手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法
【专利摘要】本发明公开手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法。该方法包括如下步骤：（1）将衍生化试剂的溶液进样至毛细管柱中，然后将药物样品溶液进样，再将衍生化试剂的溶液进样，之后将毛细管柱两端插入操作缓冲液中于电压10kV下维持3s～10s进行衍生化反应；（2）在线进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定；（3）将得到药物样品测定的电泳图，对照对照品D,L-精氨酸电泳图，确定药物样品是否含有D-精氨酸和/或L-精氨酸。该方法简便、快速、准确且更经济，具有样品和衍生化试剂的用量极少，易于控制和自动化，专属性强等特点。
【专利说明】手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，具体涉及一种手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法。
【背景技术】
[0002]药物制剂中的氨基酸常用于药物的助溶、调节制剂的pH值、增加制剂的稳定性或减轻给药时的疼痛感。已知氨基酸在生命活动中扮演着重要的角色，但某些氨基酸的D-构型具有与其L-构型不同的生理活性，因此，对手性氨基酸的分离分析历来是生命科学、食品科学、环境科学等及相关领域的重要研究内容。
[0003]大多数氨基酸无光吸收特征，一般需采用质谱等特殊的检测器或进行衍生化反应后才能被检测。邻苯二甲醛是目前氨基酸分析中使用最广泛的衍生化试剂。在碱性条件下，邻苯二甲醛、巯基试剂与含伯胺基团的化合物迅速反应，生成可进行紫外或荧光检测的异吲哚衍生物。但该衍生物不稳定，易受反应时间、温度以及光线等的影响，须严格控制反应条件，故此法多用于全自动的在线分离分析。邻苯二甲醛衍生物可在330?350nm处进行紫外检测，而过量的衍生化试剂、抗生素及其杂质一般在此波长范围内无吸收，故不干扰对邻苯二甲醛衍生物的检测。
[0004]电泳中介微分析是两种或两种以上的物质在毛细管内进行反应，然后在电场作用下分离产物、副产物及未完全反应物等的过程。现有技术中，应用电泳中介微分析技术手性分离氨基酸的文献较少，仅有的研究氨基酸手性分离的方法均存在若干缺陷。如Tivesten等人采用邻苯二甲醛和手性巯基试剂1-硫代-β -D-葡萄糖四乙酸酯进行手性分离，但该方法存在区带展宽效应的缺陷(Journal of High Resolution Choromatography, 1996,19:229-233),且在该分离系统中L-精氨酸衍生物与在其之前迁移的一衍生化副产物分离较差(Journal of Choromatography A, 1995, 708:323-337) ;Han 等和 Fradi 等人均选用氯甲酸_9_荷基甲酯(9-f luoroenylmethyl chloroformate)为衍生化试剂以及手性拆分剂，但仅能部分分离精氨酸，且检测波长分别为214nm和210nm，抗生素及其杂质干扰检测(Electrophoresis, 2007, 28:2765-2770 ；Journal ofChoromatographyA,2012,1267:121-126) ;Martinez-Giron等人采用6-氨基喹啉-N-(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯(6-aminoquinoIy 1-N-hydroxysuccinimidyI carbamate)为衍生化试剂以及价格昂贵的手性拆分剂，但检测波长为260nm,抗生素及其杂质干扰检测(Electrophoresis, 2009, 30:696-704)。目前尚未见文献报道，采用电泳中介微分析技术手性分离药物制剂中氨基酸且能克服上述缺陷的方法，该现状亟待解决。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术的电泳中介微分析技术手性分离氨基酸方法存在区带展宽效应、与其他衍生化副产物分离较差，或者仅能部分分离精氨酸、抗生素及其杂质干扰检测、或者价格昂贵等缺陷，提供了一种简便、快速、准确且更经济，具有样品和衍生化试剂的用量极少，易于控制和自动化，专属性强的手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析方法。
[0006]本发明的手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法包括如下步骤:
[0007](I)将衍生化试剂的溶液进样至毛细管柱中，然后将药物样品溶液进样，再将衍生化试剂的溶液进样，之后将毛细管柱两端插入操作缓冲液中于电压IOkV下维持3s?IOs进行衍生化反应；
[0008]其中，所述的毛细管柱为未涂层弹性石英毛细管；所述的毛细管柱的温度为15°C?25°C;所述的衍生化试剂为邻苯二甲醛和N-酰基-巯基氨基酸类化合物；所述的药物样品溶液中精氨酸与衍生化试剂的摩尔比为(I:3)~(1:10);反应体系的pH值为9.5?
10.5 ;所述的操作缓冲液为pH值9.0?9.4的含十二烷基硫酸钠的硼酸盐缓冲液；所述的十二烧基硫酸钠的浓度为60?75mmol/L ;所述的硼酸盐缓冲液的浓度为8?15mmol/L ；
[0009](2)在步骤(I)的衍生化反应后，在线进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定；所述的非手性毛细管胶束电动色谱分离测定的检测波长为330?350nm ；
[0010](3)将步骤(2)测定得到药物样品测定的电泳图，对照按照前述步骤(I)和(2)将对照品D，L-精氨酸测定的电泳图，确定药物样品是否含有D-精氨酸和/或L-精氨酸。
[0011]本发明中，所述的药物样品为本领域常规所说的含有精氨酸药物，不受其中的药物活性物质影响，如注射用氨曲南、注射用盐酸头孢吡肟、注射用头孢拉定、注射用头孢他啶等等均可。
[0012]本发明中，所述的药物样品溶液为本领域常规所说的含有精氨酸药物的水溶液，一般含有精氨酸药物加水溶解并稀释后，滤过即得，较佳的为含精氨酸浓度lmg/ml的水溶液。
[0013]本发明中，所述的衍生化试剂的溶液中邻苯二甲醛的浓度较佳的为2mg/ml?6mg/ml。
[0014]本发明中，所述的邻苯二甲醛和N-酰基-巯基氨基酸类化合物的摩尔比较佳的为1:1。
[0015]本发明中，所述的衍生化试剂的溶液为按照本领域常规配置，较佳的先将衍生化试剂加乙醇至溶解，10mmol/L硼砂溶液至目标浓度,用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至
9.5?10.5，较佳的为10.0。所述的衍生化试剂的溶液优选pH值为衍生化反应体系优选pH值。
[0016]本发明中，所述的药物样品溶液中精氨酸与衍生化试剂的摩尔比较佳的为(I:4)?(1:8)。
[0017]本发明中，所述的N-酰基-巯基氨基酸类化合物为本领域常规所说，较佳的为N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯、N-乙酰基-D-半胱氨酸甲酯、N-(叔丁氧基羰基)-L-半胱氨酸甲酯、N-异丁酰基-L-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸、L-青霉胺、D-青霉胺、或者N-乙酰基-D-青霉胺。
[0018]本发明中，所述的操作缓冲液中，硼酸盐缓冲液的pH值较佳的为9.2 ;硼酸盐缓冲液的浓度较佳的为10mmol/L ;十二烧基硫酸钠的浓度较佳的为65mmol/L。
[0019]本发明的手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析方法使用的设备为本领域常规使用的毛细管电泳仪，市售可得，如Agilent G1600AX型毛细管电泳仪。
[0020]本发明中，所述的进样一般按本领域常规操作在进样端，即阳极进样。
[0021]本发明步骤(I)中，所述的反应体系的pH值较佳的为10.0。
[0022]本发明中，所述的进样的条件为常规毛细管操作进样条件，较佳的，所述的衍生化试剂的溶液在20mbar压力下进样2s?3s至毛细管柱中，然后将药物样品溶液在20mbar压力下进样2s?3.5s,再将衍生化试剂的溶液在20mbar压力下进样2s?3s。
[0023]本发明中，所述的衍生化反应的操作较佳的为毛细管柱两端插入操作缓冲液中于电压IOkV下维持5s进行衍生化反应。
[0024]本发明步骤(I)中，所述的进样完毕、或加电压衍生化反应之前均按照本领域常规操作，为避免各溶液之间相互污染，将毛细管柱两端在水中浸一下。
[0025]本发明步骤(I)中，所述的衍生化反应为本领域公知的快速反应，数秒内即可完成反应，且衍生化反应完成后无论静置反应时间多长，检测出的产物量不变，非常便于操作。
[0026]本发明步骤(2)中，所述的在线进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定中分离时的条件较佳的为以20kV维持6min?IOmin,较佳的为7min。
[0027]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0028]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0029]本发明的积极进步效果在于:本发明的手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析方法分析过程简单、快速、准确且更经济，成本低廉，具有样品和衍生化试剂的用量极少，分析易于控制和自动化，专属性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为实施例1中D，L-精氨酸衍生物的电泳图。
[0031]图2为实施例1中空白的电泳图。
[0032]图3为实施例2检测注射用氨曲南衍生物的电泳图。
[0033]图4为实施例3检测注射用盐酸头孢吡肟衍生物的电泳图。
[0034]图5为实施例4检测注射用头孢拉定衍生物的电泳图。
[0035]图6为实施例5检测注射用头孢他啶衍生物的电泳图。
【具体实施方式】
[0036]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0037]下述实施例中涉及设备和原料如下:
[0038]Agilent G1600AX型毛细管电泳仪。非涂层弹性石英毛细管(50 μ m 1.d，柱长为64.5cm,有效柱长为56cm)。操作电压:20kV ;两次进样中间依次用0.lmol/L氢氧化钠溶液和操作缓冲液分别冲洗毛细管Imin和2min。
[0039]注射用头孢拉定、注射用头孢他啶、注射用盐酸头孢比肟和注射用氨曲南:市售品。头孢拉定对照品、头孢他啶对照品、盐酸头孢比肟对照品和氨曲南对照品:中国食品药品检定研究院。
[0040]D-精氨酸、L-精氨酸、D，L-精氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯、L-青霉胺、D-青霉胺、邻苯二甲醛、十二烷基硫酸钠(SDS,电泳级，99%):Sigma-Aldricho
[0041]四硼酸钠、硼酸和氢氧化钠:分析纯。
[0042]水:MiIliporeMill1-Q Gradient AlO 纯水仪制备。
[0043]实施例1
[0044]1、操作条件及溶液配制
[0045]操作缓冲液:含65mmol/L SDS的硼酸盐缓冲液(10mmol/L硼砂溶液，必要时用硼酸或lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.2)。
[0046]毛细管温度:20°C ;检测波长:350nm (参比波长:off)。
[0047]取D，L-精氨酸约10mg，置IOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0048]另取邻苯二甲醒28mg和N-乙酰基-L-半胱氨酸34mg,加乙醇Iml使溶解,加硼酸盐溶液(lOmmol/L硼砂溶液，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0)9ml，混匀，用Imol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0,作为衍生化试剂溶液。
[0049]2、电泳中介微分析测定
[0050]取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2.5s,再取样品溶液在20mbar压力下进样3s,最后取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2.5s,每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在水中浸一下；将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，力口电压IOkV并维持5s，使精氨酸与衍生化试剂混合；精氨酸与衍生化试剂的摩尔比1:6。
[0051]直接加电压20kV维持7分钟进行分离测定。
[0052]结果见图1，纵坐标为峰强，即吸收值，下同。图1中I为L-精氨酸衍生物峰；3为D-精氨酸衍生物峰；2为副产物峰。表明L-精氨酸衍生物与D-精氨酸衍生物以及反应副产物可以达到基线分离，本实施例D，L-精氨酸测定电泳图可用作对照。
[0053]3、空白试验
[0054]按照前述2的实验步骤和条件，以水代替样品溶液进行操作，进行毛细管胶束电动色谱分析，结果见图2。
[0055]图2中2为副产物峰；在L-精氨酸衍生物与D-精氨酸衍生物的迁移时间处无色谱峰，表明衍生化试剂以及反应副产物不干扰测定。
[0056]实施例2
[0057]取含精氨酸约IOmg的注射用氨曲南适量，置IOml量瓶中，按照实施例1的实验步骤操作，并按实施例1的条件进行毛细管胶束电动色谱分析，结果见图3。
[0058]经与图1比较，图3中I为L-精氨酸衍生物峰；2为副产物峰。表明L-精氨酸衍生物与氨曲南及其杂质的衍生物以及反应副产物可以达到基线分离。
[0059]实施例3
[0060]1、操作条件及溶液配制
[0061]操作缓冲液:含60mmol/L SDS的硼酸盐缓冲液(15mmol/L硼砂溶液，必要时用硼酸或lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0)。[0062]毛细管温度:25°C ;检测波长:330nm (参比波长:off)。
[0063]取含精氨酸约IOmg的注射用盐酸头孢吡肟适量，置IOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0064]另取邻苯二甲醒56mg和N-异丁酰基_L_半胱氨酸80mg,加乙醇Iml使溶解,加硼酸盐溶液(lOmmol/L硼砂溶液，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0) 9ml，混匀，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，作为衍生化试剂溶液。
[0065]2、电泳中介微分析测定
[0066]取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2s,再取样品溶液在20mbar压力下进样
3.5s,最后取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2s,每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在水中浸一下；将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压IOkV并维持3s，使精氨酸与衍生化试剂混合；精氨酸与衍生化试剂的摩尔比1:8。
[0067]直接加电压20kV维持8分钟进行分离测定。结果见图4。
[0068]经与同衍生化体系和分离系统检测得到D，L-精氨酸测定电泳图比较，图4中I为L-精氨酸衍生物峰；2为副产物峰。表明L-精氨酸衍生物与头孢比肟及其杂质的衍生物以及反应副产物可以达到基线分离。
[0069]实施例4
[0070]1、操作条件及溶液配制
[0071]操作缓冲液:含75mmol/L SDS的硼酸盐缓冲液(8mmol/L硼砂溶液，必要时用硼酸或lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.4)。
[0072]毛细管温度:15°C ;检测波长:350nm (参比波长:off)。
[0073]取含精氨酸约IOmg的注射用头孢拉定适量，置IOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0074]另取邻苯二甲醒20mg和N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯32mg,加乙醇Iml使溶解,力口硼酸盐溶液(lOmmol/L硼砂溶液，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0 ) 9ml，混匀，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.5，作为衍生化试剂溶液。
[0075]2、电泳中介微分析测定
[0076]取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样3s,再取样品溶液在20mbar压力下进样2s,最后取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样3s,每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在水中浸一下；将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压IOkV并维持8s，使精氨酸与衍生化试剂混合；精氨酸与衍生化试剂的摩尔比1:8。
[0077]直接加电压20kV维持10分钟进行分离测定。结果见图5。
[0078]经与同衍生化体系和分离系统检测得到D，L-精氨酸测定电泳图比较，图5中I为L-精氨酸衍生物峰；2为副产物峰；3为头孢拉定衍生物。表明L-精氨酸衍生物与头孢拉定及其杂质的衍生物以及反应副产物可以达到基线分离。
[0079]实施例5
[0080]1、操作条件及溶液配制
[0081]操作缓冲液:含70mmol/L SDS的硼酸盐缓冲液(12mmol/L硼砂溶液，必要时用硼酸或lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0)。
[0082]毛细管温度:20°C ;检测波长:340nm (参比波长:off)。[0083]取含精氨酸约IOmg的注射用头孢他啶适量，置IOml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0084]另取邻苯二甲醒28mg和L-青霉胺31mg,加乙醇Iml使溶解，加硼酸盐溶液(lOmmol/L硼砂溶液，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0)9ml，混匀，用lmol/L氢氧化钠溶液调节PH值至10.0,作为衍生化试剂溶液。
[0085]2、电泳中介微分析测定
[0086]取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2s,再取样品溶液在20mbar压力下进样
3.5s,最后取衍生化试剂溶液在20mbar压力下进样2s,每一次进样完毕、下次进样或加电压前，应先将毛细管进样端在水中浸一下；将毛细管两端插入含操作缓冲液的小瓶中，加电压IOkV并维持10s，使精氨酸与衍生化试剂混合；精氨酸与衍生化试剂的摩尔比1:4。
[0087]直接加电压20kV维持9分钟进行分离测定。结果见图6。
[0088]经与同衍生化体系和分离系统检测得到D，L-精氨酸测定电泳图比较，图6中I为L-精氨酸衍生物峰；2为副产物峰。表明L-精氨酸衍生物与头孢他啶及其杂质的衍生物以及反应副产物可以达到基线分离。
【权利要求】
1.一种手性分离药物制剂中精氨酸的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)将衍生化试剂的溶液进样至毛细管柱中，然后将药物样品溶液进样，再将衍生化试剂的溶液进样，之后将毛细管柱两端插入操作缓冲液中于电压IOkV下维持3s~IOs进行衍生化反应； 其中，所述的毛细管柱为未涂层弹性石英毛细管；所述的毛细管柱的温度为15°C~250C ;所述的衍生化试剂为邻苯二甲醛和N-酰基-巯基氨基酸类化合物；所述的药物样品溶液中精氨酸与衍生化试剂的摩尔比为(1:3)~(1:10);反应体系的pH值为9.5~10.5;所述的操作缓冲液为pH值9.0~9.4的含十二烷基硫酸钠的硼酸盐缓冲液；所述的十二烷基硫酸钠的浓度为60~75mmol/L ;所述的硼酸盐缓冲液的浓度为8~15mmol/L ； (2)在步骤(1)的衍生化反应后，在线进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定；所述的非手性毛细管胶束电动色谱分离测定的检测波长为330~350nm ； (3 )将步骤(2 )测定得到药物样品测定的电泳图，对照按照前述步骤(1)和(2 )将对照品D，L-精氨酸测定的电泳图，确定药物样品是否含有D-精氨酸和/或L-精氨酸。
2.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，所述的药物样品为注射用氨曲南、注射用盐酸头孢吡肟、注射用头孢拉定或注射用头孢他啶；所述的药物样品溶液为含精氨酸浓度lmg/ml的水溶液。
3.如权利要求1所述的电泳中介微分析方法，其特征在于，所述的衍生化试剂的溶液中邻苯二甲醒的浓度为2mg/ml~6mg/ml ;所述的邻苯二甲醒和N-酰基-巯基氨基酸类化合物的摩尔比为1:1。
4.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，所述的衍生化试剂的溶液配置为先将衍生化试剂加乙醇至溶解，lOmmol/L硼砂溶液至目标浓度，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5~10.5，较 佳的为10.0。
5.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，所述的药物样品溶液中精氨酸与衍生化试剂的摩尔比较佳的为(1:4)~(1:8)。
6.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，所述的N-酰基-巯基氨基酸类化合物为N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸甲酯、N-乙酰基-D-半胱氨酸甲酯、N-(叔丁氧基羰基)-L-半胱氨酸甲酯、N-异丁酰基_L_半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸、L-青霉胺、D-青霉胺、或者N-乙酰基-D-青霉胺。
7.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，所述的操作缓冲液中，硼酸盐缓冲液的PH值为9.2 ;硼酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L ;十二烷基硫酸钠的浓度为6 Smmol /I, η
8.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的反应体系的pH值为10.0 ;所述的衍生化试剂的溶液在20mbar压力下进样2s~3s至毛细管柱中，然后将药物样品溶液在20mbar压力下进样2s~3.5s，再将衍生化试剂的溶液在20mbar压力下进样2s~3s ;所述的衍生化反应的操作较佳的为毛细管柱两端插入操作缓冲液中于电压IOkV下维持5s进行衍生化反应。
9.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的进样完毕、或加电压衍生化反应之前均将毛细管柱两端在水中浸一下。
10.如权利要求1所述的电泳中介微分析测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的在线进行非手性毛细管胶束电动色谱分离测定中分离时的条件为以20kV维持6min~lOmin，较佳的为7min。·
【文档编号】G01N27/447GK103852511SQ201210500630
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月29日 优先权日:2012年11月29日
【发明者】刘浩, 徐伟东, 潘颖, 杨美成 申请人:上海市食品药品检验所, 上海新亚药业有限公司