专利名称：检测万古霉素的试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测万古霉素的试纸条，特别是检测牛奶中万古霉素的试纸条。
背景技术：
万古霉素(vancomycin，VCM)，又名凡古霉素、凡可霉素，是一种多肽类抗生素，分子式为C66H75Cl2N9O24,分子量1485. 72。通常以盐酸盐形式存在，为白色至淡棕色粉末，无臭，味苦。在水中易溶，在甲醇中微溶，在丙酮、丁醇或乙醚中不溶，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。万古霉素，作为一种从微生物Streptomyces orientalis分离得到的多肽类抗生素，它对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，但因其不能穿透外部的渗透屏障，它对革兰氏阴性菌没有疗效。
·[0003]多肽类抗生素是由不同类型的氨基酸缩合而成的小分子肽类，主要用于促进动物生长及治疗畜禽疾病。目前，多肽类抗生素被广泛用于家禽、猪、牛等饲料添加剂和兽药。常用的多肽类抗生素包括粘杆菌素、杆菌肽、维吉尼霉素及万古霉素等。然而，随着多肽类抗生素的广泛使用，滥用及不遵守休药期等现象时有发生。药物将可能通过食物链的传递进入人体，危害人体健康。如果长期暴露，还会增加细菌的抗药性，具有潜在的健康风险和生态风险。多肽类抗生素可分别抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺旋体、原虫的感染，特别是对牛乳腺炎等疾病有较好的疗效。目前，欧盟、日本、美国、澳大利亚等均已制定牛奶中多种多肽类抗生素的限量。其中，欧盟对杆菌肽A及粘杆菌素的限量分别为100和50 μ g/kg;日本对杆菌肽A、维吉尼霉素、万古霉素、粘杆菌素的限量分别为400、100、10和10 μ g/kg。而我国也于近年制定了牛奶中杆菌肽A及粘杆菌素的限量，分别为500和50yg/kg。关于多肽类抗生素的检测方法逐渐引起了关注。目前，多肽类抗生素检测方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法等，但这些方法均存在灵敏度低等问题，无法满足检出限要求；而单独检测万古霉素的方法包括高效液相色谱法、分光光度法、荧光偏振免疫分析法、毛细管电泳法、微生物分析法和薄层色谱法，其中。微生物法检测耗时长，缺乏特异性，且所用细菌对不同种类的抗菌药物敏感性存在差异，易导致假阴性和假阳性产生；仪器分析法样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，仅适用于样品的确证分析，不适合大批量样品的筛选及现场检测。并且关于牛奶中万古霉素检测的研究尚未见报道。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测万古霉素的试纸条。本实用新型的试纸条，包括冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。检测线和质控线平行，检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，质控线位于距离检测线4_7mm处，试纸上粘贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线，微孔试剂上具有微孔塞。为了便于运输和使用，试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。本实用新型试纸条中的试纸底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。本实用新型试纸条具有如下有益效果I、灵敏度闻。检测万古霉素的试纸条以I父体金标记闻未和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。其中的万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对万古霉素的检测灵敏度为50μ g/L。2、操作简便快速。使用试纸条检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液滴加于微孔试剂中，混匀后，室温(20-250C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下，插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25°C)孵育5min，观察结果。3、显示检测结果形象、直观、准确。检测试纸以显示红色线“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示被检测样本液中万古霉素的含量高于或等于试纸条对万古霉素的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示被检测样本中万古霉素的含量低于试纸条对万古霉素的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4、成本低，投资少。使用本实用新型试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5、易于大范围推广应用。试纸条操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、食品企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图I为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、检测万古霉素试纸条的组装制备( I)试纸样品吸收垫I、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序粘贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上,为检测端,上面印有MAX标记线,检测线4包被有万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水 纸，保护膜为PE材质保护膜。(2)微孔试剂微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物。(3)将(I)试纸和(2)微孔试剂装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于盒体12内的固定用具11中。二、试纸条的使用滴加待检牛奶样品溶液200 μ I到微孔试剂中，混匀后，室温(20_25°C )孵育5min，将试纸标有MAX标记线的一端向下插入孵育后的微孔试剂中，室温(20-25 0C )孵育5min，观
察结果。三、检测结果分析万古霉素在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物与万古霉素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测线上因为竞争反应，不会与万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸以显示红色线“I”，判为阳性，如图4.a所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试纸条中用到的材料制备方法I.万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定万古霉素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。(I)万古霉素半抗原的制备O. 50g万古霉素、O. 40琥珀酸酐和2ml吡啶在IOml 二甲基亚砜(DMSO)中的混合液，在80°C下搅拌反应10h，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到万古霉素单琥珀酸酰胺，即为万古霉素半抗原。[0041](2)免疫原的制备——万古霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联物合成取15mg半抗原，溶解于Iml N, N- 二甲基甲酰胺中，取碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺各30mg用O. 2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取牛血清白蛋白50mg，使之充分溶解在3.8ml PBS (pH 7. 2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h,用O. 01mol/L PBS 4°C透析3d,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。(3)包被原的制备——万古霉素半抗原与卵清蛋白偶联物合成取15mg半抗原,溶解于Iml N, N- 二甲基甲酰胺中，取碳化二亚胺和N-轻基琥拍酰亚胺各30mg用O. 2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A ;称取卵清蛋白白50mg，使之充分溶解在3.8ml PBS (pH 7. 2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h,用O. 01mol/L PBS 4°C透析3d,每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于_20°C保存备用。·(4)万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定将万古霉素半抗原、载体蛋白、万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. 01mol/L ρΗ7· 4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长20(T800nm范围内扫描，得到万古霉素半抗原、载体蛋白、万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明万古霉素半抗原与载体蛋白偶联成功。2.万古霉素单克隆抗体的制备( I)动物免疫将步骤I得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生
抗血清。(2)细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌万古霉素单克隆抗体的万古霉素单克隆杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为
0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4.万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0. 01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用O. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7. 2，按每毫升胶体金溶液中加入5(Γ 00μ g的标准向胶体金溶液中加入上述万古霉素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置IOminJpA 10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min，4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液含牛血清白蛋白O. 19Γ0. 3% (体积百分含量)、吐温-80 O. 05°/Γ0· 2%(质量百分含量)、ΡΗ7. 2的O. 02mol/L磷酸盐缓冲液。·5.将万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ I万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。6.样品吸收垫的制备将样品吸收垫置于含O. 5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7. 2,0. lmol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。7.反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将万古霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T)，包被量为l.Oyg/cm2;用O. 01mol/L、pH7· 4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C)，包被量为l.Oyg/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
权利要求1.一种检测万古霉素的试纸条，其特征在于包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述反应膜上具有包被有万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“ I ”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试纸条，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1、2或3所述的试纸条，其特征在于所述检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm处，所述质控线位于距离检测线4_7mm处。
5.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸上贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX标记线。
6.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸，吸水垫为吸水纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
8.如权利要求7所述的试纸条，其特征在于所述微孔试剂中冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
9.如权利要求I所述的试纸条，其特征在于所述试纸条盛装于具有密封盖的试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。
10.如权利要求9所述的试纸条，其特征在于所述试剂桶为塑料试剂桶，固定用具是硬质支撑材料，盒体为硬纸盒。
专利摘要本实用新型提供了一种检测万古霉素的试纸条，试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，微孔试剂上冻干有万古霉素单克隆抗体-胶体金标记物，反应膜上具有包被有万古霉素半抗原-载体蛋白偶联物的检测线印迹“|”和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线印迹“|”。试纸条放置于具塞试剂桶中，12个具塞试剂桶放置于具有12个孔的固定用具的盒体中。本实用新型试纸条具有便携性好、灵敏度高、检测时间短等特点，可以在万古霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/68GK202735353SQ20122038216
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者何方洋, 万宇平, 冯才伟, 付军权, 赵正苗, 李勇, 杨秀贤, 崔廷婷 申请人:北京勤邦生物技术有限公司