专利名称：一种检测畜肉中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测畜肉中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板，具体涉及一种检测畜肉中盐酸克伦特罗的免疫胶体金快速检测试剂板。
背景技术：
盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)，又名瘦肉精，为白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化学性质稳定；它是一种人工合成的￠-兴奋剂类药物，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用剂量达到治疗量的5 10倍时，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增力口，脂肪沉积减少，在养猪业中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到饲料中，用以改善胴体的品质，但同时也造成了猪肉中盐酸克伦特罗的残留。当人们食用含有盐酸克伦特罗残留的肉品后，常常造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震颤，头晕，口千，失 眠甚至于瘫痪等中毒症状，对心脏病患者更有生命危险。欧盟在1988年就立法禁止使用盐酸克伦特罗。为保障畜牧业的持续健康发展和人民的身体健康，我国农业部也已在176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中将盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、特布他林列入了禁用清单，明令禁止盐酸克伦特罗使用。然而，受经济利益驱动以及缺乏有效的监测手段，目前仍有不少养殖户违令使用￠-兴奋剂。因此，建立科学、规范的药物残留监控方法十分必要。目前已有多种方法用于对CLB的残留分析，主要包括酶联免疫检测法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱一质谱联用法(GC2MS)、液相色谱一质谱联用法(LC2MS)等，但均需依靠特殊仪器进行分析，不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。免疫分析法是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种简便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂贵的仪器、前处理简化、灵敏、特异性强、快速，越来越多地被用于食品中药物等残留的检测。目前，应用广泛的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法。酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定P -兴奋剂类药物含量的免疫分析方法，具有特异性强、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。而且需要用到昂贵的特殊仪器设备，具有一定的局限性。胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。
实用新型内容本实用新型针对检测需求，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂。本实用新型试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测畜肉中的盐酸克伦特罗残留水平。如果样品溶液中含有盐酸克伦特罗残留，盐酸克伦特罗先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的盐酸克伦特罗药物占据而无法与检测线上盐酸克伦特罗特异性抗原结合；当样品中的盐酸克伦特罗含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色比控制线浅或无显色，判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色比控制线深或一样深，判定为阴性。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。相邻各部分间有1-2_的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。胶体金结合垫上包被有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维 素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG， 分别作为检测线和控制线。偶联盐酸克伦特罗的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血监蛋白等。本实用新型试剂板的各部分组成成分和功能如下塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。本实用新型试剂板具有如下有益效果(I)特异性好。本实用新型试剂板对盐酸克伦特罗的交叉反应率为100%，对如沙丁胺醇、莱克多巴胺等￠-兴奋剂类药物的交叉反应率均低于I %。可见，本实用新型试剂板对盐酸克伦特罗反应具有高度专一性。(2)灵敏度高。本实用新型试剂板对样品中盐酸克伦特罗的检出限为5ppb(样品制备方法简单)、lppb (样品制备方法复杂)，试剂板适用于各类企业及检测机构。(3)操作简单快捷。本实用新型试剂板将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后5-10分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。(4)成本低，易推广。本实用新型试剂板生产工艺简单,流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。
图I为盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板背衬结构示意图，其中I为样品垫，2为胶体金结合垫,3为硝酸纤维素膜,4为检测线,5为控制线,6为吸水垫,7为不干胶，8为PVC底板。图2为盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。图3为盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。
具体实施方式
本实用新型试剂板的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗盐酸克伦特罗单克隆抗 体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备和盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板的组装。I.半抗原与载体蛋白的偶联称取20mg盐酸克伦特罗，用2mL 0. 5mol/L的硫酸溶液溶解，混匀后加入300 u LlOmg/mL的亚硝酸钠，持续反应2h。在搅拌下，将溶液逐滴加入到BSA溶液中(IOOmg BSA溶于IOmL 0. Imol/LpHlO. 0的碳酸钠缓冲溶液)。混匀后，置于4°C下避光反应5h (期间可颠倒混匀)，之后用0. 01mol/LpH7. 4的PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8h换液一次。再将溶液离心，收集上清液，-20°C下冻存备用。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备盐酸克伦特罗半抗原-卵清蛋白偶联物。2.抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的盐酸克伦特罗半抗原-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按IOOy g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫I次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫I次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C，5% CO2培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mG/L盐酸克伦特罗半抗原-BSA包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，力口入羊抗鼠IgG-HRP(l 1000)，oro显色。筛选出的阳性孔再用卵清蛋白偶联物包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X 10_3mol/L盐酸克伦特罗溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代盐酸克伦特罗溶液作对照，其余步骤同上。若盐酸克伦特罗阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X 105/mL时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株107个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1%柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。[0038]4.胶体金标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备取已制备好的IOOmL胶体金溶液，用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入I. 5mg抗盐酸克伦特罗单抗，搅拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，搅拌 15min。20，OOOrpm 离心 15min,弃上清液，加入 IOmLpH 7. 4PBS 缓冲液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2% BSA的PBS缓冲液(pH 7. 4)溶解，用0. 22iim无菌过滤器过滤后，4°C保存备用。5.盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板的组装参照图1，用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37°C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记盐酸克伦特罗单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。6.盐酸克伦特罗免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法6. I样品制备(I)样品简单制备方法称取4g左右剪碎的动物组织样本装于5mL刻度冷冻管中，盖紧管盖，于90°C以上水浴锅中水浴10分钟；冷却至常温后，取3滴煮出的溶液(尽量吸取上清)于1.5ml离心管中，再加入3滴SAL专用PBST缓冲液，充分混合，待检。(2)样品复杂制备方法取去脂肪组织样本于均质机中均质Imin ;称取2. 5g均质物于15mL离心管中，力口A 5mL 0. IM HCl，振荡混匀IOmin ;加入100 u L4M NaOH,剧烈振荡30秒后，室温下4，OOOr/min,离心15min ;转移全部上清于15mL离心管中，加入50 y L4MNaOH,振荡混勻，再加入8mL乙酸乙酯，振荡5min ;取上层有机相6mL于试管中，65°C氮(空)气吹干；向吹干的试管中依次加入0. 3mL正己烷和0. 3mL SAL专用PBST缓冲液，充分溶解试管壁上残留物，静置分层后，吸取下层溶液，待检。6. 2检测步骤从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100 U L滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3 5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面。6. 3结果判读读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。阴性(-):T线显色比C线深或一样深，表示样品中盐酸克伦特罗残留含量低于检测限或不含盐酸克伦特罗残留。如图3. a所示。阳性(+) :T线线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中盐酸克伦特罗残留含量高于检测限。如图3. b所示。无效未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。如图3. c所示。
权利要求1.一种检测畜肉中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板，其特征在于试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，试剂板背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有l-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。
2.如权利要求I所说的试剂板，其特征在于试剂板的硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
3.如权利要求I所说的试剂板，其特征在于胶体金颗粒的平均大小为30nm。
4.如权利要求I所说的试剂板，其特征在干，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。
专利摘要本实用新型涉及一种检测畜肉中盐酸克伦特罗的免疫胶体金试剂板，可用于检测畜肉中是否有盐酸克伦特罗残留。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程最短只需15分钟左右，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合屠宰企业及政府检测机构检测需求。
文档编号G01N33/558GK202614764SQ201220273420
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者王森, 张少恩, 桑丽雅 申请人:杭州南开日新生物技术有限公司, 绍兴市农业科学研究院