专利名称：食品和饲料中狐狸成分快速检测试剂盒的制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体是一种狐狸成分的实时荧光PCR检测方法。
背景技术：
全球经济一体化和贸易国际化的的不断扩大，对于发展中的中国，是机遇也是挑战。近年来，我国对外贸易呈持续稳定增长的态势。数据显示，自2009年起我国连续三年稳居全球对外贸易第二大国的位置，出口量居世界首位，进口量居世界第二位。如何加强监督监管，帮助指导企业提高产品质量，克服美国、欧盟、日本等发达国家和地区的技术壁垒，进一步扩大我国产品出口 ；同时严格入境监管，防止国外的不合格产品流入我国，保护我国消费者利益，是检验检疫等国家行政主管部门面临的重要工作任务。就进出口的食品和饲料而言，合格的产品，不仅要无毒无害，满足安全卫生要求；而且要无搀杂搀假，满足品质要求。其中品质合格，又主要包含两方面的含义:1.原料来源与标签一致。2.组分含量与标签一致。欧盟自2006年I月I日起开始实施新的食品卫生法规，新法规突出了食品生产过程中的可追溯管理与食品的可追溯性，强调食品的身份鉴定标识与健康标识。我国国家标准GB7718-94《食品标签通用标准》和国家出入境检验检疫局发布的《进出口食品标签管理办法》，也明确提出食品标签标注内容应与食品相符。此外，为防止疯牛病、痒病的传播，，包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止在反刍动物饲料中使用、添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病原体从动物传染到别的动物和人类。在食品和饲料的生产与销售中，产品无标签或标签不规范，利用掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者谋取暴利的事件，国内、国外均屡屡发生。各种原料被加工成食品和饲料成品后，已无法从外观对其组成进行鉴定。生产者受利益驱动，擅自改变产品组成，或掺入价廉的替代品，或直接减少原料用量，导致产品的真实属性与标签不符。 这种造假行为不仅仅涉及经济、营养价值及宗教信仰问题，更可能直接影响着消费者健康。狐狸,哺乳动物，属哺乳纲，食肉目，犬科(Canidae),狐亚科(Vulpini)。除包括狐属(Vulpes)动物外，狐狸还包括狐亚科其它属的动物:倭狐属(Fennecus)、大耳狐属(Otocyon)、南美狐属(Dusicyon)、灰狐属(Urocyon)、北极狐属(Alopex)和和食蟹狐属(Cerdo-cyon)。狐狸分布很广,北美、欧洲、亚洲均有大量分布。其毛皮较珍贵，色泽艳丽，板质柔韧，是制裘工业的高档原料，号称“软黄金”，被誉为世界三大裘皮支柱之一，在国内外市场上非常畅销。作为一种重要的经济毛皮动物，狐狸养殖业十分发达，主要养殖品种包括:赤狐、蓝狐和银黑狐。狐狸养殖主要取其皮毛，狐肉有异味，故价格便宜，很少有人食用。近年来，狐狸肉经加工冒充狗肉、羊肉，甚至制成肉串、香肠流入市场的新闻时有报道。鉴于此，尽快建立可靠有效的狐狸成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真实准确，加强食品和饲料标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。食品和饲料中动物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样容易受到外界环境因素和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种狐狸成分快速检测试剂盒的制备和检测方法，克服基于蛋白的检测方法在某些食品和饲料检测中的局限性，为狐狸成分检测提供有效工具，从而确保食品和饲料标签的一致性，保护消费者利益。本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组特异性引物和一条特异性Taqman探针，经优化反应体系和反应程序，最终建立待测样品的实时荧光PCR检测方法。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94_95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3' —5'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。本发明涉及的狐狸成分快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下:(I) 2 X PCRMasterMix包括0.05u/μ L Taq DNA聚合酶，反应缓冲液,4mmol/L氯化镁,0.4mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物);其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2%曲拉通X-100 ； (2)上游引物:10ymol/L，序列为:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；⑶下游引物:10ymol/L，序列为:5'-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3;；(4)丁&9!1^11探针:1(^11101/1，序列为:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端标记FAM报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光集团。使用上述试剂盒检测食品和饲料中狐狸成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3):(I)待检样品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。(2)狐狸成分的实时荧光PCR扩增A.在反应管中加入2XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman 探针 0.5-1 μ L，IOOng/ μ L 待测样品的 DNA1-2 μ L，补充双蒸水至 25 μ L，混匀；B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:94-95°C 5min, I 个循环，预变性；94-950C 10_20sec ；60°C 20_40sec，45 个循环，PCR 扩增。扩增时，应设立三个对照:阳性对照(取狐狸肉提取的基因组DNA)、阴性对照(非狐狸基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增)，则可判定该样品检出狐狸成分。如待测样品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出狐狸成分。如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出狐狸成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出狐狸成分。线粒体DNA是动物体内唯一存在核外遗传信息载体，为共价闭合的双链环状分子，具有母系遗传、进化速度快、种属特异性等特点。对同一个体的肾脏、心脏、肝脏、皮肤等不同组织的研究、比较表明，线粒体DNA的结构没有组织特异性。而且线粒体DNA拷贝数多，可达数千到上万个，远高于核DNA，即使样品经过深度加工，核DNA降解严重或DNA含量极少时，仍可通过PCR扩增检出线粒体DNA，因此线粒体DNA基因序列被广泛用于物种鉴定。细胞色素C氧化酶是由多个亚基组成的、在生物体代谢过程中起重要作用的复杂酶分子，其诸多亚基中最大最保守的亚基为细胞色素C氧化还原酶I亚单位，由线粒体DNA编码。本发明根据狐狸线粒体细胞色素C氧化还原酶I亚单位基因序列，使用Biodet软件和Primer Express3.0软件进行了序列分析和引物、探针设计。该基因序列通过对Genebank登录的犬科其他动物核酸序列的比对获得，并对设计出的引物和探针进行了在线Blast比对查询，可保证狐狸成分的检出。本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的加工食品和饲料中狐狸成分的检测。
图1为用实时荧光PCR技术检测某待测肉糜样品DNA，样品的扩增图谱；图2为阴性对照(京巴犬DNA)的扩 增图谱；图3为空白对照(水)的扩增图谱；图4为阳性对照(狐狸DNA)扩增图谱。图5为用实时荧光PCR技术检测某待测饲料样品DNA，样品的扩增图谱；图6为阴性对照(京巴犬DNA)的扩增图谱；图7为空白对照(水)的扩增图谱；图8为阳性对照(狐狸DNA)扩增图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1按下列配方制作狐狸成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下:(I) 2 X PCR MasterMix包括0.05u/ μ L Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁,0.4mmol/LdNTP(dATP, dCTP, dGTP,dTTP)；
其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2%曲拉通X-100 ；(2)上游引物:10ymol/L，序列为:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；(3)下游引物:10ymol/L，序列为:5' -GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'；(4)丁&9!1^11探针:1(^11101/1，序列为:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端标记FAM报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光集团。按照以下程序进行检测:(I)待测肉糜样品DNA的提取A.称取0.3g肉糜样品，加至2mL离心管中。加入600 μ L预热的CTAB裂解缓冲液和40 μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温90min ；B.2000g离心5min，取上清于另一干净的2mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25: 24: I)，震荡混匀；C.12000g离心lOmin，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；D.12000g离心lOmin，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；E.加入 5 μ L RNA 酶溶液，37°C 30min ；F.加入200 μ L三氯甲烷:异戊醇(24: I)，强烈振荡；
G.12000g离心lOmin，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；H.12000g离心lOmin，弃去上清液，用4°C预冷的70 %乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；1.12000g离心lOmin，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ L TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。 (2)待测肉糜样品DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2 XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探针0.5 μ L，IOOng/ μ L待测样品的DNAl μ L，补充双蒸水至25 μ L，混匀；B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C 2min, I个循环，预变性；950C 15sec ；60°C 40sec，45 个循环，PCR 扩增。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。样品出现阳性扩增曲线，Ct值为17.8，阴性对照(京巴犬DNA)和空白对照(水)无扩增，阳性对照(狐狸DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图1、图2、图3、图4，据此可判定该样品检出狐狸成分。实施例2按下列配方制作狐狸成分的实时荧光PCR检测试剂盒，其中的试剂包括如下:(I) 2 X PCRMasterMix包括0.05u/yL Taq DNA 聚合酶 Polymerase,反应缓冲液,4mmol/L 氯化镁，0.4mmol/L dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；
其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2%曲拉通X-100 ；(2)上游引物:10ymol/L，序列为:5' -TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'；(3)下游引物:10ymol/L，序列为:5' -GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'；(4)丁&9!1^11探针:1(^11101/1，序列为:5/ -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端标记FAM报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光集团。按照以下程序进行检测:(I)待测饲料样品DNA的提取A.称取0.3g饲料样品，加至2mL离心管中，加至2mL离心管中。加入600 μ L预热的CTAB裂解缓冲液和40 μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温90min ；B.2000g离心5min，取上清于另一干净的2mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25: 24: I)，震荡混匀；C.12000g离心lOmin，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；D.12000g离心lOmin，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；E.加入 5 μ LRNA 酶溶液，37°C 30min ；
`
F.加入200 μ L三氯甲烷:异戊醇(24: I)，强烈振荡；G.12000g离心lOmin，取上清至干净的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；H.12000g离心lOmin，弃去上清液，用4°C预冷的70 %乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；1.12000g离心lOmin，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ LTE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。(2)待测饲料样品DNA的实时荧光PCR扩增A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2 XPCR Master Mixl2.5 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，Taqman探针0.5 μ L，IOOng/ μ L待测样品的DNAl μ L，补充双蒸水至25 μ L，混匀；B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C 2min, I个循环,预变性；950C 15sec ；60°C 40sec，45 个循环，PCR 扩增。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果样品未出现阳性扩增曲线，阴性对照(京巴犬DNA)和空白对照(水)无扩增，阳性对照(狐狸DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图5、图6、图7、图8，据此可判定该样品未检出狐狸成分。
权利要求
1.一种狐狸成分快速检测试剂盒，其特征在于其中的试剂包括(1)-(4):(1)2XPCRMaster Mix 包括0.05u/yL Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，4mmol/L氯化镁，0.4mmol/L dNTP(dATP,dCTP, dGTP, dTTP)； 其中反应缓冲液含有20mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾和2%曲拉通X-100 ； (2)上游引物:10ymol/L，序列为:5'-TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3'； (3)下游引物:10ymol/L，序列为:5'-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3'； (4)Taqman 探针:10 μ mol/L,序列为:5' -CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-3'，其 5'端标记FAM报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光集团。
2.一种使用如权利要求1所述的试剂盒快速检测狐狸成分的方法，其特征是依次包括下列步骤: (1)待检样品DNA的提取； (2)狐狸成分的实时荧光PCR扩增: A.在PCR反应管中 加入如权利要求1所述的2XPCRMaster Mixl2.5 μ tL，上游引物和下游引物各0.5-1 μ L，Taqman探针0.5-1 μ L，lOOng/μ L待测样品的DNA1-2 μ L，补充双蒸水至25 μ L,混勻； B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增: 94-950C 5min, I个循环，预变性； 94-950C 10-20sec ；60°C 20_40sec，45 个循环，PCR 扩增； (3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
全文摘要
本发明属于食品和饲料中动物源性成分的定性检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品和饲料中狐狸成分的试剂盒及方法。试剂盒包括2×PCRMaster Mix、上游引物、下游引物、Taqman探针；其中2×PCR Master Mix中含有Taq DNA聚合酶、反应缓冲液、氯化镁、dNTP，上游引物序列为5′-TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT-3′、下游引物序列为5′-GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG-3′、TaqMan探针序列为5′-FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-TRAMA-3′；狐狸成分的快速检测方法包括食品和饲料DNA的提取、狐狸成分的实时荧光PCR扩增和结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。
文档编号G01N21/64GK103088116SQ20121040853
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月14日 优先权日2012年10月14日
发明者孙敏, 高宏伟, 刘彩霞, 龚方 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心