专利名称：一种手足口病分型检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种手足口病分性检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
手足口病(hand food and mouth disease, HFMD )是一种以手足皮肤和口腔粘膜疱疹为主要症状的小儿急性传染病。手足口病在国外1957已有报道，1981年我国由上海首次报告了手足口病疫情，近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，引发HFMD的肠道病毒有20多种(型)，其中柯萨奇病毒A16型(Coxsckievirus A16, CA16)和肠病毒71型(enterovirus71，EV71)最为常见。通常情况下，EV71感染引起的HFMD在临床症状等方面与CA16感染所引起的HFMD难以区别。CA16感染所致的患者可引发心肌炎、心包炎等并发症，而EV71感染容易引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎及由此引发急性驰缓性瘫痪、肺水肿和出血等严重并发症，死亡率较高。2008年春季在我国安徽阜阳地区暴发的手足口病，使数千名儿童受感染，19例患儿因并发脑干脑炎、肺水肿和出血死亡，经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测和病毒培养证实为EV71感染所致。我国卫生部已于2008年5月2日将手足口病纳入丙类传染病管理。为了能对HFMD做到早发现、早分型诊断、早治疗，积极预防并发症，建立HFMD快速分型检测方法尤为重要。目前较常用的仍为病毒培养分离及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，这两种方法需要昂贵的设备和严格的实验室条件，而且检测时间需要数天至数周，不利于临床及时诊断和治疗，目前这两种方法仅限在疾病控制中心和少数研究机构，大多数医院均无条件开展。胶体金免疫法(colloidal gold immunoassay,CGIA)是20世纪90年代初建立的一种简易快速稳定的免疫学检测技术[3]，最初由Beggs等首先应用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)测定。现已广泛用于幽门螺杆菌、肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病抗原抗体及激素、药物的检测，Hopley等首次将此法用于粪便中轮状病毒和肠病毒抗原的检测。而CGIA用于手足口病(HFMD)的分型检测在国内尚未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种手足口病分性检测试剂盒及其制备方法。本发明提供的试剂盒能够直接即时(数分钟内)检测手足口病患儿咽拭子或粪便中病毒抗原，并能同时检测EV71和CA16两种病原体，对手足口病患儿分型诊断，且操作简单，不需特殊仪器，适合于各级医疗机构和疾病控制中心使用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案本发明提供了一种手足口病分型检测试剂盒，包括检测用具，检测用具依次包括加样区、检测区和质控区；检测区包括第一检测区和/或第二检测区，第一检测区包被肠病毒71型抗体，第二检测区包被柯萨奇病毒A16型抗体；质控区包被肠病毒71型和柯萨奇病毒A16型的混合物。
EV71是小RNA病毒科肠道病毒属的成员[7]，其病毒基因组编码4个外壳蛋白，即VPI、VP2、VP3、VP4。这4个蛋白通过拼装成原聚体和亚单位，最终形成病毒外壳，VPI、VP2、VP3暴露在病毒表面，VP4则包埋在病毒内侧起连接作用，其抗原表位位于VPl、VP2、VP3上，而主要中和抗原决定簇则主要集中于外壳蛋白VPl上。CA16是单股正链RNA病毒，毒粒为二十面立体对称，呈球形，直径23-33nm，核衣壳裸露，衣壳蛋白包括VPl到VP4，其中VPl具有主要抗原决定簇，CA16VP1和EV71VP1是病毒血清型的分型依据在本发明的一些实施例中，本发明提供的手足口病分型检测试剂盒还包括检测容器，检测容器设置有与检测用具匹配的空腔，检测容器与检测用具可拆卸连接。在本发明的另一些实施例中，本发明提供的手足口病分型检测试剂盒，还包括标准区。在本发明的一些实施例中，标准区包括第一标准区和/或第二标准区，第一标准区与第一检测区对应，第二标准区与第二检测区对应。在本发明的另一些实施例中，本发明提供的手足口病分型检测试剂盒中，标准区设置于检测容器，第一标准区设置第一标记，第二标准区设置第二标记；第一标记指示肠病毒71型，第二标记指示柯萨奇病毒A16型。在本发明的另一些实施例中，本发明提供的手足口病分型检测试剂盒中还包括封闭液、洗涤液、胶体金标记的肠病毒71型抗体和胶体金标记的柯萨奇病毒A16型抗体。在本发明的另一些实施例中，本发明提供的手足口病分型检测试剂盒中，检测用具包括硝酸纤维素膜和吸水纸垫。本发明还提供了手足口病分型检测试剂盒用于检测肠病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的应用。本发明还提供了上述手足口病分型检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤获得肠病毒71型和柯萨奇病毒A16型；获得肠病毒71型抗体和柯萨奇病毒A16型抗体；获得胶体金标记的肠病毒71型抗体和胶体金标记的柯萨奇病毒A16型抗体；取硝酸纤维素膜和吸水纸垫制备获得检测用具；取检测用具在第一检测区包被肠病毒71型抗体，在第二检测区包被柯萨奇病毒A16型抗体；取检测用具在质控区包被肠病毒71型和柯萨奇病毒A16型的混合物；取检测用具与设置有和检测用具匹配的空腔的检测容器可拆卸连接。作为优选，包被肠病毒71型抗体具体为在检测用具第一检测区喷涂肠病毒71型抗体后直37 C保温30min后，直4 C 封保温。作为优选，包被柯萨奇病毒A16型抗体具体为在检测用具第二检测区喷涂柯萨奇病毒A16型抗体后直37 C保温30min后，直4 CS封保温。本发明还提供了基于上述的手足口病分型检测试剂盒的非疾病检测方法，包括如下步骤在加样区加入封闭液封闭后，加入待检样品，加入洗涤液洗涤后，分别加入金标记的肠病毒71型抗体和柯萨奇病毒A16型抗体,再加入洗漆液洗去未结合的金标记的肠病毒71型抗体和柯萨奇病毒A16型抗体，静置后观测结果；质控区显示红色质控线，测试结果有效；第一检测区出现红色检测线，待测样品为肠病毒71型抗原阳性；第二检测区出现红色检测线，待测样品为柯萨奇病毒A16型阳性；第一检测区或第二检测区均未出现红色检测线，待测样品为阴性。本发明利用胶体金免疫法(colloidal gold immunoassay,CGIA)双抗体夹心原理将柯萨奇病毒A16型膜壳蛋白I (CA16VP1)和肠病毒71型膜壳蛋白I (EV71VP1)的抗体包被于硝酸纤维膜中，用于检测手足口病患者咽拭子或粪便中不同类型的手足口病病毒抗原CA16VP1阳性则为柯萨奇病毒A16型感染，而EV71VP1阳性则为肠病毒71型感染。本发明提供的试剂盒能够直接即时(数分钟内)检测手足口病患儿咽拭子或粪便中病毒抗原，并能同时检测EV71和CA16两种病原体，对手足口病患儿分型诊断，且操作简单，不需特殊仪器，适合于各级医疗机构和疾病控制中心使用。本发明提供的试剂盒对手足口病分型检测，分别检测136例HFMD患J L和30例正常儿童粪便中柯萨奇病毒A16型(Coxsckievirus A16, CA16)和肠病毒71型(enterovirus71, EV71),以逆转录聚合酶链反应(RT — PCR)为标准,评价本发明提供的试剂盒的检测性能。本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27. 2%和28. 6% ;本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR检测136例手足口病患儿粪便CA16阳性率分别为33. 8%和35. 3% ;以RT-PCR为标准，本发明提供的试剂盒的检测方法检测手足口病患儿粪便EV71的敏感性89. 7%，特异性97. 9%，阳性预测值94. 5%，阴性预测值95. 9%，准确度95. 5% ;本发明提供的试剂盒的检测方法检测手足口病患儿粪便CA16的敏感性85. 4%，特异性94. 3%，阳性预测值89. 1%，阴性预测值92. 2%，准确度91. 1%。综合上述实验结果，本发明提供的试剂盒的检测方法法操作简单、方便、快速，特异性和敏感性好，为手足口病病原学早期分型诊断提供了一个有效的检测手段。
图I示重组EV71VP1和蛋白质分子量标准同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮兰染色结果；其中，重组EV71VP1和CA 16 VPI的分子量分别为33. 8KD、33. 3KD，泳道I示标准蛋白分子量，泳道2示重组EV71VP1，泳道3示重组CA16VP1。
具体实施例方式本发明公开了一种手足口病分型检测试剂盒及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的一种手足口病分型检测试剂盒及其制备方法中所用试剂均可由市场购得。其中，重组肠病毒71膜壳蛋白I (EV71VP1)、柯萨奇病毒A16型膜壳蛋白I(CA16VP1)和抗EV71VP1、CA 16 VPI抗体来源于深圳市伯劳特生物制品有限公司；氯金酸(HAuC14):美国Sigma产品；硝酸纤维膜(NC)来自美国伯乐(BIO-RAD)公司；EV71和CA16抗体阳性血清来源于感染科经RT-PCR鉴定后证实为EV71或CA 16感染的HFMD恢复期患者。下面结合实施例，进一步阐述本发明 实施例I试剂盒的制备金标EV71VP1、CA16VP1抗体制备在O. 01%氯金酸水溶液IOOml中加入1%柠檬酸三钠1ml，加热煮沸15-30分钟，溶液由蓝色变为红色，即为胶体金溶液，调配成O. 01%胶体金分别与O. 5mg/mlEV71VPl、CA 16 VPI抗体按10 1比例混合，电磁搅拌30分钟，确定终体积，加10%BSA至终浓度为1%，继续搅拌30分钟。4°C静置2小时，4°C下以1500转/分钟离心15分钟，弃沉淀后再以10000转/分钟离心I小时，吸弃上清液，沉淀物用O. Olmol/LPB (1%BSA, O. 02%PEG和O. 05%NaN3)重新悬浮至原体积的1/10，用孔径为O. 45um滤膜过滤，收集金标EV71VP1、CA16VP1抗体，置4°C避光保存备用。抗原(重组EV71VP1和CA16VP1)和抗体(EV71VP1、CA16VP1抗体)的包被分别在质控区喷涂重组2ng/ml EV71VP1和CA16VP1重组蛋白，在第一检测区和第二检测区喷涂5ng/mlEV71VPl和CA16VP1抗体，置37°C烘箱，30分钟，取出后密封置4°C保存。检测工具依次设置有加样区、第一检测区、第二检测区、质控区。检测工具包括包被了抗原、抗体的NC膜以及NC膜下为特制的吸水纸垫。NC膜上第一检测区包被EV71VP1抗体，第二检测区包被CA16VP1抗体，质控区包被EV71VP1重组蛋白和CA16VP1重组蛋白的混合物。检测工具与检测容器组装后制备获得检测盒，连同封闭液、洗涤液、胶体金标记的肠病毒71型抗体和胶体金标记的柯萨奇病毒A16型抗体制备获得试剂盒。实施例2研究对象HFMD患者来源于本院感染科按照卫生部《手足口病预防控制指南(2008年版)》标准临床诊断的HFMD患者136例(男79例，女57例)，年龄6个月至8岁；正常对照30例来源于本院健康体检的儿童，其中男17例，女13例，年龄6个月至7岁，近两周无发热和腹泻病史。标本采集和保存对临床诊断3天内的HFMD患者和正常对照儿童取大便2克左右(花生米大小)置含3晕升Hanks液的试管4°C保存。在实施例I制备的检测工具的加样区中加入封闭液100 μ L，待渗入；加入稀释后待检粪便100 μ L，待渗入；加入洗涤液200 μ L，待渗入；加入金标记的EV71VP1和CA16VP1抗体100 μ L，待渗入；加入洗涤液200 μ L，洗去未结合的金标抗体，5分钟内观测结果。结果判断质控区应显示红色质控线，如未显色则本次测试无效；第一检测区出现红色线表示为EV71VP1抗原阳性，提示患者受EV71感染；第二检测区出现红色线表示为CA16VP1抗原阳性，提示患者受CA16感染；第一检测区和第二检测区均未显色表示本测试为阴性。荧光定量RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测仪(ΑΒΙ7300);高速冷冻离心机(eppendorf5417R) ；EV71和CA16荧光定量PCR检测试剂盒由中山医科大学达安基因股份有限公司生产，按试剂盒说明书进行检测；结果判断如检测标本扩增曲线无对数增长期或Ct值>37为阴性；如检测标本Ct值〈37且扩增曲线有明显的对数增长期为阳性。统计学分析用SPSS13. O软件包，以RT-PCR检测结果为标准，计算CGIA检测EV71和CA16感染的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度。不同标本检测的阳性率差异采用X2检验，P<0. 05为差异有统计学意义。重组EV71VP1和CA16VP1验证将重组EV71VP1和蛋白质分子量标准同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮兰染色，根据EV71VP1区带的距离与蛋白质分子量标准比较，通过半对数曲线，确定重组EV71VP1和CA16VP1的分子量分别为33. 8KD和33. 3KD,并经免疫印迹分析此区带能与EV71和CA16抗体阳性血清特异性反应(见图I)。本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便EV71阳性率分别为27. 2%和28. 6% ;本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR检测136例HFMD患儿粪便CA16阳性率分别为33. 8%和35. 3% ;本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR检测手足口病患儿粪便中EV71和CA16的阳性率均无明显差异(P>0. 05);粪便标本中CA16阳性率均高于EV71 (P<0. 05)(见表I)。表I本发明提供的试剂盒的检测方法和RT-PCR检测HFMD患儿粪便EV71和CA16结果比较
检测方法标本数量EV71(+) (%)CA16(+) (%)RT-PCR13639(28. 6)48(35. 3) Λ本发明提供的试剂盒的检测方法13637(27. 2) *46(33. 8) Λ**本发明提供的试剂盒的检测方法与RT-PCR相比检测EV71和CA16阳性率均无明显差异(Ρ>0· 05) ;Λ粪便标本中CA16阳性率均高于EV71 (Ρ〈0· 05)RT-PCR检测30例健康儿童粪便EV71和CA16阳性率分别为6. 7%和10. 0% ;本发明提供的试剂盒的检测方法检测30例健康儿童粪便EV71和CA16阳性率分别为10. 0%和3. 3% ;提示健康儿童中可能存在少数HFMD隐性感染患儿(见表2)。表2C本发明提供的试剂盒的检测方法和RT-PCR检测30例健康儿童粪便EV71和CA16结果比较
检测方法标本数量EV71(+) (%)CA16(+) (%)RT-PCR302 (6. 7)3(10. O)本发明提供的试剂盒的检测方法303(10. O)1(3. 3)以RT-PCR为金标准，本发明提供的试剂盒的检测方法检测HFMD患J L粪便EV71的敏感性89. 7%，特异性97. 9%，阳性预测值94. 5%，阴性预测值95.9%,准确度95. 5%(见表3)表3本发明提供的试剂盒的检测方法和RT-PCR检测136例患儿粪便EV71结果比较
分组RT-PCR(+)RT-PCR(-)合计
权利要求
1.一种手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，包括检测用具，所述检测用具依次包括加样区、检测区和质控区；所述检测区包括第一检测区和/或第二检测区，所述第一检测区包被肠病毒71型抗体，所述第二检测区包被柯萨奇病毒A16型抗体；所述质控区包被肠病毒71型和柯萨奇病毒A16型的混合物。
2.根据权利要求I所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，还包括检测容器，所述检测容器设置有与所述检测用具匹配的空腔，所述检测容器与所述检测用具可拆卸连接。
3.根据权利要求2所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，还包括标准区。
4.根据权利要求3所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，所述标准区包括第一标准区和/或第二标准区，所述第一标准区与所述第一检测区对应，所述第二标准区与所述第二检测区对应。
5.根据权利要求4所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，所述标准区设置于所述检测容器，所述第一标准区设置第一标记，所述第二标准区设置第二标记；所述第一标记指示肠病毒71型，所述第二标记指示柯萨奇病毒A16型。
6.根据权利要求5所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，还包括封闭液、洗涤液、胶体金标记的肠病毒71型抗体和胶体金标记的柯萨奇病毒A16型抗体。
7.根据权利要求6所述的手足口病分型检测试剂盒，其特征在于，所述检测用具包括硝酸纤维素膜和吸水纸垫。
8.根据权利要求I至7任一项所述的手足口病分型检测试剂盒用于检测肠病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的应用。
9.根据权利要求I至7任一项所述的手足口病分型检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤获得肠病毒71型和柯萨奇病毒A16型；获得肠病毒71型抗体和柯萨奇病毒A16型抗体；获得胶体金标记的肠病毒71型抗体和胶体金标记的柯萨奇病毒A16型抗体；取硝酸纤维素膜和吸水纸垫制备获得检测用具；取所述检测用具在所述第一检测区包被所述肠病毒71型抗体，在所述第二检测区包被所述柯萨奇病毒A16型抗体；取所述检测用具在所述质控区包被所述肠病毒71型和所述柯萨奇病毒A16型的混合物；取所述检测用具与设置有和所述检测用具匹配的空腔的所述检测容器可拆卸连接。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种手足口病分型检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒利用双抗体夹心原理将柯萨奇病毒A16型膜壳蛋白1(CA16VP1)和肠病毒71型膜壳蛋白1(EV71VP1)的抗体包被于硝酸纤维膜中，用于检测手足口病患者咽拭子或粪便中不同类型的手足口病病毒抗原CA16VP1阳性则为柯萨奇病毒A16型感染，而EV71VP1阳性则为肠病毒71型感染。本发明提供的试剂盒能够直接即时(数分钟内)检测手足口病患儿咽拭子或粪便中病毒抗原，并能同时检测EV71和CA16两种病原体，对手足口病患儿分型诊断，且操作简单，不需特殊仪器，适合于各级医疗机构和疾病控制中心使用。
文档编号G01N33/569GK102944677SQ20121048678
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者马伟民, 张永顶, 马新民 申请人:深圳市伯劳特生物制品有限公司