专利名称：多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒。
背景技术：
1993年，Lancet首次报道降钙素原(前降钙素，PCT)水平在败血症时显著升高，血PCT浓度大于O. 5ng/ml时提示败血症可能,大于2ng/ml提示败血症的存在,大于10ng/ml则提示严重的脓毒败血症或休克，PCT可作为诊断脓毒败血症的特异性指标。近年，随着研究的深入，人们逐渐发现，细菌感染早期往往已经有PCT的低水平升 高(O. lng/ml O. 5ng/ml), PCT升高水平与细菌性感染严重程度及范围有关，PCT水平大于O. 25ng/ml时即建议使用抗生素治疗。正常健康人群PCT水平极低(小于O. 05ng/ml)，非细菌性感染或炎症(如病毒性感染，真菌性感染或自身免疫性炎症等)往往不伴随PCT的升高或轻微升高，因此PCT不仅能作为败血症的诊断指标，更广泛应用于细菌性感染的早期诊断和鉴别诊断，指导临床抗生素使用，并用于治疗疗效及预后监测。采用胶体金标记的降钙素原检测试剂盒有检测快速、操作简便的特点，但常规技术下的降钙素原胶体金免疫层析试剂检测灵敏度很难达到O. 25ng/mL·申请号为93118343. X (
公开日1993·8· 19)的专利文件披露了一种用于实现早期检测败血症并对治疗进行跟踪的方法的药盒，该药盒能够测定前降钙素含量为O. I 500ng/ml血清或血浆，进而判断败血症的存在，严重程度以及/或者对败血症的治疗效果；该药盒具体包含两种抗体(I) 一个或多个固定在载体上用以与样品中的前降钙素结合的第一单克隆或多克隆抗体；(2)另一携带标记并且与前降钙素在不同于第一抗体的结合区域的另一区域相结合的抗体。该药盒能够实现的技术效果是通过测定患者体液样品中的肽前降钙素和/或其形成的非完整降钙素片断的含量，通过测定这种确定的肽是否存在，含量的多少，得出有关是否有败血症，败血症的严重程度以及/或者治疗效果的结论。然而，前述专利文献披露的技术方案存在诸多技术缺陷，本领域技术人员通过常识很明显可以知晓，前述专利中的所谓的“一个或多个固定在载体上用以与样品中的前降钙结合的第一单克隆或多克隆抗体”，其本质是前降钙素的捕获抗体，但是，在该技术方案中，对应的标记抗体仅为一种。专利文献在其说明书第4页指出本发明意义上的“前降钙素”表示一种或多种肽；所有这些肽都包含由57个以上氨基酸组成的肽序列，特别是象完整的前降钙素那样的116个氨基酸序列，它们或与已知的序列一致，或者部分一致，只是在相应于前降钙素的第108至116个氨基酸区域可能存在差异。显然，专利文献中所述的仅一种标记抗体是无法实现对多种“前降钙素”片段进行有效标记的，从而无法保证尽可能多位点结合的“前降钙素”被检测出来，如果在此专利技术上采用胶体金、彩色磁珠等显色剂作为标记物标记单个抗体，将导致检测的灵敏度偏低，实践应用效果大打折扣。例如来自于该专利技术的降钙素原胶体金免疫层析试剂PCT-Q所能实现的检测下限仅仅为O. 5ng/ml,该专利为德国B. R. A. H. M. S所用，只可以满足败血症的筛查诊断,而不能达到用于细菌感染诊断和指导抗生素应用的O. lng/ml的检测灵敏度需求；分析其原因，通过胶体金、彩色磁珠等标记抗体实现检测，是基于胶体金、彩色磁珠具有显色性，当一定量的胶体金或彩色磁珠通过被标记抗体与待测抗原结合后，通过待测抗原与捕获抗体的结合使得胶体金颗粒或彩色磁珠颗粒聚集在一起，则形成肉眼可见的线条，当待测抗原浓度越高，则聚集在一起的胶体金或磁珠越多，线条的强度就越强，通过配套的仪器进行分析判读，就可测出待测抗原的浓度。以胶体金为例，常规用于抗体标记的胶体金颗粒的直径多在20 40nm，胶体金颗粒之间存在空间位阻，如果只是标记针对降钙素原某一个区域的一个抗体，那么能结合在抗体上的胶体金的数量是有限的，当待测降钙素原的浓度很低时，能够结合的这一个标记抗体的数量也是很少的，因此即便采用多个抗体作为捕获抗体，能够通过标记抗体而被捕获聚集的胶体金的数量也较少，难以形成肉眼可见的线条，因此难以达到较高的检测灵敏度。而采用本技术方案进行不同区域的多抗体标记，待测的降钙素原可以结合不同区域的标记抗体，那么能够结合在降钙素原上的胶体金颗粒更多，即便在检测浓度很低的降钙素原时，其能够聚集的胶体金颗粒更多更易产生可被分析的线条，从而 显著提高检测灵敏度。中国发明专利申请CN101029897A (
公开日2007· 9. 5)披露了一种降钙素原测试试剂盒及其测试方法，该方法采用纳米免疫磁性微珠作为分离试剂，发光标记物采用抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物，采用本发明所述的PCT试剂盒及其测试方法，基于化学发光法检测灵敏度可达到pg/ml级别的特点，虽然其标记抗体仅为一种，但其仍可具备较高的灵敏度，可实现PCT在细菌感染诊断领域的应用，但是，化学发光试剂需要配套的大型化学发光仪器，且不能直接检测全血，检测时需要标本离心、稀释、校准等多重步骤，操作过程繁复，检测时间长，不适合快速诊断。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，能实现O. I 200ng/ml浓度范围的PCT检测，用于细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及预后评估。同时标记针对降钙素原不同位点的抗体，可更好地克服胶体金等标记物的空间位阻影响，使得不同区域的标记抗体可最大化地与降钙素原结合，提高灵敏度，并且由于配伍的抗体对中含有针对降钙素原特异性肽片段的抗体，可特异性识别降钙素原，并将其与降钙素区分开来，从而实现高灵敏度及高特异性检测的性能。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒；所述试剂盒包含常规载体以及(I)固定在所述常规载体上的对应降钙素原不同区域的单克隆或多克隆的捕获抗体；以及(2)与(I)所述的捕获抗体配伍的，以合适标记物标记的多个针对降钙素原相同或不同区域的单克隆或多克隆抗体。优选地，所述捕获抗体对应降钙素原不同区域指的是降钙素原的N端区域或C端区域。优选地，所述与捕获抗体配伍的单或多克隆抗体针对的降钙素原相同或不同区域指的是降钙素区域和C端区域，或降钙素区域和N端区域。优选地，所述试剂盒中，每种被标记抗体的用量均小于该抗体单独标记时且能稳定标记物溶液的最低用量，进而保证每种抗体能够被标记物有效标记。优选地，所述标记物为胶体金、彩色磁珠或乳胶颗粒。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，通过标记与包被多抗体对的不同识别区域及空间配伍，能够最大限度地捕捉样本中降钙素原，提高检测灵敏度；本发明的试剂盒将PCT的检测灵敏度由O. 5ng/ml提高O. lng/ml,能实现O. I 200ng/ml的PCT，检测拓展了 PCT快速检测试剂在细菌性感染诊断、鉴别诊断及治疗中的应用价值及范围，可用于细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及预后评估；同时，由于配伍的抗体对中含有针对降钙素原特异性肽片段的抗体，可特异性识别降钙素原，并将其与降钙素区分开来，从而实现高灵敏度及高特异性检测的性能；本发明的试剂盒在使用时仅用15分钟即可实现全部检测过程，效率得到大大提闻;本发明的试剂盒可用于直接检测全血，真正实现一步式操作；因此，采用本发明的PCT检测试剂，既保证了检测的简便、快速，又通过多抗体标记实现了常规快速检测试剂难以达到的高灵敏度，对于推进细菌感染的及时准确诊断及抗生素的规范应用，具有重要的社会意义。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。本发明的发明人通过大量的研究，克服了诸多的技术问题，进而获得本发明的技术方案。本发明的发明人对于解决针对降钙素原或其肽进行捕获抗体与标记抗体的配伍选择和实现有效的多抗体标记等技术难题付出了创造性的劳动。本发明在选择最佳配伍抗体时，首先进行单个抗体标记，如捕获抗体为N端区域单克隆和(或)多克隆抗体，则对降钙素区域与C端区域的抗体单独标记后，分别与捕获抗体组合测试，选取灵敏度最高的标记抗体；捕获抗体为C端区域单克隆和(或)多克隆抗体，则对降钙素区域与N端区域的抗体单独标记后，分别与捕获抗体组合测试，选取灵敏度最高的标记抗体。不同区域的标记抗体确定后，则通过小样试验对多种标记抗体的标记浓度和标记PH值进行确定。首先找出每种标记抗体能稳定标记物溶液的最低用量。两种抗体同时标记时，每种抗体的用量为最低用量80%，而三种或以上抗体同时标记时，则每种抗体的用量为最低用量的40%。确定抗体的标记浓度后,则混合抗体,按照常规确定标记PH值的方法确定PH值后，之后进行批量标记。本发明的试剂盒中，被标记的多个抗体需根据与捕获抗体配伍的灵敏度进行筛选而不是随意配伍，备选抗体单个标记后与相应的捕获抗体配伍，同一区域中检测灵敏度最高的抗体确定为最终标记抗体；同时，多抗体标记时最佳PH值通过梯度PH值的小样测试确定，采用525nm波长处光密度值最高组的PH值为最佳标记PH。实施例、以胶体金为标记物的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒步骤一,确定捕获抗体与标记抗体(I)选择两个针对降钙素原N端区域的单克隆抗体，或者选取I个单克隆抗体与I个多克隆抗体，将其混合后固定在纤维素膜上作为捕获抗体，选择多个针对降钙素区域和C端区域的单克隆或多克隆抗体作为标记抗体；前述涉及的单克隆抗体、多克隆抗体均可以通过公开渠道获得；(2)分别用胶体金标记针对降钙素区域和C端区域的单克隆或多克隆抗体，并分别以0D25的浓度喷涂到金标垫上，37°C烘干；(3)与捕获抗体进行组合测试，采用常规技术筛选出针对降钙素区域和C端区域 检测灵敏度最高的单克隆或多克隆抗体，作为最终的标记抗体；步骤二 ,确定最佳标记浓度和pH值( I)确定每个抗体的最小标记量；①根据待标记抗体的等电点，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管Iml ；②将标记蛋白以标记缓冲液做系列稀释为5 μ g/ml 40 μ g/ml，分别取Iml，加入上列金胶溶液中，混匀，对照管只加Iml稀释液；③5min后，在上述各管中加入O. Iml 10%的NaCl溶液，混匀后静置2h，观察；④结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变；以稳定Iml胶体金溶液红色不变的最低抗体用量，即为该抗体的最小标记量；经实验降隹丐素区域的抗体最小标记量为10ug/ml胶体金溶液,C端区域的抗体最小标记量为12ug/ml胶体金溶液；(2)确定降I丐素区域的抗体以8ug、C端区域的抗体以9. 6ug加入Iml胶体金溶液中为最终标记浓度，以此浓度寻找最佳标记PH值；①采用16ug降I丐素区域的抗体及19. 2ugC端区域的抗体/ I. 8ml胶体金比例来确定最佳pH值；②设置pH 梯度pH6. O，6. 5，7. O，7. 5，8. O，8. 5，9. O，9. 5 标记缓冲液；③取8个试管，按照顺序，分别加入400ul ddH20, 200ul不同pH值的标记缓冲液，混合的待标抗体，胶体金溶液I. 8ml，混合均匀后静置5 lOmin，加入10%的NaCl溶液200ul ；④若出现由红变蓝的聚沉现象的首先去除；若目测无法明确的需在525nm处检测OD值，选择0D525最高的pH值，结果证明pH值为7. 5最为合适；步骤三,按照确定的抗体浓度和最佳PH值标记抗体(I)根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记抗体的总量；(2)在电磁搅拌下,将抗体溶液加入已调定pH值为7. 5的胶体金溶液中,加入蛋白质时应逐滴加入，Img的蛋白质大约5min加完；(3)在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%，搅拌15分钟；(4)将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化；步骤四，将标记好的胶体金以0D25的浓度喷涂到玻璃纤维上形成金标垫，37°C烘干;
步骤五，将捕获抗体(鼠源性)以合适浓度喷点到硝酸纤维素膜已确定位置上形成检测线(T线)，将羊抗鼠IgG抗体以合适浓度喷点到硝酸纤维素膜另一确定位置上形成对照线(C线)；步骤六，将金标垫、硝酸纤维素膜、样品垫、滤血膜及吸水纸按位置拼贴成试剂板，切条装壳，即形成降钙素原检测试剂卡；步骤七，用浓度O. I 200ng/ml的降钙素原标准品进行测试，放入配套仪器中判读，其检测灵敏度可达O. lng/ml，而此前单抗体标记的检测试剂，最高灵敏度组其灵敏度仅能达到O. 4ng/ml。本领域技术人员知晓如下事实，标记物选择彩色磁珠或乳胶颗粒时，本发明的试剂盒也可以实现同样的实施效果，实现高灵敏度及高特异性检测的性能，而此时，本领域技术人员无需付出创造性的劳动。综上所述，本发明的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，通过标记与包被多抗体对的不同识别区域及空间配伍，能够最大限度地捕捉样本中降钙素原，提高检测灵敏度；本发明的试剂盒将PCT的检测灵敏度提高至O. lng/ml，能实现O. I 200ng/ml的PCT检测拓展了 PCT快速检测试剂在细菌性感染诊断、鉴别诊断及治疗中的应用价值及范围，可用于细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及预后评估。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含常规载体以及 (I)固定在所述常规载体上的对应降钙素原不同区域的单克隆或多克隆的捕获抗体； 以及(2)与(I)所述的捕获抗体配伍的，以合适标记物标记的多个针对降钙素原相同或不同区域的单克隆或多克隆抗体。
2.如权利要求I所述的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，其特征是，所述捕获抗体对应降钙素原不同区域指的是降钙素原的N端区域或C端区域。
3.如权利要求I所述的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，其特征是，所述与捕获抗体配伍的单或多克隆抗体针对的降钙素原相同或不同区域指的是降钙素区域和C端区域，或降钙素区域和N端区域。
4.如权利要求I所述的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，其特征是，所述试剂盒中，每种被标记抗体的用量均小于该抗体单独标记时且能稳定标记物溶液的最低用量，进而保证每种抗体能够被标记物有效标记。
5.如权利要求I所述的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，其特征是，所述标记物为胶体金、彩色磁珠或乳胶颗粒。
全文摘要
本发明涉及一种检测技术领域的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，所述试剂盒包含常规载体以及固定在所述常规载体上的对应降钙素原不同区域的单克隆或多克隆的捕获抗体；以及与所述的捕获抗体配伍的，以合适标记物标记的多个针对降钙素原相同或不同区域的单克隆或多克隆抗体。本发明的多抗体标记的降钙素原快速检测试剂盒，通过标记与包被多抗体对的不同识别区域及空间配伍，能够最大限度地捕捉样本中降钙素原，提高检测灵敏度；本发明的试剂盒将PCT的检测灵敏度提高至0.1ng/ml，拓展了PCT快速检测试剂在细菌性感染诊断、鉴别诊断及治疗中的应用价值及范围，可用于细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及预后评估。
文档编号G01N33/68GK102928606SQ20121046425
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者陈莉莉, 王颖 申请人:武汉明德生物科技有限责任公司