一种高通量蛋白质样品预处理装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种高通量蛋白质样品预处理装置，是一种集蛋白质在线变性和还原、除盐以及在线酶解的系统，包括：高温变性和还原器，溶剂置换器以及酶反应器。蛋白样品首先通过高温变性和还原器实现在线、快速变性和还原，然后再通过溶剂置换器将变性剂和还原剂去除，最后通过酶反应器在线酶解，酶解产生的肽段可以通过质谱进行检测。本发明的优点是将蛋白质的复杂样品预处理过程进行了集成化。这种方法可以省去离线分析方法复杂的样品处理步骤，大大缩短了样品预处理时间，减少了样品在离线处理过程中可能引入的样品丢失和污染等问题，提高整个分析通量。此外，该系统与分离鉴定平台也显示出良好的兼容性，因此，在蛋白组研究中具有较好的实用性。
【专利说明】 一种高通量蛋白质样品预处理装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高通量蛋白质样品预处理装置，是一种集蛋白质变性和还原、除盐以及蛋白质酶解的样品预处理系统。
【背景技术】
[0002]随着人类基因组全序列测定的完成，人类基因的注释与功能确认已成为生命科学面临的最重要任务之一。生命活动的功能执行体是蛋白质。对蛋白质进行深入系统的研究不仅可以全景式地揭示生命活动的本质，而且有些关键蛋白质也是研究疾病机理和预防诊治药物等的直接靶体库。因此，蛋白质研究已成为新世纪最大的战略资源之一，是国际生物科技的战略制高点和竞争焦点。
[0003]凝胶电泳由于具有极高的分辨率和灵敏度，是目前最受生物学家关注的规模化蛋白质组分析方法。但是，该技术对于强酸性或强碱性蛋白质、分子量极大或极小的蛋白质、膜蛋白等都无法进行有效分析。基于多维液相色谱-质谱(“鸟枪法”)的蛋白质分析方法具有较好的重现性，已经成为目前常用的蛋白质组学分析技术。然而，无论是进行蛋白质的定性还是进行定量分析、或者是翻译后修饰分析，都需要对蛋白质进行离线变性、还原、烷基化、除盐以及酶解，另外蛋白质定量还需要进行离线的同位素标记。这些步骤都采用离线处理的方法，不仅花费时间长，而且存在着样品污染、丢失的可能性，严重影响了规模化蛋白质分析的结果。因此发展在线的样品预处理方法和装置具有非常重要的意义。
[0004]针对传统样品预处理方法存在的问题，我们发展了一种集蛋白变性、还原、除盐以及在线酶解的样品预处理系统。该系统可以实现高通量、低损失的蛋白质样品预处理，在蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种集蛋白质变性、还原、除盐以及在线酶解于一体的样品预处理系统。该系统可以直接处理细胞、组织提取蛋白和分泌蛋白，不需要复杂和繁琐的手工操作，同时整个处理过程保持高度的连续性和高通量性。
[0006]为了实现该目的，本发明的技术方案是:
[0007]1、采用高温变性和还原器对蛋白质样品进行在线、不可逆以及快速的变性，变性剂可采用高浓度的盐酸胍和尿素。
[0008]2、采用溶剂置换器去除变性后蛋白质溶液中残存的高浓度变性剂和还原剂，以确保后续高效的酶解反应，采用的交换液为低浓度弱碱性缓冲溶液。
[0009]3、酶反应器采用柱形式的酶反应器，酶活高，同时耐压性好，采用的固载材料为有机基质的整体材料、有机-无机的整体材料、有机基质的颗粒材料。固载的酶为胰蛋白酶。
[0010]4、酶解产生的多肽可以通过质谱直接检测或通过液质联用系统进行分析。
[0011]一种高通量蛋白质样品预处理装置，包括:依次串连的高温变性和还原器，溶剂置换器以及酶反应器；[0012]所述高温变性和还原器包括管状中空纤维膜、变性和还原反应腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于变性和还原反应腔体中，中空纤维膜两端穿过变性和还原反应腔体侧壁面伸出腔体外，于变性和还原反应腔体上设有物料进口和出口 ；
[0013]所述溶剂置换器包括管状中空纤维膜、缓冲液置换腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于缓冲液置换腔体中，中空纤维膜两端穿过缓冲液置换腔体侧壁面伸出腔体外，于缓冲液置换腔体上设有物料进口和出口 ；
[0014]高温变性和还原器上的中空纤维膜的物料流出端与溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流入端相连通；
[0015]所述酶反应器由柱温箱和酶柱组成，酶柱被放置于柱温箱中，溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流出端与酶柱的物料入口相连，产物由酶柱的物料出口流出，蛋白质通过酶柱被迅速切割成多肽，实现蛋白质到多肽的快速转化。
[0016]所述高温变性和还原器由中空纤维膜，变性和还原反应腔体，温控系统以及溶剂输送系统组成，以中空纤维膜为蛋白质传输载体，并固定于变性和还原反应腔体中，通过溶剂输送系统将高浓度变性剂和还原剂输送至变性和还原反应腔体，并与蛋白质充分混合，在温控系统作用下加热并完成变性还原反应；
[0017]所述温控系统由数显控温器，保温石英棉、加热套以及内衬加热管组成，其中内衬加热管被置于加热套内，加热套被保温石英棉包裹，以防止热量扩散，加热温度通过热电偶传输至数显控温器，并实时控制。
[0018]所述溶剂输送系统溶剂输送系统为液相色谱泵或蠕动泵，
[0019]其物料入口与溶剂储存罐相连，其物料出口与变性和还原反应腔体上设有物料进口相连；变性和还原反应腔体上设有物料出口与溶剂收集容器相连。
[0020]液相色谱泵或蠕动泵的流量范围0.lmL/min-5mL/min，温控装置的加热温度范围25-100。。；
[0021]变性和还原反应腔体的制作材料可以为石英管或耐高温的玻璃管，内径尺寸为5-15mm ；
[0022]溶剂为20_50mM碳酸氢铵，变性剂的种类可以为盐酸胍或尿素，浓度为4_8M。
[0023]所述溶剂置换器由中空纤维膜，缓冲液置换腔体以及强制对流系统组成，以中空纤维膜为蛋白质传输载体，并固定于缓冲液置换腔体中，通过强制对流系统将低浓度弱碱性缓冲溶液输送至缓冲液置换腔体，使蛋白质溶剂与交换液发生置换，从而达到蛋白质除盐的目的；
[0024]所述强制对流系统由输液泵或蠕动泵、储液罐和连接管线组成，其物料入口通过连接管线与溶剂储存罐相连，其物料出口与溶剂交换器腔体上设有物料进口相连；溶剂置换器腔体上设有物料出口与溶剂收集容器相连。
[0025]缓冲液置换腔体的制作材料可以为聚四氟管或玻璃管，内径尺寸2-10mm ;强制对流系统采用的缓冲溶液可以为碳酸氢铵或醋酸铵溶液，浓度范围IO-1OOmM, pH范围为
7.5~8.5。
[0026]制备酶反应器的基质材料为有机基质的整体材料、有机-无机杂化的整体材料或有机基质的颗粒材料；蛋白酶通过共价键合或物理吸附的方式，固定在材料表面，所述酶为胰蛋白酶，酶液浓度范围为1-lOmg/mL ；[0027]柱温箱的控温范围可以为25_40°C。
[0028]采用所述预处理装置将蛋白质变性和还原、除盐以及蛋白质酶解的样品预处理过程集成化；
[0029]具体过程如下:蛋白质样品被注射进入高温变性和还原器(A)中，在高温变性和化学还原的同时作用下，蛋白质二级结构被彻底破坏，蛋白质链舒展，二硫键断裂，为后续的蛋白质完全酶解提供前提；变性后的蛋白质样品通入溶剂置换器，在强制对流作用力下，高浓度的变性剂和还原剂得以去除，为后续的蛋白质酶解提供有利条件；最后蛋白质样品通过固定酶反应器，实现在线酶解，酶解产生的肽段通过质谱或液质联用平台进行分离检测。
[0030]本发明具有如下优点:
[0031]1、样品手工操作步骤减少，从而样品损失、污染的可能性也将降低。
[0032]2、由于不需要离线酶解，系统的分析通量大大提高；
[0033]3、系统集成化、自动化程度高；
[0034]4、可以与分离鉴定技术在线联用，为实现高通量的蛋白质分析提供技术支撑。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1、样品预处理系统装置图，包括高温变性和还原器(A)，溶剂置换器(B)以及酶反应器(C);其中(I):反应腔体；(2):中空纤维膜；(3)变性剂与还原剂入口 ；(4):变性剂与还原剂出口 ；(5)温控装置；(6)置换腔体；(7)弱碱性缓冲溶液入口 ；(8)弱碱性缓冲溶液出口 ；(9):酶反应器。
[0036]图2、样品预处理装置处理肌红蛋白的质谱图，a:活性肌红蛋白；b:变性和还原后的肌红蛋白；c:除盐后的肌红蛋白；d:肌红蛋白酶解产物；e:肌红蛋白酶解产物中的蛋白质残留检测。
[0037]图3、样品预处理装置与液质联用系统分析人血清低丰度蛋白质，a:抗体柱分离人血清高、低丰度蛋白质的色谱图；b:经样品预处理装置后，酶解产物的液相色谱-质谱图。
【具体实施方式】
[0038]实施例1
[0039]如图1所示，该样品预处理装置由高温变性和还原器A，溶剂置换器B以及酶反应器C组成。
[0040]所述高温变性和还原器包括管状中空纤维膜、变性和还原反应腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于变性和还原反应腔体中，中空纤维膜两端穿过变性和还原反应腔体侧壁面伸出腔体外，于变性和还原反应腔体上设有物料进口和出口 ；
[0041]所述溶剂置换器包括管状中空纤维膜、缓冲液置换腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于缓冲液置换腔体中，中空纤维膜两端穿过缓冲液置换腔体侧壁面伸出腔体外，于缓冲液置换腔体上设有物料进口和出口 ；
[0042]高温变性和还原器上的中空纤维膜的物料流出端与溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流入端相连通；[0043]所述酶反应器由柱温箱和酶柱组成，酶柱被放置于柱温箱中，溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流出端与酶柱的物料入口相连，产物由酶柱的物料出口流出，蛋白质通过酶柱被迅速切割成多肽，实现蛋白质到多肽的快速转化。
[0044]所述高温变性和还原器由中空纤维膜，变性和还原反应腔体，温控系统以及溶剂输送系统组成，以中空纤维膜为蛋白质传输载体，并固定于变性和还原反应腔体中，通过溶剂输送系统将高浓度变性剂和还原剂输送至变性和还原反应腔体，并与蛋白质充分混合，在温控系统作用下加热并完成变性还原反应；
[0045]所述温控系统由数显控温器，保温石英棉、加热套以及内衬加热管组成，其中内衬加热管被置于加热套内，加热套被保温石英棉包裹，以防止热量扩散，加热温度通过热电偶传输至数显控温器，并实时控制。
[0046]所述溶剂输送系统溶剂输送系统为液相色谱泵或蠕动泵，
[0047]其物料入口与溶剂储存罐相连，其物料出口与变性和还原反应腔体上设有物料进口相连；变性和还原反应腔体上设有物料出口与溶剂收集容器相连。
[0048]以0.lmg/mL肌红蛋白为样品(如图2a所示)考察整个样品预处理过程的连续性。首先以2μ L/min将肌红蛋白推入高温变性和还原器中，其中温度为90°C，变性和还原剂为6M盐酸胍和50mM二硫苏糖醇(如图2b所示);变性后的蛋白质样品通入溶剂置换器，交换液为50mM碳酸氢铵(pH 8.0),在强制对流作用力下，高浓度的变性剂和还原剂得以去除(如图2c所示);最后蛋白质样品通过有机-无机杂化基质固定酶反应器(0.25mm 1.dX50mm),在室温下实现在线酶解，酶解产生的肽段通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱进行检测(如图2d所示)，从图中可以看出肌红蛋白完全转化成肽段(如图2e所示)。
[0049]将该装置与微柱液相色谱-质谱系统在线联用，分析人血清低丰度蛋白质组分。操作步骤如下:人血清样品首先通过抗体柱去除高丰度蛋白质(如图3a所示)，收集的低丰度蛋白质组分通入该装置(操作过程同实施例1)，酶解产生的多肽通过C18预柱捕集，然后进行液质分析，如图3b所示。
【权利要求】
1.一种高通量蛋白质样品预处理装置，包括:依次串连的高温变性和还原器(A)，溶剂置换器(B)以及酶反应器(C); 其特征在于: 所述高温变性和还原器包括管状中空纤维膜、变性和还原反应腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于变性和还原反应腔体中，中空纤维膜两端穿过变性和还原反应腔体侧壁面伸出腔体外，于变性和还原反应腔体上设有物料进口和出口 ； 所述溶剂置换器包括管状中空纤维膜、缓冲液置换腔体；以中空纤维膜为蛋白质传输载体，中空纤维膜固定于缓冲液置换腔体中，中空纤维膜两端穿过缓冲液置换腔体侧壁面伸出腔体外，于缓冲液置换腔体上设有物料进口和出口 ； 高温变性和还原器上的中空纤维膜的物料流出端与溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流入端相连通； 所述酶反应器由柱温箱和酶柱组成，酶柱被放置于柱温箱中，溶剂置换器上的中空纤维膜的物料流出端与酶柱的物料入口相连，产物由酶柱的物料出口流出，蛋白质通过酶柱被迅速切割成多肽，实现蛋白质到多肽的快速转化。
2.按照权利要求1所述的预处理装置，其特征在于: 所述高温变性和还原器由中空纤维膜，变性和还原反应腔体，温控系统以及溶剂输送系统组成，以中空纤维膜为蛋白质传输载体，并固定于变性和还原反应腔体中，通过溶剂输送系统将高浓度变性剂和还原剂输送至变性和还原反应腔体，并与蛋白质充分混合，在温控系统作用下加热并完成变性还原反应； 所述温控系统由数显控温器,保温石英棉、加热套以及内衬加热管组成,其中内衬加热管被置于加热套内，加热套被保温石英棉包裹，以防止热量扩散，加热温度通过热电偶传输至数显控温器，并实时控制； 所述溶剂输送系统溶剂输送系统为液相色谱泵或蠕动泵， 其物料入口与溶剂储存罐相连，其物料出口与变性和还原反应腔体上设有物料进口相连；变性和还原反应腔体上设有物料出口与溶剂收集容器相连。
3.按照权利要求2所述的预处理装置，其特征在于: 液相色谱泵或蠕动泵的流量范围0.lmL/min-5mL/min,温控装置的加热温度范围25-100。。； 变性和还原反应腔体的制作材料可以为石英管或耐高温的玻璃管，内径尺寸为5-15mm ； 溶剂为20-50mM碳酸氢铵,变性剂的种类可以为盐酸胍或尿素,浓度为4-8M。
4.按照权利要求1所述的预处理装置，其特征在于: 所述溶剂置换器由中空纤维膜，缓冲液置换腔体以及强制对流系统组成，以中空纤维膜为蛋白质传输载体，并固定于缓冲液置换腔体中，通过强制对流系统将低浓度弱碱性缓冲溶液输送至缓冲液置换腔体，使蛋白质溶剂与交换液发生置换，从而达到蛋白质除盐的目的； 所述强制对流系统由输液泵或蠕动泵、储液罐和连接管线组成，其物料入口通过连接管线与溶剂储存罐相连，其物料出口与溶剂交换器腔体上设有物料进口相连；溶剂置换器腔体上设有物料出口与溶剂收集容器相连。
5.按照权利要求4所述的预处理装置，其特征在于: 缓冲液置换腔体的制作材料可以为聚四氟管或玻璃管，内径尺寸2-10_ ;强制对流系统采用的缓冲溶液可以为碳酸氢铵或醋酸铵溶液，浓度范围IO-1OOmM, pH范围为7.5-8.5。
6.按照权利要求1所述的预处理装置，其特征在于: 制备酶反应器的基质材料为有机基质的整体材料、有机-无机杂化的整体材料或有机基质的颗粒材料；蛋白酶通过共价键合或物理吸附的方式，固定在材料表面，所述酶为胰蛋白酶，酶液浓度范围为1-lOmg/mL ； 柱温箱的控温范围可以为25-40°C。
7.—种权利要求1所述预处理装置的应用，其特征在于: 采用权利要求1所述预处理装置将蛋白质变性和还原、除盐以及蛋白质酶解的样品预处理过程集成化； 具体过程如下:蛋白质样品被注射进入高温变性和还原器(A)中，在高温变性和化学还原的同时作用下，蛋白质二级结构被彻底破坏，蛋白质链舒展，二硫键断裂，为后续的蛋白质完全酶解提供前提；变性后的蛋白质样品通入溶剂置换器(B)，在强制对流作用力下，高浓度的变性剂和还原剂得以去除，为后续的蛋白质酶解提供有利条件；最后蛋白质样品通过固定酶反应器(C)，实现在线酶解，酶解产生的肽段通过质谱或液质联用平台进行分离检测。·
【文档编号】G01N30/06GK103852527SQ201210517241
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】张丽华, 袁辉明, 戴忠鹏, 蒋好, 杨开广, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所