专利名称：氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒技术领域[0001]本实用新型涉及氯霉素的检测装置，具体地指一种氯霉素化学发光酶联免疫检测 试剂盒。
背景技术：
[0002]氯霉素(Chloramphenicol, CAP)最初是由委内瑞拉链丝菌的培养基中提取制得, 是一类广谱抗生素。氯霉素曾在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽的疾病控制和治疗起到了 重要作用。氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏 症，新生儿、早产儿灰色综合症等，低浓度药物残留还会诱发致病菌的耐药性，对人类的健 康构成巨大的潜在威胁。在美国仅允许氯霉素应用于非食用性动物，规定在任何动物性食 品中不得检出氯霉素。欧共体禁止氯霉素应用于产奶牛和产蛋鸡，在其他动物性食品中的 含量也做了限制，规定最高残留量为100ng/kg。中国农业部已将氯霉素从2002年版《中国 兽药典》中删除列为禁药，近年已规定在动物性食品中不得检出。[0003]作为全国淡水渔业第一省的湖北水产业，续十三年淡水产品总量保持全国第一。 我省现有水产加工企业180家，其中加工出口企业19家。作为国家明令禁止使用的兽药， 在水产品等动物源性食品中，氯霉素残留一直被列为重点必检项目之一。[0004]目前，应用广泛的CAP检测技术有液相色谱法(LC)、质谱法(MS)、高效液相色谱法 (HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。LC等大型仪器分析方法对设备和操作者有较高要求， 样品处理方法复杂，检测时间长。但是现有检测方法所用的设备操作复杂、检测费用较高， 无法在非实验室环境下进行，不适合现场检测和大量样本筛选，使推广使用受到限制。实用新型内容[0005]本实用新型的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种小巧轻便、可现 场检测的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，其操作简单，检测快速、准确、灵敏度高，成 本低。[0006]为实现上述目的，本实用新型所设计的氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，包 括盒体和包被有抗原的酶标板，所述盒体内设置存放不同溶液的试剂瓶，所述试剂瓶分别 为酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶、氯霉素系列标准溶液试剂瓶、浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂 瓶、浓缩洗涤液试剂瓶和发光液试剂瓶。[0007]优选地，所述酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶为绿色瓶帽的白色塑料瓶，所述氯霉 素系列标准溶液试剂瓶为白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶为蓝色 瓶帽的半透明塑料瓶，所述浓缩洗涤液试剂瓶为透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述发光液试 剂瓶为红色瓶帽的黑色塑料瓶。这样，所需试剂用不同颜色的试剂瓶封装在盒体内，易于快 速区分。[0008]上述方案中，所述酶标板为设置有48或96个反应孔的可拆卸微孔板。[0009]本实用新型中所述酶标氯霉素抗体是由辣根过氧化物酶和氯霉素抗体通过过碘酸钠法偶联制成。[0010]本实用新型中所述抗原是由氯霉素和载体蛋白通过碳二亚胺法偶联制成的完全抗原。[0011]本实用新型中所述包被有抗原的酶标板是将抗原用稀释液稀释后，在微孔板中每孔加入50 300 μ L置于4°C包被,次日将抗原的微孔板取出洗漆后每孔加50 300 μ L封闭液，置于25 40°C水浴封闭O. 5^2小时后再洗涤，拍干，用真空密封在4°C下保存即得。[0012]本实用新型中浓缩磷酸盐缓冲溶液每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、 Na2HPO4 ·12Η20 29. 0g、KCl 2. Og的水溶液，使用时用蒸馏水稀释10倍作为抗原和酶标抗体的稀释液。[0013]本实用新型中浓缩洗涤液在上述浓缩磷酸盐缓冲液中加入体积比为O. 05%的吐温-20，使用时用蒸馏水稀释10倍后作为洗涤液。[0014]本实用新型中发光液含有用O. lmol/L pH=8. 5三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液配制的2mmol/L鲁米诺、O. 25mmol/L的对轻基苯丙烯酸和20mmol/L的过硼酸钠。[0015]本实用新型的有益效果在于本实用新型将具有高度灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，操作简便，用时短，无需长时间显色及终止，且灵敏度高，特异性好，能快速、简便、灵敏地用于水产品中氯霉素的检测。该试剂盒可检出的最低检测限为O. 0125ng/mL，可一次性进行多个样本的测定，减少检测样本所需要的时间。本实用新型具有节约成本、操作简便快速、可在非实验室条件下进行、便于携带和运输的特点。
[0016]图1为氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的盒体结构示意图。[0017]图2为氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒的酶标板结构示意图。
具体实施方式
[0018]以下结合 附图和具体实施例对本实用新型作进一步的详细描述。[0019]图1、2所示氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体I和包被有抗原的酶标板2。盒体I内设置存放不同溶液的试剂瓶，试剂瓶分别为酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶3、氯霉素系列标准溶液试剂瓶4一 11、浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶12、浓缩洗涤液试剂瓶13和发光液试剂瓶14。酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶3为绿色瓶帽的白色塑料瓶，氯霉素系列标准溶液试剂瓶4一 11为白色瓶帽的棕色玻璃瓶，浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶12 为蓝色瓶帽的半透明塑料瓶，浓缩洗涤液试剂瓶13为透明瓶帽的半透明塑料瓶，发光液试剂瓶14为红色瓶帽的黑色塑料瓶。[0020]如图2所示酶标板2为设置有96个反应孔的可拆卸微孔板。[0021]浓缩磷酸盐缓冲溶液每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、Na2HPO4 · 12H20 29. 0g、KCl 2. Og的水溶液，使用时用蒸馏水稀释10倍作为抗原和酶标抗体的稀释液。[0022]浓缩洗涤液在上述浓缩磷酸盐缓冲液中加入体积比为O. 05%的吐温-20，使用时用蒸馏水稀释10倍后作为洗涤液。[0023]发光液含有用O. lmol/L pH=8. 5三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液配制的2mmol/ L鲁米诺、0. 25mmol/L的对轻基苯丙烯酸和20mmol/L的过硼酸钠。[0024]氯霉素系列标准溶液试剂瓶4一 11中的氯霉素浓度分别为0ng/ml、0. 0125ng/ml、 0. 025ng/ml、0. 05ng/ml、0. 15ng/ml、0. 45ng/ml>1. 35ng/ml、4. 05ng/mlo[0025]1、试剂盒中抗原的制备[0026]称取牛血清白蛋白(BSA)以超纯水溶解，配制成浓度为5 30mg/mL的BSA溶液。称取氯霉素(CAP)以超纯水溶解，配制成浓度为f5mg/mL的CAP溶液。称取1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加超纯水溶解，配制成浓度为f 5mg/mL的EDC溶液。 向EDC溶液中加入O. 1-0. 5mL CAP溶液，混合2min，再将已活化的CAP溶液加入到O. 5mL BSA溶液中，上下混合均匀后，室温避光混合2h，收集偶联产物转移至30kDa超滤管，于冷冻离心机4°C下3000rpm离心5min,加等体积甘油混勻，-20°C冻存。[0027]2、试剂盒中酶标抗体的制备[0028]称取辣根过氧化物酶(HRP)溶解于超纯水中，配制成浓度为f 10mg/mL的HRP溶液，4°C静置过夜，使之充分溶解；次日取上述HRP溶液0. 5mL并向其中加入0. 025 1mL新配的0. 0f lmol/L NaIO4水溶液，混匀后放置冰箱避光搅拌5 20分钟后取出。取出反应液装入透析袋中，4°C对pH=4. O的醋酸溶液透析过夜。次日将透析后的混合物取出，调节混合物pH值，使其接近9.6 ;立即将0.5 5mg的氯霉素单抗加入，室温避光搅拌。反应结束后取混合液中加入0. 05、. 5mL浓度为f lOmg/mL的NaBH4 ;然后将混合液超滤加等量甘油保存。[0029]3、酶标板的制作[0030]将抗原用稀释液稀释后，在微孔板中每孔加入5(Γ300μ L置于4°C包被，次日将抗原的微孔板取出洗涤后每孔加5(Γ300μ L封闭液，置于25 40°C水浴封闭O. 5 2小时后再洗涤，拍干，用真空密封在4°C下保存即得。[0031]本实用新型的检测过程[0032]I)样品前处理取IOg去除脂肪的鱼样品匀浆化，称量3g匀浆化的样品与6mL乙酸乙酯混合IOmin, 4000g离心5min,转移2mL乙酸乙酯上层到干净的玻璃管中，50°C温和氮气流蒸发乙酸乙酯，脂肪残留物溶于ImL正己烷混匀lmin，并加入ImL样品稀释液。涡旋混合lmin,4000g离心分离5min,弃去上层,吸取100 μ L下层溶液用于检测。[0033]2)标准曲线建立向酶标板2中每孔先加入100 μ L试剂盒所提供8个系列的氯霉素标准溶液，再加入50 μ L稀释后的酶标抗体，酶标抗体的稀释度1:80Κ，在25°C温育15 分钟，加入300 μ L/孔的洗涤液，静置2分钟后拍干，重复用洗涤液洗涤5次后，每孔加入发光液180 μ L，5分钟后在化学发光检测仪上检测。以所得标准溶液的发光值，除以最低浓度对应的发光值再乘以100，得到抑制率，以抑制率为纵坐标，以氯霉素浓度的对数为横坐标作标准曲线。[0034]3)待测样品的检测分析向酶标板2中每孔先加入处理好的待测样品，再加入 50 μ L稀释后的酶标抗体，酶标抗体的稀释度1:80Κ，在25°C下温育15分钟，用洗涤液洗涤 5次后，每孔加入发光液180 μ L，5分钟后在化学发光检测仪上检测。以加入待测样品的发光值从标准曲线上计算待测样品中氯霉素的含量。
权利要求1.一种氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体(I)和包被有抗原的酶标板(2)，其特征在于所述盒体(I)内设置存放不同溶液的试剂瓶，所述试剂瓶分别为酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶(3)、氯霉素系列标准溶液试剂瓶(4 一 11)、浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶(12)、浓缩洗涤液试剂瓶(13)和发光液试剂瓶(14)。
2.根据权利要求1所述氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶(3)为绿色瓶帽的白色塑料瓶，所述氯霉素系列标准溶液试剂瓶(4一 11)为白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶(12)为蓝色瓶帽的半透明塑料瓶，所述浓缩洗涤液试剂瓶(13)为透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述发光液试剂瓶(14)为红色瓶帽的黑色塑料瓶。
3.根据权利要求1所述氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标板(2)为设置有48或96个反应孔的可拆卸微孔板。
专利摘要本实用新型公开了一种氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体和包被有抗原的酶标板，盒体内设置存放不同溶液的试剂瓶，试剂瓶分别为酶标氯霉素抗体工作液试剂瓶、氯霉素系列标准溶液试剂瓶、浓缩磷酸盐缓冲溶液试剂瓶、浓缩洗涤液试剂瓶和发光液试剂瓶。本实用新型操作简便，用时短，无需长时间显色及终止，且灵敏度高，特异性好，能快速、简便、灵敏地用于水产品中氯霉素的检测。该试剂盒可检出的最低检测限为0.0125ng/mL，可一次性进行多个样本的测定，减少检测样本所需要的时间。本实用新型具有节约成本、操作简便快速、可在非实验室条件下进行、便于携带和运输的特点。
文档编号G01N33/543GK202870093SQ20122048252
公开日2013年4月10日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者陈建军, 金伟, 余浩, 李娟娟, 冯汉利, 曾宪东, 杨海, 王振华 申请人:湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 武汉百仕康生物科技有限公司