专利名称：瘦素检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学检验领域，具体涉及一种瘦素检测试剂盒。
背景技术：
随着人类生活水平的提高，肥胖已成为当今世界的一个常见问题。肥胖症是摄食和能耗平衡机制的失调，可引起多种疾病，如II型糖尿病、高血压、高血脂和癌症等。瘦素常被指为肥胖蛋白，是肥胖基因的产物，瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量和糖代谢。尽在脂肪细胞中表达，循环瘦素水平与人体脂肪量呈正相关。瘦素在造血、肾上腺皮质功能中起作用，正常人血清瘦素水平较低，在动脉样硬化、生长激素不稳定、神经性厌食等会出现瘦素的变化。瘦素检测试剂盒是瘦素的血清学诊断的一个常用手段，应用酶联免疫法的基本·原理进行，所述的酶联免疫法也称为酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay),简称ELLSA，ELLSA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标抗体(抗原)，生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物，借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量，待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比，瘦素检测试剂盒是现有技术中用于临床肥胖和糖尿病的辅助诊断手段之一，但是现有的瘦素酶标试剂的灵敏度和重复性较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种瘦素检测试剂盒，该瘦素检测试剂盒的灵敏度高、重复性好。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。本发明的瘦素检测试剂盒的检测原理为将重组人瘦素多肽单克隆抗体作为包被抗体微孔板，加待测血清样品，再加相应的酶标抗体，生成包被抗体-待测血清样品-酶标抗体的复合物，添加显色液显色后，再加终止液终止，并用洗涤液洗去残留液，测定待测血清样品的吸光值，与标准曲线比较即可得出待测血清样品中的瘦素含量。本发明的瘦素检测试剂盒主要是根据酶联免疫法的原理来测定人血清、血浆和其他样品中的瘦素含量，可用于肥胖症和II型糖尿病的辅助诊断，本发明采用重组人瘦素多肽抗原为瘦素参考品，采用重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体为包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素，由上述重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体构成的瘦素检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，在测定瘦素含量的临床检测中发挥重要作用。更进一步，本发明的瘦素检测试剂盒，其中所述的包被抗体微孔板为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5，所述的酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体3F7。包被抗体和酶标抗体中的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体主要是根据单克隆抗体在96孔酶标板中的位置进行确定的。所述的洗涤液是由28. 8g 的 Na2HPO4 · 12H20、80g 的 NaCl,3. 9g 的 NaH2PO4 · 2H20、50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml。所述的显色液包括显色液A和显色液B，显色液A是由浓度为30%过氧化氢用柠檬酸缓冲液稀释至其体积的1000倍所得，显色液B是用含20% 二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成O. 4mg/ml所得。其中所述的柠檬酸缓冲液是由3. 4g乙酸钠和5. 2g柠檬酸溶于5000ml的纯化水所得。所述的终止液为浓度2mol/L的硫酸溶液。本发明的瘦素检测试剂盒，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，该重组人瘦素多肽抗原采用本技术领域常规的合成方法所得，即是采用高保真PCR技术从人Cdna文库中的扩增瘦素全长基因，并克隆至pUL，DNA序列分析结果显示克隆的瘦素基因和文献报 导的完全一致，亚克隆L印tin成熟肽编码区段至表达质粒PJW2，构建表达质粒pJL，转化E. coli DH5ci，本发明的瘦素检测试剂盒中瘦素参考品可分为5个不同浓度的规格，分别为0ng/ml、lng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml,以便提高本发明的瘦素检测试剂盒的灵敏性和重复性。所述的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体由以下步骤制备而成(I)以瘦素参考品免疫6-8周雌性Balb/c小鼠；(2)取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞；(3)将上述融合所得的杂交瘤细胞经选择性培养基HAT培养，并筛选出对重组人瘦素多肽抗原有强阳性反应的杂交瘤细胞，即为单抗细胞株；(4)取上述状态良好的数对生长期单抗细胞株，吸管吹下细胞，离心处理所得细胞沉淀以无菌生理盐水悬浮调整至浓度为2X107cellS/ml的细胞悬浮液；(5)将上述细胞悬浮液接种至BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只；(6) 7天后观察待小鼠腹部膨大发黑即可抽取小鼠腹水；(7)将抽取的小鼠腹水经辛酸-硫酸铵沉淀，透析后获粗制单克隆抗体；(8)再对上述粗制的单克隆抗体进行纯化即可。本发明的瘦素检测试剂盒，使用的试剂均符合现行《中国药典》和《中国生物制品主要原辅材料质控标准》要求，未纳入上述标准化学试剂，均为化学纯及以上纯度，所使用的体外诊断试剂聚烯羟滴瓶及其他塑料制品由金坛市鑫宇医疗器械有限责任公司生产，均获国家食品药品监督管理局(SFDA)注册，注册证号为国药包字20040041，所用液体组分按《中国药典》2005年版生物制品无菌试验规程进行，故本发明的瘦素检测试剂盒是安全可靠的。
图I是本发明的OD值的标准曲线图。
具体实施例方式步骤I
瘦素检测试剂盒的组成(I) 5 瓶不同浓度规格的瘦素参考品0ng/ml、lng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml, l-3ml/ 瓶；( 2 )包被抗体微孔板；(3)酶标记抗瘦素；(4)洗涤液，20ml/瓶；(5)显色液A、显色液B均为10_15ml/瓶；(6)终止液，15_20ml/瓶。步骤2 重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体的制备，包括以下步骤(I)以重组人瘦素多肽抗原免疫6-8周雌性Balb/c小鼠；(2)取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞；聚乙二醇由美国的Sigma生产，分子量为4000 ；(3)将上述融合所得的杂交瘤细胞经选择性培养基HAT培养，并筛选出对重组人瘦素多肽抗原有强阳性反应的杂交瘤细胞，即为单抗细胞株；选择性培养基HAT由美国的Sigma生产；(4)取状态良好的数对生长期单抗细胞株，吸管吹下细胞，离心处理所得细胞沉淀以无菌生理盐水悬浮调整至浓度为2X107cellS/ml的细胞悬浮液；(5)用注射器将上述细胞悬浮液接种至BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只；(6) 7天后观察待小鼠腹部膨大发黑即可抽取小鼠腹水，通常采用12号注射针头刺入小鼠腹部，并将腹水引流至离心管，一般每只小鼠的抽取量为2-4ml/只，然后将抽取的腹水在转速为3000rpm的离心管中处理5分钟，再用洗管吸取上清液置于洁净盐水瓶内，存放在零下20°C，保质期为2年。(7)抽取的小鼠腹水经辛酸-硫酸铵沉淀，透析后获粗制单克隆抗体；(8)再对上述粗制的单克隆抗体进行纯化即可。具体的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体的纯化包括以下步骤( I)取粗制的单克隆抗体流水融化；(2)在离心机中离心去除沉淀，上清液加2倍体积乙酸钠缓冲液稀释，通常在转速为8000rpm时离心处理10分钟即可；(3)按每毫升单克隆抗体滴加33μ I辛酸，并不断搅拌溶液呈乳白色浑浊，通常选用磁力搅拌器在室温环境下搅拌I小时即可；(4)将上述溶液离心去除沉淀，通常是在转速为15000rpm时离心处理15分钟，上清液滴加相同体积的冷饱和硫酸铵溶液，在温度为2-8°C的条件下反应2小时；(5)再将上述反应液离心处理,通常是在8000rpm时离心处理15分钟,所得沉淀用与原单克隆抗体的体积相同的PBS缓冲液溶解，并对PBS缓冲液进行透析处理，在温度为2-8°C的条件下反应12-14小时；(6)上述透析物离心去除沉淀后即得纯化的单克隆抗体，通常纯化后的单克隆抗体在温度为2-8°C的条件下保存，保质期为6个月；若纯化后的单克隆抗体在温度为零下20°C的条件下保存，保质期为2年。
步骤3包被抗体微孔板中包被抗体的浓度的确定，具体包括以下步骤(I)用pH值为9.6的包被缓冲液稀释重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5的浓度分别为1、2、5、10、20、40、100μ 1/ml，并将其分别加入96孔酶标板，每孔的加入量为100 μ 1，在温度为2-8°C的条件下放置12-14小时；(2)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加200 μ I浓度为1%牛血清白蛋白，并在温度为37°C的条件下放置30分钟；(3)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加100 μ I的HRP-羊抗鼠，在温度为37°C的条件下孵育I小时；(4)用洗涤液冲洗酶标板，每孔均加显色液A、B各50 μ 1，避光反应10分钟；·
(5)每孔加终止液一滴，混匀后置酶标仪450nm波长测定各孔光密度值，选取显色饱和的最低浓度为包被抗体浓度，通常情况下包被抗体浓度为10 μ /ml，此浓度的包被抗体在本发明的瘦素检测试剂盒中灵敏度高，重复性好。其中pH值为9. 6包被缓冲液是用32. 3g的NaHC03和17. 5g的Na2C03加入纯化水溶解定容至12000ml所得。浓度为1%牛血清白蛋白是由210g的牛血清白蛋白、168g的Nacl、60. 5g 的 Na2HP04 · 12H20 和 8. 2g 的 NaH2P04 · 2H20 加入纯化水溶解定容至 21000ml所得。步骤4酶标记抗瘦素中酶标抗体的浓度的确定，具体包括以下步骤(I)用pH值为9. 6的包被缓冲液稀释重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体3F7的浓度为10 μ 1/ml,并将其加入96孔酶标板,每孔的加入量为100 μ I,在温度为2_8°C的条件下放置12-14小时；(2)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加200 μ I浓度为1%的牛血清白蛋白，在温度为37°C的条件下放置30分钟；(3)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加入浓度为50ng/ml的瘦素参考品100 μ 1，在温度为37°C的条件下孵育I小时；(4)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加IOOul不同浓度的酶标抗体溶液，在温度为37°C的条件下孵育I小时；所述的不同浓度的酶标抗体溶液具体是将酶标抗体与缓冲液按照以下配比混合，分别是 I :200,1 :400,1 :800,1 :1000,1 :1500,1 :2000 ；(5)用洗涤液冲洗酶标板，每孔分别加入50ul的显色液A、B,避光反应10分钟；(6)每孔加终止液一滴，混匀后置酶标仪450nm波长测定各孔光密度值，选取显色饱和的最高稀释度为酶标抗体的浓度，通常是按照酶标抗体原液的1/1000倍稀释，此浓度适合本发明的瘦素检测试剂盒，在实际使用时的重复性好，灵敏度高。步骤5包被抗体微孔板的稳定性测定，具体包括以下步骤( I)将包被抗体微孔板置于温度为37°C的条件下放置3天；(2)将浓度为50ng/ml重组人瘦素多肽抗原加入酶标板，每孔的加入量为100 μ 1，同时做10个孔，在温度在37°C的条件下孵育I小时；(3)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加酶标抗体液100 μ 1，在温度为37°C的条件下孵育I小时；(4)用洗涤液冲洗酶标板，每孔均加50ul显色液A、B各50 μ 1，避光反应10分钟；(5)然后每孔加终止液50 μ 1，置酶标仪450nm测定光密度(OD)值，变异系数不高
于 10% O步骤6单抗细胞株还经过无菌试验和支原体检测单抗细胞株的无菌试验时所用的检定器材包括恒温培养箱、霉菌培养箱、超净台、试管、培养基等；采用直接接种法，具体操作步骤如下取4ml待测细胞悬液接种于200ml硫乙醇酸盐流体培养基内增菌；在温度为20-25°C的条件下培养3-4天后移种至硫乙醇酸盐流体培养、营养琼脂斜面和改良马丁培养基各2管，每管IOml培养基接种O. 5ml ;将硫乙 醇酸盐流体培养、营养琼脂斜面各I管置温度为30-35°C的条件下培养，其余各管置温度为20-25°C的条件下培养；同时以O. 9%无菌氯化钠作阴性对照；增菌管及移种管培养时间的全过程大于等于14天，具体的操作按本规程附录检验方法按照“生物制品无菌试验”的规定进行。单抗细胞株支原体检测时所用的检定器材包括恒温培养箱、超净台、试管、培养基等；采用培养法，具体操作步骤如下取每支装量IOml的支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基各4支；每支接种单抗细胞株供试品O. 5-1. 0ml，置温度为36土 1°C的条件下培养21天；第7天从4支中取2支进行次代培养，每支转种支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基各2支，置温度为36± 1°C的条件下培养21天，每隔3天观察一次，培养基变色情况符合常规支原体检测的相关规定即可。其中上述的支原体肉汤培养基的成分如下500ml的猪胃消化液，2. 5g的氯化钠，500ml的牛肉浸液(I :2),5. Og的葡萄糖，5. Og的酵母浸粉，O. 02g的酚红；所述的支原体肉汤培养基的PH值为7. 6±0. 2，在实际使用时在温度为121°C灭菌15分钟，使用前添加灭火小牛血清充分摇匀，且支原体肉汤培养基血清按照8 2的比例混合。支原体半流体培养基的成分按支原体肉汤培养基配方不加酚红，另添加琼脂
2.5-3. Og ;在温度为121°C的条件下灭菌15分钟，使用前煮沸10-15分钟，冷却至56°C左右，使用前添加灭火小牛血清充分摇匀，其中支原体半流体培养基血清按照8 2的比例混
入
口 ο单抗细胞株均采用常规的无菌试验和支原体检测方法，这样可确保本发明的瘦素检测试剂盒在实际使用时，安全可靠。步骤7单克隆抗体的滴度、蛋白浓度的测定单克隆抗体的滴度的测定包括以下步骤(I)用pH值为9. 6包被缓冲液稀释瘦素参考品至10 μ Ι/ml，并将其加入96孔酶标板，每孔的加入量为100 μ 1，在温度为2-8°C的条件下放置12-14小时；(2)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加浓度为200 μ I的1%牛血清白蛋白，在温度为37°C的条件下放置30分钟；(3)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加100 μ I单克隆抗体，用洗涤缓冲液2倍梯度稀释，在温度为37°C的条件下孵育I小时；
(4)用洗涤液冲洗酶标板，每孔加100 μ I的HRP-羊抗鼠，在温度为37°C孵育I小时；(5)用洗涤液冲洗酶标板，每孔均加50 μ I显色液Α、B,避光反应10分钟；(6)每孔加终止液一滴，混匀置酶标仪450nm波长测定各孔光密度值，所得单克隆抗体的滴度大于等于I :10000。单克隆抗体的蛋白浓度的测定包括以下步骤取单克隆抗体用Ph值为7. 2、浓度为O. Olm的PBS缓冲液稀释30倍，并分别在280nm和260nm测定吸收度，按公式蛋白浓度=0D28(lnm+l. 4计算,且纯化后的单克隆抗体的蛋白质浓度大于等于3mg/ml。步骤8瘦素检测试剂盒的灵敏度、特异性、批内和批间不精密度以及检测范围试验 (I)灵敏度试验检定器材恒温箱、酶标仪等；其中瘦素参考品包括PBS,O. 5ng/ml, lng/ml, IOng/ml ；10个不同批号步骤I中的瘦素检测试剂盒；检定方法按常规瘦素检测试剂盒操作方法，将0-50ng/ml标准品加入酶标板100 μ I/孔，分别加入参比品IOOul,均做复空，37°C孵育I小时；洗板3次，每孔加酶标抗体液100ul，37°C孵育I小时；洗板5次，每孔加显色液A50ul，显色液B50ul，避光反应10分钟；每孔加终止液50ul，混匀置酶标仪450nm测OD值，画出标准曲线图I所示，且10批不同批号瘦素检测试剂盒的检测结果如表I所示，结合图I和表I所示，本发明的瘦素检测试剂盒的灵敏度为lng/ml，灵敏度高。表I :10批不同批号瘦素试剂检测结果
批&/ Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 PlOOD
lng/ml 0.404 0.4 O 38 O 0.372 O O 34 0.37 0.36 0.345 PBS 0,14 O. 135 0.16 0.10 0.11 0.15 0.154 0.16 0.136 0.15(2)特异性试验检定器材同灵敏度试验，参比品重组大鼠瘦素(5ng/ml)，大鼠血清，重组人瘦素(5ng/ml),人血清，检定方法按常规的操作方法，将0_50ng/ml标准品加入酶标板100 μ I/孔，分别加入重组大鼠瘦素，大鼠血清，重组人瘦素，人血清IOOul,均做复空，37°C孵育I小时；洗板3次，每孔加酶标抗体液IOOul，37°C孵育I小时；洗板5次，每孔加显色液A50ul，显色液B50ul，避光反应10分钟；每孔加终止液50ul，混匀置酶标仪450nm测OD值，画出标准曲线显示，重组大鼠瘦素(5ng/ml)0. 11，大鼠血清O. 12，重组人瘦素(5ng/ml)O. 56，人血清
O.42，说明本发明的瘦素检测试剂盒与大鼠瘦素无交叉反应，特异性好。(3)批内和批间不精密度试验检定器材同灵敏度试验，同一批号试剂，检定方法同上述常规的操作方法，连续分别做10次，如表2和表3所示，本发明的瘦素检测试剂盒的批内和批间不精密度均小于15%。表2 :批间不精密度试验结果表3 :批内不精密度试验结果
权利要求
1.一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，其特征在于所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的包被抗体微孔板为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体6A5，所述的酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体 3F7。
3.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的洗涤液是由28.Sg的Na2HPO4 · 12H20、80g 的 NaCl、3. 9g 的 NaH2PO4 · 2H20、50ml 的 Tween-20 加入纯化水溶解定容至 100000ml ο
4.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的显色液包括显色液A和显色液B。
5.根据权利要求I所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的终止液为浓度2mol/L的硫酸溶液。
6.根据权利要求3所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于，所述的重组人瘦素多肽抗原单克隆抗体由以下步骤制备而成 (1)以瘦素参考品免疫6-8周雌性Balb/c小鼠； (2)取上述小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0，在浓度为50%的聚乙二醇作用下进行融合得杂交瘤细胞； (3)将上述融合所得的杂交瘤细胞经选择性培养基HAT培养，并筛选出对重组人瘦素多肽抗原有强阳性反应的杂交瘤细胞，即为单抗细胞株； (4)取上述状态良好的数对生长期单抗细胞株，吸管吹下细胞，离心处理所得细胞沉淀以无菌生理盐水悬浮调整至浓度为2X107cellS/ml的细胞悬浮液； (5)将上述细胞悬浮液接种至BALB/C小鼠腹腔，O.5ml/只； (6)7天后观察待小鼠腹部膨大发黑即可抽取小鼠腹水； (7)将抽取的小鼠腹水经辛酸-硫酸铵沉淀，透析后获粗制单克隆抗体； (8)再对上述粗制的单克隆抗体进行纯化即可。
7.根据权利要求4所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的显色液A是由浓度为30%过氧化氢用柠檬酸缓冲液稀释至其体积的1000倍所得；所述的显色液B是用含20% 二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成O. 4mg/ml所得。
8.根据权利要求7所述的瘦素检测试剂盒，其特征在于所述的柠檬酸缓冲液是由,3.4g乙酸钠和5. 2g朽1檬酸溶于5000ml的纯化水所得。
全文摘要
一种瘦素检测试剂盒，包括瘦素参考品，包被抗体微孔板，酶标记抗瘦素，洗涤液，显色液，终止液，所述的瘦素参考品为重组人瘦素多肽抗原，所述的包被抗体微孔板和酶标记抗瘦素为重组人瘦素多肽单克隆抗体。本发明的瘦素检测试剂盒的检测原理为将重组人瘦素多肽单克隆抗体作为包被抗体微孔板，加待测血清样品，再加相应的酶标抗体，生成包被抗体-待测血清样品-酶标抗体的复合物，添加显色液显色后，再加终止液终止，并用洗涤液洗去残留液，测定待测血清样品的吸光值，与标准曲线比较即可得出待测血清样品中的瘦素含量。
文档编号G01N33/577GK102901823SQ20121041460
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者宋礼华, 徐振山, 杜贤宇, 周业亭, 宋社吾, 饶海军 申请人:安徽安科生物工程(集团)股份有限公司