性 10 30s, 55-63°C退火 10 30s, 72°C 10 30s,共进行 40 50个循环； (3)72°C延伸 10 30s。
8.根据权利要求1所述非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行:(1)92°C 96°C变性 Imin ； (2)40°C复性Imin ； (3)然后初始熔解温度60 65°C，开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测突光信号， 15 25次/秒。
全文摘要
本发明公开了一种非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步骤根据副溶血弧菌TLH基因设计引物对；提取样本DNA后，利用设计的引物对进行非标记荧光PCR扩增；应用软件对PCR扩增产物进行扩增曲线和HRMA分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，检测结果准确，使用成本低的非标记荧光PCR结合HRMA检测副溶血弧菌的方法。
文档编号G01N21/64GK103184279SQ20121037679
公开日2013年7月3日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者蔡先全, 邱德义, 柏建山, 邓艳, 伍朝晖, 简志华, 张宪臣, 蔡仁杰 申请人:中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心