专利名称：猪圆环病毒2型抗体检测elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，主要应用于猪圆环病毒2型抗体水平的检测，由此来判断猪场中猪圆环病毒2型的感染情况以及疫苗的免疫效果。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)为无囊膜的单股环状DNA病毒，病毒粒子直径约17nm 20nm，是迄今已知最小的动物病毒之一。PCV2与其它病原混合感染以及其它应激因子存在，会诱发猪圆环病毒病的发生，这些疾病主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪繁殖与呼吸综合征、新生仔猪先天性震颤、猪呼吸道病综合征、猪增生性和坏死性肺炎等，其中以PMWS最为严重。PMWS主要引起6 12周龄仔猪渐进性消瘦、呼吸道症状、皮肤苍白或出现黄疸、腹泻，造成患猪免疫机能下降、生产性能降低。PCV2在淋巴系统增殖，可引起免疫细胞的凋亡，造成免疫抑制，从而易发生混合感染和继发感染，多种病原混合感染和继发感染层出不穷，从而导致猪病临床症状和病理变化复杂化，给猪场疫病防治带来困。目前国内外猪场普遍存在PCV2，现已对全球养猪业构成重大危害。PCV2有三个主要的开放阅读框，分别为0RF1、0RF2和0RF3。ORFl编码与病毒复制相关的蛋白Rep和R印’ ;0RF2编码病毒的主要免疫原性衣壳蛋白；0RF3编码毒力相关蛋白，通过诱导细胞凋亡在病毒的致病过程中发挥重要作用。PCV2-0RF2有705个碱基，编码的衣壳蛋白为病毒的结构蛋白，分子量为30Ku，具有较好的免疫原性，且该蛋白在PCV1、PCV2之间的同源性只有67 %。虽然PCV1-0RF2与PCV2-0RF2抗原性相关，但只有0RF2蛋白可以被PCV2多抗识别，这为建立特异检测PCV2的血清学方法奠定了基础。目前，PCV2的实验室诊断方法主要有病理组织学检测、病毒的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫组化技术、PCR技术等，但这些技术对试验条件和专业技能要求较高，并且操作过程比较繁琐，不适合于兽医临床快速检测和大规模检测的需要。而酶联免疫吸附试验(ELISA)方法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，尽管国内外已经有一些猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，但多采用间接ELISA的方法，且包被抗原与抗体结合性能较差，非特异性反应较多。本发明的抗体检测板所包被的Cap蛋白为PCV2的真核表达核衣壳蛋白，同时使用该Cap蛋白偶联的酶标抗原，使非特异性反应大为减少，极大地提高了抗体检测的灵敏度和准确度，完全适用于大规模检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，本发明采用双抗原夹心ELISA方法，抗体检测板所被的抗原为真核表达的Cap蛋白，具有更好的抗原空间结构，灵敏度更高，由该Cap蛋白标记的酶标抗原与样品中抗体结合的特异性会更强，这些都是普通ELISA试剂盒所不具备的优点。本发明的技术方案为一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包含有
抗体检测板所述抗体检测板包被抗原的制备是以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5. O设计一对特异性引物，上游引物5’ -GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC-3’ ；下游引物5’ -GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT-3’，在两条引物的5’端分别加入FokI和SalI酶切位点，以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因，通过设计的Fokl/Sall双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP_secSUM03中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-secSUM03_Cap，其中的阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌，最后将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后制得的。将制备的Cap蛋白加入到O. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液中进行稀释，以每孔包被浓度为lug/ml的量分别加入96孔抗体检测板中，4°C包被过夜，用含体积浓度O. 05%吐温-20的pH7. 4的lmol/L PBS溶液洗涤三次，再用质量分数为5%的脱脂奶粉在37°C下封闭2小时，用以上PBS溶液洗涤三次，在室温下风干。样品稀释液pH7. 4的O. lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。酶标抗原在5mg/ml的辣根过氧化物(HRP)溶液中，加入O. 2ml的O. lmol/L的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入20 μ I O. 2mol/L pH9. 5的碳酸盐缓冲液，使pH升高到9. 0，然后立即加入2mlCap蛋白至Iml O. Olmol/L碳酸盐缓冲液中，室温搅拌2小时，回放O.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,在搅拌下加入等体积的硫酸铵,放置I小时后3000rpm离心30分钟，弃上清，将沉淀溶于pH7. 4的O. 15mol/L PBS中，将PBS进行透析，12000rpm离心离30分钟，去除沉淀，上清即为所需的酶标抗原。洗涤液10倍浓缩的含体积浓度0. 5%吐温-20的ρΗ7· 4的lmol/L PBS溶液。
底物显色液将0. 2g四甲基联苯胺(TMB)溶解在IOOml 二甲基亚砜(DMSO)溶液中，定容至1L，即为底物显色A液；将9. 33g柠檬酸和14. 6g磷酸氢二钠加入到质量体积比为0. 75%的过氧化氢尿素6. 4ml中，调pH值到5. 0，定容至1L，即为底物显色B液。将底物显色A液与B液等体积混合，量取111. 2ml的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其稀释定容至 IOOOml0终止液2mol/L硫酸溶液。阳性血清和阴性血清标准的PCV2型抗体阳性和阴性血清。
图1表达载体pP-secSUM03-Cap的酶切电泳鉴定结果。其中M为DNA分子量标准，I为重组空载体SUM03质粒的Hind III和SalI双酶切产物，2为重组质粒pP-secSUM03-Cap的Hind III和SalI双酶切产物。图2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中1为重组空载体SUM03质粒电转酵母后表达产物，2，3分别为重组质粒pP-secSUM03-CAP电转酵母后表达产物，M为蛋白marker分子量标准。
具体实施例方式实施例1猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的制备和使用方法1.猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的制备方法抗体检测板包被抗原的制备以GenBank中PCV2-TJ (序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5. O设计一对特异性引物，上游引物5’ -GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC-3，;下游引物5 ’ -GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT-3 ’，在两条引物的 5 ’端分别加入FokI和SalI酶切位点，以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因，通过设计的FokI/SalI双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-secSUM03中，转入大肠杆菌JM109，用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-seCSUM03-Cap，其中的阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌，最后将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后制得的。抗体检测板的制备将制备的包被抗原Cap蛋白加入到O. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液中进行稀释，以每孔包被浓度为lug/ml的量分别加入96孔抗体检测板中，4°C包被过夜，用含体积浓度O. 05%吐温-20的pH7. 4的lmol/L PBS溶液洗涤三次，再用质量分数为5%的脱脂奶粉在37°C下封闭2小时，用以上PBS溶液洗涤三次，在室温下风干，包装。酶标抗原的制备在5mg/ml的辣根过氧化物(HRP)溶液中，加入O. 2ml的O.1mol/L的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入20 μ I O. 2mol/L pH9. 5的碳酸盐缓冲液，使pH升高到9. 0，然后立即加入2mlCap蛋白至Iml O. Olmol/L碳酸盐缓冲液中，室温搅拌2小时，回放O.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,在搅拌下加入等体积的硫酸铵,放置I小时后3000rpm离心30分钟，弃上清，将沉淀溶于ρΗ7· 4的O. 15mol/L PBS中，将PBS进行透析，12000rpm离心离30分钟，去除沉淀，上清即为所需的酶标抗原。底物显色液的制备将O. 2g四甲基联苯胺(TMB)溶解在IOOml 二甲基亚砜(DMSO)溶液中，定容至1L，即为底物显色A液；将9. 33g柠檬酸和14. 6g磷酸氢二钠加入到质量体积比为O. 75%的过氧化氢尿素6. 4ml中，调pH值到5. 0，定容至1L，即为底物显色B液。将底物显色A液与B液等体积混合，量取111. 2ml的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其稀释定容至1000ml。样品稀释液的制备配制pH7. 4的O. lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。洗涤液的制备配制含体积浓度O. 5 %吐温-20的pH7. 4的lmol/L PBS溶液做为10倍浓缩的洗涤液。终止液的制备配制2mol/L硫酸溶液。阳性血清和阴性血清的制备标准的PCV2型抗体阳性和阴性血清。2.猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的使用方法将待检测的样品用样品稀释液进行100倍稀释，每孔100 μ I加入到抗体检测板中，同时加入阳性对照和阴性对照，静置于37°C温箱中孵育I小时；每孔加入300μ I洗涤液洗板5次，拍干检测板，每孔加入酶标抗原lOOul，静置于37°C温箱中孵育I小时；每孔加Λ 300 μ I洗涤液洗板5次，拍干检测板，每孔加入底物显色液100 μ 1，37°C避光显色10分钟；每孔加入终止液50 μ 1，立即用酶标仪在450nm的波长下读数。结果的判定方法读数中标准阳性血清的OD值应大于1. O标准阴性血清的OD值应小于O. 2，否则试验结果无效。当计算的S/P值小于O. 5时，结果判为阴性，否则结果判为阳性。实施例2猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的特异性、敏感性以及与同类产品的对比试验1.特异性试验使用本发明的试剂盒分别对猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗体阳性血清、猪口蹄疫病毒(FMDV)抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性血清、猪细小病毒(PPV)抗体阳性血清、猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体阳性血清、猪圆环病毒I型(PCVl)抗体阳性血清、猪圆环病毒II型(PCV2)抗体阳性血清进行检测，其结果显示，PCV2抗体阳性血清的检测结果为阳性，其余检测结果均为阴性。说明本发明试剂盒所使用的抗原与其它病原的抗体之间并无交叉反应，特异性强。2.敏感性试验对猪圆环病毒II型(PCV2)抗体阳性血清分别按照1: 100、I 300,1 IOOOU 3000倍进行稀释，用本发明的试剂盒分别对其进行检测，其最高检测到阳性血清稀释倍数为1000倍。说明本发明试剂盒的灵敏度较高。3.与同类产品的对比试验使用本发明的试剂盒与国内两家以及国外一家同类试剂盒同时检测PCV2免疫阳性血清5份、PCV2阴性血清3份，比较其检测结果的一致性，结果见下表。
权利要求
1.一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于以GenBank中PCV2-TJ毒株基因序列为模板表达PCV2型核衣壳Cap蛋白，并通过如下步骤完成猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒的制备，具体步骤如下1)抗体检测板包被抗原的制备以GenBank中PCV2-TJ(序号AY181946)毒株基因序列为模板，用软件Primer5. O设计一对特异性引物，上游引物5’ -GTGGTCTCCAGGTATGACGTATCCAAGGAGGC-3 ’;下游引物5 ’ -GTCTCAGATCTTCAAGGGTTAAGTGGGGGGT-3 ’，在两条引物的 5 ’ 端分别加入FokI和SalI酶切位点，以PCV-2感染的PK15细胞培养物中提取的DNA产物为模板，用PCR技术扩增出了实验室分离毒株PCV-2的Cap蛋白全基因，通过设计的Fokl/Sall双酶切位点，将目的基因Cap克隆入赤酵母分泌型表达载体pP-secSUM03中，转入大肠杆菌JM109,用PCR和双酶切方法鉴定得到重组菌株pP-seCSUM03-Cap，其中的阳性重组质粒经纯化、线性化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株GS115，Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株，挑取单克隆菌培养，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌，最后将重组阳性表达酵母菌上清经镍柱纯化分离后，加入SUMO蛋白酶同步进行透析和标签切除，再次过镍柱纯化后制得制得PCV2型核衣壳Cap蛋白。2)抗体检测板的制备将制备的包被抗原Cap蛋白加入到O.05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液中进行稀释，以每孔包被浓度为lug/ml的量分别加入96孔抗体检测板中，4°C包被过夜，用含体积浓度O. 05%吐温-20的pH7. 4的lmol/L PBS溶液洗涤三次，再用质量分数为5%的脱脂奶粉在37°C下封闭2小时，用以上PBS溶液洗涤三次，在室温下风干，包装。3)酶标抗原的制备在5mg/ml的辣根过氧化物(HRP)溶液中，加入O.2ml的O.1mol/L的NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，加入20 μ I O. 2mol/L pH9. 5的碳酸盐缓冲液，使pH升高到9. 0，然后立即加入2mlCap蛋白至Iml O. Olmol/L碳酸盐缓冲液中，室温搅拌2小时，回放O.1ml的4mg/ml NaBH4溶液,在搅拌下加入等体积的硫酸铵,放置I小时后3000rpm离心30分钟，弃上清，将沉淀溶于ρΗ7· 4的O. 15mol/L PBS中，将PBS进行透析，12000rpm离心离30分钟，去除沉淀，上清即为所需的酶标抗原。4)底物显色液的制备将O.2g四甲基联苯胺(TMB)溶解在IOOml 二甲基亚砜(DMSO)溶液中，定容至1L，即为底物显色A液；将9. 33g柠檬酸和14. 6g磷酸氢二钠加入到质量体积比为O. 75%的过氧化氢尿素6. 4ml中，调pH值到5. 0，定容至1L，即为底物显色B液。将底物显色A液与B液等体积混合，量取111. 2ml的18mol/L浓硫酸，用混合显色液将其稀释定容至1000ml。5)样品稀释液的制备配制pH7.4的O. lmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)。6)洗涤液的制备配制含体积浓度0.5%吐温-20的pH7. 4的lmol/L PBS溶液做为10倍浓缩的洗涤液。7)终止液的制备配制2mol/L硫酸溶液。8)阳性血清和阴性血清的制备标准的PCV2型抗体阳性和阴性血清。
2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于所述抗体检测试剂盒内包含有抗体检测板、样品稀释液、酶标抗原、洗涤液、底物显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。
全文摘要
本发明为一种猪圆环病毒2型抗体检测ELISA试剂盒，该试剂盒内包含有抗体检测板、样品稀释液、酶标抗原、洗涤液、底物显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。本试剂盒的抗体检测板所包被的Cap蛋白为PCV2的真核表达核衣壳Cap蛋白，同时使用该Cap蛋白偶联的酶标抗原，使非特异性反应大为减少，提高了抗体检测的准确度，更利于大规模的推广使用。
文档编号G01N33/531GK103033614SQ20121055310
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者董建辉 申请人:北京伟嘉人生物技术有限公司, 湖南农大动物药业有限公司