通过人血清乳铁蛋白免疫复合物辅助诊断类风湿关节炎试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了通过血清中乳铁蛋白免疫复合物含量辅助诊断自身免疫性疾病的试剂盒。本发明公开的辅助诊断类风湿性关节炎的ELISA试剂盒，用小鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体包被，抗人IgM与IgG抗体作为检测抗体，可以检测出人血清中乳铁蛋白免疫复合物含量。本发明的试剂盒可以用于辅助诊断类风湿性关节炎，具有重要的应用价值。
【专利说明】通过人血清乳铁蛋白免疫复合物辅助诊断类风湿关节炎试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明是一种通过血清中乳铁蛋白免疫复合物含量辅助诊断自身免疫性疾病的试剂盒。本发明辅助诊断类风湿性关节炎的ELISA试剂盒，用小鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体作为包被抗体，用抗人IgM与IgG抗体作为检测抗体，夹心ELISA的方式检测出人血清中乳铁蛋白免疫复合物含量。通过该试剂盒可以用于辅助诊断类风湿性关节炎，具有重要的应用价值。
【背景技术】
[0002]新生儿在出生后的一段时间内免疫系统没有发育完全，容易被各种病原微生物所侵害，这时需要来自母亲转移来的抵抗力帮助机体防御。这种可转移的抵抗力来源有两种，一种母亲的IgG通过胎盘进入胎儿的血液中，出生后仍能保持一段时间；另一种是通过母乳里的杀伤或是抑制病原微生物活性物质，对婴儿起到保护作用。母乳里抗菌活性物质中除了 IgA，溶菌酶外，一个重要的分子为乳铁蛋白。1960年Groves首先从牛的乳汁中纯化出一种能与铁结合的“红蛋白”；随后由于其转运铁的特性及来源，被命名为乳转铁蛋白(Iactotransferrin)或乳铁蛋白(lactoferrin, Lf)。
[0003]乳铁蛋白是一个非血红素铁结合蛋白，是转铁蛋白家族的一部分，与血清转铁蛋白，卵转铁蛋白，黑素转运铁蛋白和碳酸酐酶抑制因子共同组成转铁蛋白家族，其功能是在血清中运输铁。乳铁蛋白拥有强大的铁结合亲和力，这是在极端PH值范围内唯一保持铁的转运能力的蛋白，包括极酸性PH值。它也表现出更大的蛋白质降解阻力。
[0004]乳铁蛋白的这些特性使它成为一个具有多种生物学功能的蛋白质，除了提高机体对铁离子的吸收外等生理功能外，还具有抗菌，抗病毒，抗真菌，抗寄生虫，抗肿瘤等功能；近些年来，还发现乳铁蛋白能与免疫细胞结合，发挥重要的免疫调节作用。
[0005]乳铁蛋白在人体中广泛表达，进入大多数分泌液中，包括乳汁，唾液，泪液，鼻腔和支气管分泌物，胃肠液，胆汁，精液。乳铁蛋白含量最高的是乳汁，由乳腺细胞合成，成熟母乳和初乳的浓度中的乳铁蛋白浓度为l_7g/L。同时，乳铁蛋白也是嗜中性粒细胞次颗粒的主要成分，为血液中乳铁蛋白的主要来源。在炎症和一些病理情况下中，乳铁蛋白被嗜中性粒细胞次颗粒大量释放；在正常情况下血浆中乳铁蛋白浓度甚微，在正常情况下血浆中乳铁蛋白浓度约为0.4-2mg/L，但在败血症中能增加到200mg/L。
[0006]类风湿关节炎是一种常见的自身免疫性疾病，其病理特点为慢性进行性关节滑膜和关节软骨破坏，有较高的致残率。类风湿关节炎患者体内存在多种抗自身抗体及免疫复合物，如类风湿因子(RF)，抗核抗体(AM)，抗角蛋白抗体(AKA)，抗磷脂抗体(APL)及抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等。其中RF与抗体所形成的免疫复合物在疾病的发展过程中起较重要的作用。同时又可以作为诊断类风湿关节炎并评价其活动性的重要指标。而抗乳铁蛋白抗体属于ANCA的一种，在部分RA患者血清中呈高表达，但是单用抗乳铁蛋白抗体作为诊断指标，敏感性与特异性却并不太高。此外类风湿关节炎活动期，存在于嗜中性粒细胞次级颗粒的乳铁蛋白被大量释放，使其局部浓度由6 μ g/ml骤升至200 μ g/ml。但是乳铁蛋白升高主要是在关节液中，而血液中升高并不明显，作为诊断标准并不理想。
[0007]但是，由于乳铁蛋白与其抗体均在血清中高表达，其形成的免疫复合物会产生明显变化。免疫复合物又称为抗原抗体复合物，在固有免疫应答与适应性免疫应答中都起到重要作用。免疫复合物通过抗体的Fe段与免疫细胞上的Fe受体分子相结合，启动下游激活或是抑制信号，介导ADCC以及巨噬细胞对免疫复合物的捕获与清除。同时，免疫复合物激活补体系统，从而介导细胞对细菌的杀伤作用。因此乳铁蛋白免疫复合物在类风湿关节炎中发挥重要的作用，而且可以成为一个良好的辅助诊断指标。
[0008]经查，未发现通过人血清乳铁蛋白免疫复合物辅助诊断类风湿关节炎的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的主要在于通过ELISA方法检测出血清中乳铁蛋白免疫复合物的含量，从而作为类风湿关节炎的辅助诊断。
[0010]该方法具体如下:用抗人乳铁蛋白免疫复合物单克隆抗体作为包被抗体，封闭后，加入待测血清，然后用HRP标记的抗人IgM或抗人IgG作为检测抗体，用邻苯二胺显色。从而检测出乳铁蛋白免疫复合物的含量。
[0011]发明人的研究显示，正常人血清中没有乳铁蛋白免疫复合物的存在；而在活动的类风湿关节炎的病人血清中，有较高的乳铁蛋白免疫复合物的存在。并且乳铁蛋白免疫复合物作为类风湿关节炎的诊断指标，其敏感性和特异性都较高。做IgM型和IgG型免疫复合物的ROC曲线可知其曲线下面积分别为:0.8311和0.9290。(曲线下面积越大，表示特异性和敏感性越高，满分为I)
[0012]由此可知，检测血清中IgM型和IgG型的乳铁蛋白免疫复合物，如果含量较高，说明类风湿关节炎活动期的可能性极大。
[0013]因此，我们可以通过该试剂盒检测出血清中乳铁蛋白免疫复合物的含量，从而辅助诊断类风湿关节炎。
[0014]根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒的包被抗体是抗人乳铁蛋白单克隆抗体。
[0015]根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒还包括包被酶标的二抗，所述酶标的二抗是山羊抗人IgM和IgG、兔抗人IgM和IgG或鼠抗人IgM和IgG。
[0016]根据本发明的具体实施方案，其特征在于:所述试剂盒还包括如下试剂:牛血清白蛋白(BSA)、正常小鼠血清，PBS缓冲液、PBST溶液、PBST-BSA溶液、PBST-BSA-小鼠血清、OPD-磷酸柠檬酸缓冲液、硫酸和96孔酶标板；所述PBS缓冲液的浓度为0.15mol/L, pH为7.2 ;所述PBST溶液为在所述PBS缓冲液中加入TWeen20得到的溶液，所述TWeen20和所述PBS缓冲液的体积比为0.05% ;所述PBST-BSA溶液为在所述PBST缓冲液中加入牛血清白蛋白得到的溶液，所述牛血清白蛋白的终浓度为I克/L ;PBST-BSA-小鼠血清为在所述PBST-BSA溶液缓冲液中加入10%正常小鼠血清，所述OPD-磷酸柠檬酸缓冲液为在磷酸柠檬酸缓冲液加入磷苯二胺得到的溶液，所述邻苯二胺的质量百分比浓度为0.06%，所述磷酸柠檬酸缓冲液的PH为5.0，磷酸的浓度为0.lmol/L，柠檬酸的浓度为0.05mol/L。
[0017]综上所述，本发明着重于通过人血清乳铁蛋白免疫复合物辅助诊断类风湿关节炎试剂盒存在潜在的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为所示为用抗人乳铁蛋白单克隆抗体作为包被抗体，分别加入50份健康人血清和140份类风湿关节炎患者血清样本，用酶标抗人IgM和抗人IgG作为检测抗体，检测出血清中乳铁蛋白免疫复合物的含量。
[0019]图2所示为血清中IgM和IgG型的乳铁蛋白免疫复合物作为诊断类风湿关节炎标准，做出的显示其特异性和敏感性的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0020]为了使读者能够更清楚地理解并应用本发明，现参照以下实施例和附图进一步详细描述本发明。实施例仅用于阐述问题而不以任何方式限制本发明。
[0021]实施例中，一些主要的实验材料和方法如下所述，其他未注明具体条件的实验方法为所属研究领域众所周知的常规操作，或按照产品说明书所建议的条件。
[0022]【主要实验材料】
[0023]1、小鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体由本实验室制备。
[0024]2、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗人IgG、IgM抗体购自SBA公司。
[0025]3、正常小鼠血清来源于正常BALB/c (H_2d)小鼠，购自中国科学院遗传学研究所，雌性，6-8周龄。
`[0026]4、血清样品:正常人血清样品由北京市红十字血液中心提供；RA活动期病人血清样品由北京大学第二医院提供。
[0027]5、仪器设备与耗材
[0028]Eppendorf公司微量加样器；
[0029]芬兰雷勃公司ELISA reader ；
[0030]96孔酶标板；
[0031]Axygen公司微量吸头。
[0032]【主要实验方法】
[0033]1、小鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体(I μ g/ml)溶于pH = 9.6的碳酸盐缓冲液中，包被于96孔酶标板,每孔100 μ 1,4°C过夜。
[0034]2、PBS-T 溶液(PBS 缓冲液中加入 0.05% Tween20)洗 5 次。
[0035]3,2% BSA-PBST 溶液封闭，每孔 200 μ I，37°C封闭 2 小时。
[0036]4、PBS-T 溶液洗 5 次。
[0037]5、加入健康人血清(NHS)或RA患者血清样本，I: 200稀释于0.1% BSA-10%小鼠血清-PBST中，每孔100μ 1，37°C孵育2小时。
[0038]6、PBS-T 溶液洗 5 次。
[0039]7、再加入I: 4000稀释的HRP标记的羊抗人IgM和IgG，37°C孵育I小时。
[0040]8、PBS-T 溶液洗 5 次。
[0041]9、OPD-磷酸柠檬酸缓冲液显色(pH9.6)，12.5%硫酸溶液终止反应。[0042]10、ELISA reader 读取 0D492nm 吸光度值。
[0043]实施例一、健康人与类风湿关节炎患者血清中乳铁蛋白免疫复合物含量比较
[0044]结果如图1所示，无论是IgM型还是IgG型的乳铁蛋白免疫复合物在健康人血清中均无表达，而在大部分类风湿关节炎患者血清中明显升高。两型的乳铁蛋白免疫复合物在健康人和类风湿关节炎两组之间差异均十分显著(P < 0.001)。
[0045]实施例二、健康人与类风湿关节炎患者血清中乳铁蛋白免疫复合物含量比较ROC曲线
[0046]为评价乳铁蛋白免疫复合物在诊断RA中的应用价值，我们根据健康人组和RA患者组抗乳铁蛋白抗体水平与乳铁蛋白免疫复合物水平分别绘制了 ROC曲线(如图2)。ROC曲线又称受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve),是反映检测指标敏感性和特异性连续变量的综合指标。计算ROC曲线下面积AUC来评价诊断效率，面积大于0.5可认为该指标有诊断意义，面积越大判断价值越高。而IgM与IgG型乳铁蛋白免疫复合物曲线下面积AUC达到0.8311和0.9290，具有良好的特异性和敏感性。
【权利要求】
1.一种辅助诊断类风湿关节炎的ELISA试剂盒，包括用于包被的抗体；所述用于包被的抗体为小鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括包被酶标的二抗，所述酶标二抗是抗人IgM和IgG。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述酶标的二抗是山羊抗人IgM和IgG、兔抗人IgM和IgG或鼠抗人IgM和IgG。
4.如权利要求1至3中所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括如下试剂:牛血清白蛋白(BSA)、正常小鼠血清，PBS缓冲液、PBST溶液、PBST-BSA溶液、PBST-BSA-小鼠血清、OPD-磷酸柠檬酸缓冲液、硫酸和96孔酶标板；所述PBS缓冲液的浓度为0.15mol/L, pH为7.2 ;所述PBST溶液为在所述PBS缓冲液中加入TWeen20得到的溶液，所述TWeen20和所述PBS缓冲液的体积比为0.05% ;所述PBST-BSA溶液为在所述PBST缓冲液中加入牛血清白蛋白得到的溶液，所述牛血清白蛋白的终浓度为I克/L ；PBST-BSA-小鼠血清为在所述PBST-BSA溶液缓冲液中加入10%正常小鼠血清，所述OPD-磷酸柠檬酸缓冲液为在磷酸柠檬酸缓冲液加入磷苯二胺得到的溶液，所述邻苯二胺的质量百分比浓度为0.06%，所述磷酸柠檬酸缓冲液的PH为5.0，磷酸的浓度为0.lmol/L，柠檬酸的浓度为0.05mol/L。
【文档编号】G01N33/577GK103808936SQ201210444380
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】高晓明, 龙锴, 董洪亮 申请人:北京大学