基于压电扫描的微悬臂梁阵列生化传感装置及方法
【专利摘要】本发明涉及一种微悬臂梁阵列生化传感的装置，其包括反应池、微梁阵列、半导体激光器、压电偏转器、信号发生器、光电位置敏感探测器(PSD)、和数据处理设备。本发明的装置利用压电陶瓷管驱动固定在其上的凸透镜偏转，实现了单一汇聚激光束对微梁阵列的扫描探测，可以实现对微梁阵列上生化反应信息的高灵敏度、快速、并行检测，可应用于食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域中的监控和检测。本发明还公开了利用微悬臂梁阵列生化传感装置的生化检测方法。
【专利说明】基于压电扫描的微悬臂梁阵列生化传感装置及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化传感【技术领域】，具体地涉及一种微悬臂梁阵列生化传感装置及方法，该装置和方法可应用于食品安全、环境污染、生物医学、科学研究和生产制造等领域中的监控和检测。
【背景技术】
[0002]基于表面应力检测的微悬臂梁(以后均称微梁)生化传感技术是近年出现的一种新兴传感技术，其原理是:把探针(抗原或抗体)分子用直接或间接的方式固定(修饰)到微梁一侧的镀金层上，当被检测样品液中的靶分子与微梁金表面上的探针分子发生特异性反应时，会使微梁表面应力改变，从而导致微梁弯曲变形，通过光学或电学方法检测这种变形的过程，可得到生化反应的实时信息。与传统的免疫传感方法相比，该方法无需使用任何酶标、荧光物质和放射性作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，灵敏度高(比酶联免疫试验高数倍)，还可以通过监测微梁变形来实时、定量的监测抗原抗体的反应过程，得到更丰富的免疫生化反应的信息。经过这些年的发展，微梁传感被作为一种新兴技术，在生物工程和环境污染监测技术等方面与传统的方法进行对比研究，如RNA转录因子、酶、汞排放及挥发性化合物等，由于微悬臂梁的厚度尺寸仅为亚微米量级，对微梁表面生化反应(比如，修饰的探针分子与靶分子结合)导致的应力变化极为敏感，使其检测极限达到纳克甚至亚纳克级每毫升，优于常规的酶联免疫方法。
[0003]在单微悬臂梁检测系统基础上，为进一步消除环境温漂、溶液折射率变化等背景噪声影响、实现多种靶标分子的快速并行检测，微梁传感技术正逐步向多阵列发展。已报道实现微梁阵列传感研究的方法主要有:(I)利用垂直共振腔面射型激光器提供时序阵列光源，对微梁阵列进行逐一照射，再利用光电位置敏感探测器(PSD)对各微梁的偏转信号进行接收检测；(2)利用扩束后的面光源照射微梁阵列，用CCD记录二维微梁阵列变形前后的图像进行微梁的变形检测。但由于垂直共振腔面射型激光器发射光束的相邻距离不能调节，它只能针对间距一定的微梁阵列进行照射，灵活性较低且价格也很昂贵；CCD面光源检测法中，由于微梁尖端的弯曲会使图像产生弥散，严重影响光斑位移的检测质量，导致其检测灵敏度不高，且多通道检测时速度也较慢。
[0004]如何利用简单光路设计出方便实用的传感系统，实现微梁阵列高灵敏度、快速、并行的变形检测，研制出微梁阵列免疫传感装置，并利用阵列免疫传感器进行抗体亲和常数测定以及应用于食品安全中多残留和多种重金属离子并行实时原位检测，一直是生化检测领域关注的焦点。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中存在的上述问题，做出了本发明。
[0006]本发明的原理是利用压电偏转器驱使激光器发射出来的激光束产生周期性偏转，以扫描微梁阵列；再通过光杠杆原理将微梁阵列中各微梁的弯曲变形信号放大，用光电位置敏感探测器(PSD)时序接收检测，从而实时监测各微梁上的生化反应过程信息。
[0007]因此，在第一个方面，本发明提供了一种基于压电扫描的微悬臂梁阵列生化传感装置(下面有时简称为“本发明的装置”)，该装置包括:
[0008]反应池，所述反应池用于容纳缓冲液和待测样品；
[0009]微梁阵列，所述微梁阵列由两个以上平行间隔排列的微梁组成并被可拆卸地固定在密闭的反应池中，其中所述每个微梁上固定有检测生物分子或对照分子(在本发明中也称为“参考分子”，固定或修饰有参考分子的微梁也称为“参考梁”);
[0010]半导体激光器，所述半导体激光器被配置成向压电偏转器的凸透镜发射激光束；
[0011]压电偏转器，所述压电偏转器包括压电陶瓷管和凸透镜，所述凸透镜设置在所处半导体激光器与所述压电陶瓷管之间，其中所述压电陶瓷管被设置成驱动所述凸透镜产生偏转，使得通过所述凸透镜的由所述半导体激光器发射的激光束的光路也相应地发生变化；
[0012]反光镜，所述反光镜将来自所述压电偏转器的激光束改变光路后扫射到所述每个微梁上；
[0013]信号发生器，所述信号发生器控制所述压电陶瓷管的输入电压大小和变化周期；
[0014]光电位置敏感探测器(PSD)，所述光电位置敏感探测器接收由所述微梁阵列反射的激光光点，从而产生并输出关于每个微梁的位移信号；和
[0015]数据处理设备，所述数据处理设备处理由所述光电位置敏感探测器输出的每个微梁的位移信号，基于固定有对照分子的微梁的位移数据关于获得固定有检测生物分子的每个微梁弯曲的数据，
[0016]其中当待测样品中含有与所述检测生物分子特异性结合的靶分子时，固定有所述检测生物分子的微梁与所述待测样品在反应池中在适于两者的反应条件下反应后会发生弯曲。
[0017]在一个优选的实施方案中，本发明的装置还可以包括设置与所述反应池可操作连接的加热片和与所述加热片电连接的温控器，所述温控器控制加热片的温度以调节所述反应池中的温度从而适于所述检测生物分子和所述靶分子在所述反应池中发生反应。所述反应可以是受体配体结合作用、抗原抗体反应或分子缔合反应中的任一种。
[0018]在另一个优选的实施方案中，本发明的装置还可以包括模拟/数字信号转换器，所述模拟/数字信号转换器将所述关于每个微梁的位移信号转换成数字信号，所述数字信号输出至所述数据处理装置进行处理，以获得所述微梁弯曲数据。
[0019]在另一个优选的实施方案中，信号发生器可以通过控制所述压电陶瓷管的输入电压大小和变化周期从而控制所述凸透镜的偏转幅度和周期以改变所述激光束的光束，使得所述激光束扫描各个微梁的时序相应地发生变化，从而能够扫描所述微梁阵列中以不同间距间隔的每个微梁。
[0020]在第二个方面，本发明提供了一种使用本发明的装置检测待测样品中的靶分子的方法(下面有时简称为“本发明的方法”)，所述方法包括以下步骤:
[0021](I)将与能够所述靶分子特异性结合的检测生物分子和对照分子分别固定至微梁阵列中的不同微梁上，每个微梁上固定一种分子；
[0022](2)将步骤(I)中获得的微梁相间隔地平行固定在反应池中，并在反应池中注入缓冲液，并使缓冲液在反应池中流动；
[0023](3)启动半导体激光器发射激光束；
[0024](4)通过信号发生器控制压电偏转器，使其偏转由所述半导体激光器发射的激光束的光路，从而使激光束能够扫描所述微梁阵列中以不同间距间隔的每个微梁；
[0025](5)通过光电位置敏感探测器接收由所述微梁阵列反射的激光光点，从而产生并输出关于每个微梁的位移信号；
[0026](6)所述数据处理设备接收并处理由所述光电位置敏感探测器输出的每个微梁的位移信号，基于固定有对照分子的微梁的位移数据关于获得固定有检测生物分子的每个微梁弯曲(当待测样品中含有与所述检测生物分子特异性结合的靶分子时，固定有所述检测生物分子的微梁与所述待测样品在反应池中在适于两者的反应条件下反应后会发生弯曲)的数据；
[0027](7)根据预设的弯曲量阈值判断所述待测样品中是否包含所述靶分子。
[0028]在本发明的方法中，可以通过操作温控器控制加热片的温度以调节所述反应池中的温度从而适于所述检测生物分子和所述靶分子在所述反应池中发生反应。所述反应可以是受体配体结合作用、抗原抗体反应或分子缔合反应中的任一种。
[0029]在本发明的方法的一个优选实施方案中，信号发生器可以按照使用者的设定控制所述压电陶瓷管的输入电压和变化周期，从而控制所述凸透镜按照预设的与设定的输入电压和变化周期对应的幅度和周期偏转以改变所述激光束的光束，使得所述激光束扫描各个微梁的时序相应地发生变化，从而能够扫描所述微梁阵列中以不同间距间隔的每个微梁。
[0030]在本发明的方法的另一个优选实施方案中，在步骤(I)中，微梁阵列可以通过毛细管阵列以套合方式分别用所述检测生物分子和所述对照分子间隔地修饰各个微梁。
[0031]在本发明(包括装置和方法)中，对照分子包括至少一种阳性对照分子或至少一种空白对照分子，或至少一种阳性对照分子和至少一种空白分子的组合。
[0032]在本发明中，靶分子可以是受体或配体，检测生物分子为能与所述受体或配体特异性结合的配体或受体。靶分子还可以是抗原分子，检测生物分子为所述抗原分子的特异性抗体或抗体片段，所述特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
[0033]在本发明的优选实施方案中，所述抗体片段可以是抗体的Fab、Fab’片段或F(ab，)2 片段。
[0034]在具体实施本发明的装置和方法时，在实践中，一般当微悬臂梁的弯曲位移量达到IOnm及以上时，就可以判定检测结果呈阳性。
[0035]本发明的有益效果
[0036]本发明利用压电陶瓷管(PZT)驱动凸透镜偏转，实现了单一汇聚激光束对微梁阵列的扫描探测，可以实现对微梁阵列上生化反应信息的高灵敏度、快速、并行检测。
[0037]本发明相对于现有的微梁阵列生化传感方法和装置，其优点有:
[0038](I)探测光路结构简单，容易实现；
[0039](2)扫描驱动部件使用的是压电陶瓷管，光束发射装置只需一个小半导体激光器，成本较低；
[0040](3)扫描步进量可以任意调节，对各种间距的微梁阵列都能方便快捷的进行定位探测；[0041](4)使用同一激光器扫描，保证了微梁阵列各根微梁上照射光源的一致性；
[0042](5)利用这种方法集成的微梁阵列生化传感器体积小重量轻，移动方便。
[0043](6)利用毛细管阵列套合修饰装置将生化分子修饰到微梁阵列上的效率较已有的生化点样仪操作更方便、效率更高，且成本更低。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0045]图1是基于压电扫描的微梁阵列生化传感装置的整体设计示意图。
[0046]图2是压电驱动激光束扫描微梁阵列的原理图。
[0047]图3是凸透镜偏转驱使激光束扫描的原理图。
[0048]图4是毛细管阵列套合修饰平台的示意图，其中图4(a)是整体示意图，图4(b)是毛细管阵列间隔套合修饰微梁阵列的放大示意图。
[0049]图5是实验用微梁阵列的照片。
[0050]图6是微梁阵列基底上间隔250μπι两点处的扫描位移曲线图，其中:(a)X方向和(b) Y方向。
[0051]图7是两个微梁上的光点扫描信号的示意图。
[0052]图8是在温度激励下两个微梁的位移曲线图。
[0053]图9是利用毛细管修饰CLEN抗体到微梁阵列上的照片。
[0054]图10显示利用微梁阵列检测CLEN抗原抗体的特异性结合。
[0055]图11是生化反应池结构的示意图。
【具体实施方式】
[0056]定义
[0057]检测生物分子:在本发明中，检测生物分子是指能够与在待测样品中可能存在的被研究的目标分子特异性结合的生物分子。该检测生物分子包括但不限于抗原、抗体、受体或配体等，其类型可以是蛋白质、核酸或糖类等生物大分子。
[0058]靶分子:在本发明中，靶分子即被研究的目标分子，其是能够与检测生物分子特异性结合的生物分子，其包括但不限于抗原、抗体、受体或配体等，其类型可以是蛋白质、核酸或糖类等生物大分子。
[0059]抗体:抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
[0060]半抗体片段:通过二硫键还原剂将全抗体拆分成各自带有巯基的对称的片段，每个半抗体片段包含一条完整的轻链和一条完整重链以及Fe片段。
[0061]F(ab’)2:1g (immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在铰链区重链间二硫键近C处切断，形成一个双价抗原结合片段简称F(ab’)2片段和一些小片段pFc'。由于F(ab’)2片段保留了结合相应抗原的生物学活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被广泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破伤风抗霉素，经胃蛋白酶水解后，因去掉了 Fe片段的抗原性而减少了超敏反应的发生。pFc'片段最终被降解，无生物学活性。
[0062]Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在铰链区重链间二硫键近N端处切断，形成两个相同的单价抗原结合片段简称Fab段(如图1中所示)，一个可结晶的片段简称 Fe (fragment crystallizable)段。
[0063]Fab’:是带巯基的单价抗原结合片段(F(ab’)2被二硫键还原剂拆分的各自带有巯基的片段)。
[0064]抗原结合位点:抗体分子与抗原相结合的部位，由Ig轻、重链的⑶R1、⑶R2和CDR3组成。
[0065]抗原:是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。根据抗原性质分为两类:完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一类既有免疫原性，又有免疫反应性的物质。如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，故又称不完全抗原。
[0066]巯基化试剂:具有巯基的能连接抗体与金的双功能交联试剂。
[0067]二硫键还原剂:二硫键又称S-S键，是2个SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。在巯基乙胺(2-MEA)、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等的硫化合物存在下能与之发生作用，还原成巯基(-SH)。这些硫化物就是本发明中所说的二硫键还原剂。在微量的二硫键还原剂存在的情况下抗体的重链间的二硫键被还原而其它的二硫键不被破坏。
[0068]微悬臂梁(微梁):典型的微悬臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微悬臂梁(Veeco Instruments)(尺寸:长200um,腿宽20um,厚0.6um)，单侧镀有60nm的金；抗体通常通过巯基化试剂的巯基(-SH)与金的共价结合以及巯基化试剂的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基团)与抗体结合来固定到微梁表面。
[0069]基于表面应力检测的微悬臂梁传感系统:微悬臂梁传感系统主要由激光器、微悬臂梁、光电位置敏感器(PSD)、温度控制系统、蠕动泵、以及数据分析处理装置组成。典型的微悬臂梁免疫检测方法的步骤如下:将微悬臂梁固定到反应池中，以蠕动泵控制流动缓冲液通过反应池，待反应池中气泡排净后以0.lmL/min的速度流动缓冲液通过反应池。反应池的温度控制在37 ± 0.0I °C，室温控制在27±0.01°C。激光器发出一束激光照射在微悬臂梁的尖端，经微悬臂梁反射后照在PSD的靶面上。当微悬臂梁的位移信号稳定后，加入缓冲液稀释的样品溶液，PSD实时记录微悬臂梁的尖端位移。
[0070]时序接收:激光器发出的激光束经偏转反射后，顺序射向微悬臂梁阵列上的1、
2......η号微悬臂梁，1、2......η号微悬臂梁再依次将照射来的激光束反射向PSD靶面，
由PSD记录各激光点位置。
[0071]具体实施方案
[0072]在本发明的装置和方法中，利用的生化反应可以是受体配体结合作用、抗原抗体反应或分子缔合反应中的任一种，优选本领域中常用的抗原抗体反应。
[0073]当采用抗原抗体反应时，采用的抗体是与检测生物分子特异性结合的抗体，可以是多克隆抗体或单克隆抗体，其可以通过本领域中已知的任何方法制备，包括但不限于免疫法、杂交瘤法、化学合成法、基因工程法等。所述抗体还可以是基因工程修饰的杂合抗体，诸如人源化抗体，骆驼源化抗体等针对某种哺乳动物改造的抗体，例如人-鼠杂合抗体等。
[0074]本发明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是本领域中所知晓的任何类型的抗原。[0075]本发明中提到的待测样品可以是生物样品，例如来自于哺乳动物尤其是人的样品，包括组织样品(如病理组织切片、活检、毛发、拭子等)、细胞样品(如细胞涂片、血液涂片等)、体液样品(如血液、尿液、脑脊液、唾液等)、排泄物(例如呕吐物、汗液、粪便等)。所述待测样品还可以是环境样品，诸如土壤样品、水样、浮尘等；其他生产领域中获得的样品，诸如污水样品、食品样品等。
[0076]在本发明中使用的微梁可以根据本领域中的公知方法自行制备，也可以购买市售商品，对此在本发明中并无任何限制。
[0077]作为在微梁上修饰或固定检测生物分子的方法，在本发明中对此没有任何限制，可以采用本领域中任何已知的方法。
[0078]当使用抗体或抗体片段作为检测生物分子时，优选使用抗体片段，所述抗体片段可以是抗体的Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
[0079]作为在微梁上修饰抗体或抗体片段的方法的实例，可以先利用巯基化试剂自带的巯基自组装至微悬臂梁的镀金表面上，然后将抗体或抗体片段(例如，Fab、Fab’片段)与巯基化试剂结合；可以先将抗体或抗体片段(例如，Fab、Fab’片段)与巯基化试剂联结在一起，然后利用巯基化试剂自带的巯基自组装至微梁的镀金表面上；还可以用二硫键还原剂将抗体裂解成两个半抗原片段，然后利用半抗原片段自身的巯基自组装至镀金表面上；也可以先用胃蛋白酶将抗体水解成F(ab’)2片段，然后用二硫键还原剂将F(ab’)2片段还原成两个Fab’片段，再利用每个Fab’片段的巯基自组装至微梁的镀金表面上。
[0080]本发明中使用的二硫键还原剂的实例包括巯基乙胺(2-MEA)、2_巯基乙醇、二硫苏糖醇等。使用二硫键还原剂还原二硫键从而拆分抗体的方法和条件是本领域中公知的，例如，可以根据靶抗原的类型、大小和性质等，遵照本领域中的已知方法或市售的相关试剂盒的说明书来选择具体的二硫键还原剂和浓度、抗体浓度，两者的用量和质量比，温育条件和温育时间等。
[0081]在本发明中使用的巯基化试剂不受限制，只要其可以与抗体的Fab片段联结，并且可以被固定在微梁的镀金层上。
[0082]本发明中使用的巯基化试剂包含巯基官能团和羧基或氨基官能团，其中该试剂一端的巯基用于通过自组装固定在金表面上，另一端的羧基或氨基(也可以通过活化被暴露)用于与抗体的氨基或羧基末端发生反应。本发明可用的巯基化试剂包括硫醇类化合物，例如11-羧酸硫醇，2-氨基乙硫醇(AET)和3-巯基丙酸(MPA);盐酸硫醇亚胺；磺基烃基琥珀酰亚胺基-6-(3’ 2-吡啶二硫-丙酰胺)_乙酸酯(Sulf0-LC-SroP);和3，3’ - 二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)等。
[0083]下面结合附图详细地说明本发明。
[0084]图1中图示了基于压电扫描的微梁阵列生化传感装置的整体设计示意图。在图1中，半导体激光器(例如，直径8mm，长40mm，汇聚激光点焦距可调)发出激光束，经过压电偏转器后产生扫射，经反光镜改变光路照射到固定在密闭生化反应池中的微梁上，池中环境温度由温控器通过加热片控制。接着再用光电位置敏感探测器(PSD)接收由微梁反射的激光光点位置信号，通过A/D转换输入计算机，就可以实现微梁阵列信号的弯曲检测，从而得到各梁上对应生化反应信息。
[0085]图2至图3是本发明的基于压电驱动激光束扫描微梁阵列的原理图。在图2中图不了总体过程，利用压电陶瓷管(例如，长30mm、外径6.35mm、内径5.35mm,最大输入电压±200V，偏转幅度±16μπι)驱动凸透镜产生偏转，使经过凸透镜的激光束(扫描范围为Imm)随之周期性扫射微梁阵列，再利用PSD接收经微梁阵列反射的激光束，采集各根微梁的位移偏转信号。图3中图示了凸透镜偏转驱使激光束扫描的原理图，当压电陶瓷管由于输入电压值的变化产生偏转时，固定在其上的凸透镜(焦距IOcm)的中心位置也随之发生偏转(从O点移动到O’点)，此时，穿过凸透镜的激光束的焦点也会相应地从F1处移动到F2处。通过程序控制输入电压的大小和变化周期，就能准确控制光束在微梁阵列上的扫描间距和周期。
[0086]图4示意性地说明了毛细管阵列套合修饰平台。在图4(a)中的三轴移动平台上刻有4个直径0.36μπκ中心间距250μπι的卡槽，用于等间距(250 μ m)固定毛细管；当固定好毛细管后，在显微镜下通过调节三轴移动平台，使毛细管阵列和微梁阵列对齐进行梁上探针分子的修饰(4图b)，修饰时采用的是间隔套合修饰，即第一次修饰微梁阵列中的1、
3、5、7号微梁，第二次再修饰2、4、6、8号微梁。其中毛细管内径设计为200~230 μ m，外径为300~330 μ m,在修饰时，其一端套合在微梁上，另一端插入装有探针分子溶液的小容器(孔板)中，每个容器中的溶液可以根据需要进行不同设定，这样修饰到各根梁上的探针分子就会各不相同，进而可以对待测液中的多种靶标分子进行同时检测。
[0087]下面结合具体实施例对本发明在微梁阵列传感探测方面做进一步说明，但不意在限制本发明。
[0088]实施例`
[0089]实施例1、基于压电扫描的微梁阵列传感方法对温度变化的测量
[0090]1.将一商品化微梁阵列(德国micromotive公司，如图5所示，其中微梁长500 μ m，宽90 μ m，厚I μ m，表面镀有(λ 02 μ m厚的金层，两微梁之间的中心间距为250 μ m)固定到系统(包括激光器、压电偏转器、生化反应池、温控器、PSD、A/D转换器、计算机，如图1所示)中的生化反应池里。
[0091]2.微梁的修饰和相关配置采用图4中所示的毛细管阵列套合修饰平台进行。
[0092]3.将焦距IOcm的凸透镜固定在压电陶瓷管上，并放置在一个半导体激光器前。压电陶瓷管通电后带动凸透镜一起做周期性偏转，激光器发出的汇聚激光束经一反光镜变向后周期性扫射微梁阵列基底上间距250 μ m的两定点9小时，扫描位移曲线图如图6所示:在X方向和Y方向上，两扫描位点都保持平行一致，没有出现较大偏移，说明系统扫描光路稳定。
[0093]4.调节激光束扫描位点，准确定位微梁1、2尖端，周期性切换并采集位移信号，示意图如图7所示；在两根梁位移信号稳定后，用高精度温控器(精度0.01°C)将微梁阵列的温度从22°C逐步升至28°C，所得对应数据曲线如图8所示。从图8中可以看出在升温6°C后，两根微梁的位移响应信号相差了 2611!11左右，误差6.5(% (相差量26nm除以总的变形量400nm)，在同一温度变化激励下基本保持一致。由于微梁传感技术对生化反应的检测主要是针对分子间的特异性结合，因此只要能准确的测出这种特有的反应信息，PSD靶面上接收到的微梁弯曲信号误差在10%左右是不影响检测结果的。
[0094]实施例2、基于压电扫描的微梁阵列生化传感方法对瘦肉精的检测
[0095]1.实验装置和试剂[0096]检测系统的具体结构图1中所示，主要包括激光器(参数:直径8mm，长20mm，发出激光的波长为650nm,激光焦点光斑直径为200 μ m)、压电偏转器(由压电陶瓷管和透镜组成，其中压电陶瓷管长30mm、外径6.35mm、内径5.35mm，最大输入电压±200V，偏转幅度±16μπι;透镜焦距为10cm，固定在压电陶瓷管中一端的末端))、生化反应池(容积0.5mL,全密封，由内直径Imm进样口、内直径1_出样口、玻璃片、微梁固定台组成，图11)、温控器(控温精度0.01 °C，温控范围(TC?100°C )、PSD (位移分辨率I μ m,靶面尺寸12mmX 12mm)、A/D转换器(12位)、计算机。
[0097]瘦肉精抗体、瘦肉精标准样品CLEN、氯霉素标准样品CAP(以上3种样品均取自中国农业大学农学与生物技术学院)；活化剂:1_乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS);硫醇HS-CH2-C00H(以上3种药品均购置于SIGMA公司)；PBS(4.0g NaCl+0.1g KH2PO4+1.48g Na2HPO4 *H20+500ml 去离子水)；TPBS(PBS+0.5%Tween-20) ;98%浓硫酸；30%双氧水，上述试剂均为分析纯。
[0098]2.微梁阵列上抗体的修饰
[0099]清洗微梁阵列，浸入比例为1: 3的H2O2和H2SO4混合溶液中IOmin (室温)，取出用去离子水冲洗，放入孔板中，加入200 μ L的0.lmol/L硫醇后封口静置20h (室温)，利用硫醇自带的巯基(-HS)自组装到微梁阵列一侧的镀金表面上。反应完成后，取出微梁阵列用乙醇冲洗,再用去离子水冲洗,放入新孔板中，注入100 μ L的0.2mol/L EDC和100 μ L的
0.05mol/LNHS静置1.5h，活化微梁阵列上硫醇的羧基。随后将微梁阵列取出用去离子水冲洗，再放到毛细管阵列套合修饰平台上，对I号微梁进行瘦肉精抗体修饰，过程如图9所示。其中毛细管内径设计为200?230 μ m,外径为300?330 μ m, 一端套合在微梁上，另一端插入装有瘦肉精抗体溶液的孔板中，静置2h。然后取出微梁阵列用TPBS冲洗，再固定在生化反应池中，流动PBS缓冲液，调试光路进行实验。
[0100]3.具体实验过程
[0101]激光器发出的激光束射向压电偏转器，压电偏转器被电压值-200V?+200V(电压变化周期1S，分1000步完成)的激励信号驱动偏转，驱使穿过它内部的激光束也随之发生周期性偏转，该激光束再经反光镜改变光路后周期性扫描微梁阵列。调节生化反应池位置使激光束扫描在微梁阵列中微梁I和微梁2的尖端，再调节PSD位置使从微梁I和2反射来的激光束打在PSD靶面中央，便于信号的接收采集。调试好光路后，采集输入电压信号和对应PSD祀面光强信号一分钟,统计出扫描过程中光强信号最强时(说明激光束扫描到了微梁I和微梁2上并被反射到了 PSD靶面上引起了响应)的两个输入电压值，于是周期性输入这个两个电压值时，压电偏转器就驱使激光束周期性扫描微梁I和微梁2，实现时序定位扫描。观察计算机上输出的微梁I和微梁2的位移信号曲线，待两条曲线都平稳后从进样口输入CAP标样溶液，等待一段时间，待微梁I和微梁2的位移信号曲线都平稳后，再从进样口输入CLEN标样溶液，等一段时间微梁I和微梁2的位移信号曲线都平稳后实验完成，停止数据采集。
[0102]4.微梁阵列检测结果
[0103]微梁阵列对CLEN抗原抗体特异性反应的检测结果如图10所示。图10中可看出，在流动PBS半小时后，先加入500ng/mL的CAP标样后，两梁响应量一致，且幅度较小，说明:
(I)此响应信号可能是由环境扰动(温漂、溶液折射率及酸碱度变化等)引起；(2)梁I上修饰的瘦肉精抗体和CAP标样不发生反应。待信号平稳后，再加入10ng/mL的CLEN标样，此时修饰有CLEN抗体的梁I响应信号明显大于未修饰CLEN抗体的梁2响应信号，说明:(I)梁I上发生了 CLEN抗原抗体的特异性反应导致了梁上表面应力的变化；(2)梁2的响应信号幅度较小，可能是由环境扰动引起。最后，将梁I响应信号减去梁2 (参考梁)响应信号，即可得到仅由CLEN抗原抗体特异性结合产生的真实微梁变形信号(38nm)。
【权利要求】
1.一种微梁阵列传感装置，包括 反应池，所述反应池用于容纳缓冲液和待测样品； 微梁阵列，所述微梁阵列由两个以上平行间隔排列的微梁组成并被可拆卸地固定在密闭的反应池中，其中所述每个微梁上固定有检测生物分子或对照分子； 半导体激光器； 压电偏转器，所述压电偏转器包括压电陶瓷管和凸透镜，所述凸透镜设置在所处半导体激光器与所述压电陶瓷管之间，其中所述压电陶瓷管被设置成驱动所述凸透镜产生偏转，使得通过所述凸透镜的由所述半导体激光器发射的激光束的光路也相应地发生变化； 反光镜，所述反光镜将来自所述压电偏转器的激光束改变光路后扫射到所述每个微梁上; 信号发生器，所述信号发生器控制所述压电陶瓷管的输入电压大小和变化周期； 光电位置敏感探测器(PSD)，所述光电位置敏感探测器接收由所述微梁阵列反射的激光光点，从而产生并输出关于每个微梁的位移信号；和 数据处理设备，所述数据处理设备处理由所述光电位置敏感探测器输出的每个微梁的位移信号，基于固定有对照分子的微梁的位移数据以获得固定有检测生物分子的每个微梁弯曲的数据， 其中当待测样品中含有与所述检测生物分`子特异性结合的靶分子时，固定有所述检测生物分子的微梁与所述待测样品在反应池中在适于两者的反应条件下反应后会发生弯曲。
2.权利要求1所述的装置，所述装置还包括设置与所述反应池可操作连接的加热片和与所述加热片电连接的温控器，`所述温控器控制加热片的温度以调节所述反应池中的温度从而适于所述检测生物分子和所述靶分子在所述反应池中发生反应。
3.权利要求1或2所述的装置，其特征在于所述反应为受体配体结合作用、抗原抗体反应或分子缔合反应。
4.权利要求1-3中任一项所述的装置，所述装置还包括模拟/数字信号转换器，所述模拟/数字信号转换器将所述关于每个微梁的位移信号转换成数字信号，所述数字信号输出至所述数据处理装置进行处理，以获得所述微梁弯曲数据。
5.权利要求1-4中任一项所述的装置，其特征在于所述对照分子包括至少一种阳性对照分子。
6.权利要求1-5中任一项所述的装置，其特征在于所述对照分子包括至少一种空白对照分子。
7.权利要求1-6中任一项所述的装置，其特征在于所述信号发生器通过控制所述压电陶瓷管的输入电压大小和变化周期从而控制所述凸透镜的偏转幅度和周期以改变所述激光束的光束，使得所述激光束扫描各个微梁的时序相应地发生变化，从而能够扫描所述微梁阵列中以不同间距间隔的每个微梁。
8.权利要求1-7中任一项所述的装置，其特征在于所述靶分子为抗原，所述检测生物分子为所述抗原的特异性抗体或抗体片段，所述特异性抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。
9.权利要求8所述的装置，其特征在于所述抗体片段是抗体的Fab、Fab’片段或F(ab，)2 片段。
10.一种使用微梁阵列传感装置检测待测样品中的靶分子的方法，所述方法包括以下步骤: (1)将与能够所述靶分子特异性结合的检测生物分子和对照分子分别固定至微梁阵列中的不同微梁上，每个微梁上固定一种分子； (2)将步骤(1)中获得的微梁相间隔地平行固定在反应池中，并在反应池中注入缓冲液，并使缓冲液在反应池中流动； (3)启动半导体激光器发射激光束； (4)通过信号发生器控制压电偏转器，使其偏转由所述半导体激光器发射的激光束的光路，从而使激光束能够扫描所述微梁阵列中以不同间距间隔的每个微梁； (5)向反应池中加入待测样品； (6)通过光电位置敏感探测器接收由所述微梁阵列反射的激光光点，从而产生并输出关于每个微梁的位移信号； (7)所述数据处理设备接收并处理由所述光电位置敏感探测器输出的每个微梁的位移信号，基于固定有对照分子的微梁的位移数据关于获得固定有检测生物分子的每个微梁弯曲的数据， (8)根据预设的弯`曲量阈值判断所述待测样品中是否包含所述靶分子。
【文档编号】G01N33/543GK103869062SQ201210550152
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】张青川, 邬林, 程腾 申请人:中国科学技术大学