用于可逆的离子和分子感测或迁移的纳米孔装置制造方法

用于可逆的离子和分子感测或迁移的纳米孔装置制造方法
【专利摘要】公开了用于检测离子迁移和结合的方法和装置，其利用适用于在电化学感测电路中使用的纳米吸量管。纳米吸量管可以借助用于结合和感测金属离子的金属螯合剂或其他的特异性结合分子例如用于结合和感测葡萄糖的硼酸在其内部孔隙上被官能化。这样的官能化的纳米吸量管被包括在检测纳米吸量管何时选择性地并且可逆地结合离子或小分子的电传感器中。还公开了用于通过电压导向的离子迁移控制水溶液中的沉淀的包括纳米吸量管的纳米反应器，其中离子可以通过孔隙中的排斥电荷被引导离开内部孔隙。
【专利说明】用于可逆的离子和分子感测或迁移的纳米孔装置
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2011年3月4日提交的美国临时专利申请第61 / 449，379号的优先权，其在此以其整体通过引用并入。
[0003]政府支持的声明
[0004]本发明通过根据以下的政府支持作出:由美国航空航天局(NASA)资助的合同号NCC9-165和NNX08BA47A、由美国国家卫生研究院资助的合同号P01-HG000205、由NASA资助的合同号NNX09AQ44A以及由美国国家癌症研究所资助的合同号U54CA143803。政府享有本发明中的某些权利。
[0005]关于序列表、计算机程序或光盘的弓I用
[0006]无。
[0007]发明背景
发明领域
[0008]本发明涉及纳米材料的领域并且特别地涉及纳米孔装置和传感器。特别地，本发明涉及使用纳米尺度的离子电流测量来感测和操纵和感测离子和碳水化合物。
[0009]相关技术
[0010]下文提出关于本发明的某些方面的背景信息，因为它们可能涉及在详细描述中提到的技术特征，但是不一定被详细地描述。即，在本发明中使用的单个部分或方法可以被在下文讨论的材料中更详细地描述，这些材料可以向本领域的技术人员提供进一步的用于制造或使用本发明的如所要求保护的某些方面的指导。下文的讨论不应当被视为对关于本文的任何权利要求的信息或所描述的材料的现有技术效果的相关性的承认。
[0011]纳米孔离子电流调制器
[0012]固态纳米孔作为可以被用于模仿生物通道、用于纳米颗粒的尺寸选择性合成的稳定结构，或作为纳米尺度传感器是很受关注的。圆锥形的或不对称的纳米孔是显示由电压门控的离子电流的一类不同的纳米通道并且可以表现为纳米流体二极管，即它们展示离子电流整流。几个团队已经开发利用跨越含有不对称纳米孔的膜的离子电流测量的电传感器(Harrell, C.C.等人.，Resistive-pulse DNA detection with aconical nanopore sensor.Langmuir22,10837-10843, doi:10.1021 / la061234k(2006)；Kececi, K.,等人.Resistive-pulse detection of short dsDNAs using a chemicallyfunctionalized conical nanopore sensor.Nanomedicine3, 787-796, doi:10.2217 /17435889.3.6.787 (2008) ;Sexton,等人.，Developing synthetic conical nanopores forbiosensing applications.Mol.Bia Syst.3, 667-685, do1:10.1039 / b708725j (2007)；Au, M., 等 人.Biosensing with Functionalized Single Asymmetric PolymerNanochannels, Macromol.BioscLlO, 28-32, doi:10.1002 / mabL200900198 (2010))。这样的装置通常通过径迹蚀刻方法制备。从石英毛细管制造的基于石英的纳米孔展示许多相同的电性质，但是使用激光拉制仪被快速地制备。石英圆锥形纳米孔也被称为纳米吸量管(nanopipette)，展示其他不对称的纳米通道的许多性质，并且是有利的，因为孔可以被使用高空间分辨率操纵，这是已经被用于以纳米尺度使细胞成像的性质。
[0013]使用圆锥形的纳米孔的研究已经产生挑战现有的关于大块材料的观念的新的化学现象和电现象。最近，通过对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜中的圆锥形纳米孔(2至Snm直径)整流而观察到离子电流振荡，并且被归因于由溶解性弱的盐的受电压诱导的浓缩导致在孔中的动态沉淀。在氮化硅或硼硅玻璃的大得多的孔中的电流振荡可以在使用具有不同溶解度的有机分子的两种溶剂的界面处被产生。这些现象提供了实时地并且在纳米尺度电监测诸如沉淀的非平衡事件的新方式。
[0014]纳米孔传感器
[0015]模仿生物通道的稳定性和能力使基于纳米孔的平台是用于研究(生物)分子相互作用的候选者。固态纳米孔是稳定的，其直径可以通过制造过程来控制并且它们可以被集成入装置和阵列中。此外，它们的表面性质可以通过化学官能化被容易地调节，允许开发化学和生物化学响应的纳米孔。基于纳米孔的传感器已经结合有受体，包括蛋白质、DNA、适体、配体和小生物分子，允许多种分析物被靶向。对于许多固态纳米孔传感器的灵敏性来说基本的是离子电流整流(ICR)的性质，其来源于溶液中的离子和带电荷的具有不对称形状的纳米通道或圆锥形的纳米孔的表面之间的选择性相互作用。展示ICR并且被用作传感器的纳米材料包括在聚合物膜中被径迹蚀刻的纳米孔和石英纳米吸量管。在每个情况下，关键的挑战是使用合适的受体的表面改性。
[0016]圆锥形的石英纳米孔也已经为了感测应用被官能化[见，例如，Sa, N.，Fu, V.&Baker, 1.A.“Reversible Cobalt 1n Binding to Imidazole-ModifiedNanopipettes.”Anal Chem.，82，9663-9666，doi:10.1021 / acl02619j (2010) ;Fu，Y.，Tokuhisa，H.&Baker，1.A.“Nanopore DNA sensors based on dendrimer-modifiednanopipettes.” Chem Commun (Comb)，4877-4879，doi: 10.1039Jb91051Ie (2009)；Umehara, S.，Karhanek，M.，Davis, R.W.&Pourmand, N.“Label-free biosensing withfunctionalized nanopipette probes.，’Proceedinqs of the National Academyof Sciencesl06,4611-4616,doi:10.1073 / pnas.0900306106 (2009) ；Actis,P.， Mak， A.&Pourmand， N.“Functionalized nanopipettes:toward label-free，single cell biosensors.”Bioanalytical Reviewslj 177-185，doi: 10.1007 /s12566-010-0013-y (2010) ;Actis，P.，Jejelowo, 0.&Pourmand, N.“Ultrasensitivemycotoxin detection by STING sensors.，，Biosensors and Bioelectronics26，333-337
(2010)]o
[0017]迄今，分析物与纳米孔传感器的可逆结合已经被证明是挑战性的。然而，这是一个关键的问题，如果这样的装置将被用于诸如使用一个传感器连续监测或重复测量的应用的话。单个传感器的多种用途也将克服可再现地产生具有同一尺寸的孔中的问题，这限制了用于在文献中报道的许多传感器的定量测量。对于这样的应用，纳米吸量管是有希望的平台，因为传感器末端可以被以纳米尺度的精确性在样品之间或在单一样品内精确地并且快速地操纵。迄今，对响应pH的官能化的纳米孔已经显示出在快速地可逆的并且选择性的行为方面最好的性质。被咪唑官能化并且响应于钴离子的纳米吸量管可以通过浸没在具有低pH的溶液中被再生,使配体再质子化。(Sa,N.；Fu,V.；Baker,L.A.,Reversible Cobalt 1nBinding to Imidazole-Modified Nanopipettes.Anal.Chem.2010，82(24)，9963-9966)。[0018]经过纳米孔的传输可以被包括电压和压力的多种外部刺激改变(见Lan，1-J.；Holden, D.A.；White, H.S., Pressure-Dependent 1n Current Rectification inConical-Shaped Glass Nanopores.J.Am.Chem.Soc.2011,133(34), 13300-13303.)? 简单地改变跨越纳米孔的盐梯度可以影响传输，并且这种效应被用于聚焦用于电阻性脉冲测量的 DNA(见 ffanunu, M.；Morrison, ff.；Rabin, Y.；Grosberg, A.Y.；Meller, A.，Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a saltgradient.Nat Nano2010，5 (2)，160-165.)。纳米孔还可以被建造以响应于刺激，例如溶剂极性。这可以使用所谓的“毛发状纳米孔”被实现，在其中纳米孔被聚合物装饰(见Peleg，0.；Tagliazucchi, Μ.； Kroger, Μ.；Rabin, Y.；Szleifer, 1., Morphology Control ofHairy Nanopores.ACS Nano2011, 5 (6)，4737-4747.)。多种人造的纳米孔已经使用表面改性被建造以用于PH灵敏性。圆锥形的纳米孔已经被用于结合其他的带电荷物质的受体而改性，其同样地调制电流整流。靶已经包括核酸、金属离子、蛋白质和小分子。在大生物分子例如核酸和蛋白质的情况下，孔的物理堵塞可能类似地起作用，除了表面电荷的调制。迄今，电流整流使用小的没有电荷的物质的调制已经被证明是困难的。然而，这样的体系将把用于响应性纳米孔的刺激扩展至包括药物、肽和碳水化合物。
[0019]葡萄糖/ 二醇感测
[0020]碳水化合物识别对于血糖的监测来说基本的(Kondepati,等人.Anal.Bioanal.Chem.388，545-563 (2007)。碳水化合物的检测和定量还可以被在生物过程监测中使用以及用于基于代谢糖、核酸或糖蛋白的医疗诊断(Timmer,等人.Curr.0p.Chem.Biol.11,59-65(2007)。大多数的用于测量葡萄糖的电化学方法依赖于氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶(Oliver,等人.Diabetic Med.26，197-210 (2009)。最普遍的人造受体使用硼酸，硼酸已经最主要地被用于光学探针(Mader&Wolfbeis, MicrochimicaActal62，1-34(2008)。用于葡萄糖的电化学测量的非酶的方法也已经被开发，大多数依赖于葡萄糖的氧化(Park,等人.Anal.Chim.Acta556, 46-57 (2006) ;Ε.T Chen, Nanoporestructured electrochemical biosensors, US2008 / 0237063)。
[0021]迄今，在文献中几乎没有关于响应于碳水化合物的纳米流体孔的报道。纳米孔分析学已经被用于使用电阻性脉冲方法检测小分子，但是该技术通常更适合于蛋白质和其他的大分子。在MW500至10，000的数量级的寡糖已经使用α溶血素孔的电阻性脉冲技术被辨别。
[0022]被受体改性的纳米孔的一个实例与共价地附接的HR酶共同使用，共价地附接的HR酶然后超分子地共轭于Con A，Con A是与HR分子上的甘露糖单元互相作用的糖结合蛋白(Ali,等人.Nanoscale3, 1894-1903 (2011)。单糖(半乳糖和葡萄糖)的加入与ConA竞争，改变经过孔的离子电流。两个最近的实例利用硼酸作为化学受体，其中受体被共价地附接于人造的纳米孔的壁(Sun, Z.；Han, C.；ffen, L.；Tian, D.；Li, H.Jiang, L., pHgated glucose responsive biomimetic single nanochannels.Chem.Commun.(剑桥，英国)2012.；Nguyen,Q.H.；Ali,M.；Neumann,R.；Ensinger,ff.,Saccharide / glycoproteinrecognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid.Sensorsand ActuatorsB =Chem ical2012, 162 (I), 216-222.)。在前者的情况下，酸性溶液被需要以逆转糖结合并且恢复信号。在后者中，可逆的结合未出现。
[0023]虽然有在纳米孔制造和表面化学中的许多最新的进展，但是上文引用的工作显示出具有对用于使用碳水化合物作为外部刺激来调制离子电流的新方案的需要。这个问题可以使用能够与纳米孔界面连接的新的官能化材料解决。
[0024]特别的专利和公布
[0025]Karhanek等人在于2010年3月25日公布的美国专利申请公布2010 / 0072080中公开了包括具有在其上的用于生物分子的检测的肽配体包括肽和蛋白质的纳米吸量管的方法和装置。
[0026]Siwy等人在于2010年5月4日授权的美国专利7，708，871中公开了具有用于控制带电荷的颗粒在电解质中的流动的纳米器件的设备。这样的设备包括被聚合物膜箔分割以用于控制带电荷的颗粒在电解质中的流动的电解槽容器。
[0027]Sa 等人在 Analytical Chemistry2010, 82 (24),第 9963-9966 页中公开了由咪唑封端的硅烷改性的石英纳米吸量管响应于溶液中的金属离子(Co2+)。纳米吸量管的响应通过离子电流整流比的检查来评估。当纳米吸量管在具有不同PH的溶液之间循环时，被吸附的Co2+被从纳米吸量管表面释放，以再生纳米吸量管的结合位点。
[0028]Umehara等人在Proceedings of the National Academy of Sciences, IO6卷，第4611-4616页，2009年3月24日中公开了使用已官能化的纳米吸量管电极的无标记的实时蛋白质测定。在纳米吸量管末端表面上的静电的生物素-链霉亲和素和抗体-抗原相互作用被显示出影响流过50-nm孔的离子电流。
[0029]Umehara 等人“Current Rectification with Poly-L-1ysine Coated Quartznanopipettes,’^Nano Lett.6 (11):2486-2492 (2006)公开了使用在浴溶液中的纳米吸量管的未被涂覆的纳米吸量管和被聚-1-赖氨酸涂覆的纳米吸量管的电流响应。
`[0030]Karhanek M., Kemp J.T., Pourmand N., Davis R.W.和 Webb C.D, “Single DNAmolecule detection using nanopipettes and nanoparticles，^Nano Lett.2005 年 2 月；5⑵:403-7公开了被纳米颗粒标记的单个DNA分子可以通过离子电流的阻塞被检测，因为它们通过被拉动的玻璃毛细管形成的纳米吸量管末端移位。所公开的装置使用电压钳电路，其利用在浴中的单一的检测电极检测纳米颗粒-DNA电流堵塞。
[0031]Ying, Liming 在 Biochemical Society Transactions, 37 卷，702-706 页，2009 中综述了纳米吸量管和它们在离子、分子(包括生物分子)和细胞的纳米感测和纳米操纵中的用途。
[0032]Borghs,Gustaaf等人在于2006年I月5日公布的W02006 / 000064中公开了用于控制载荷子经过延伸穿过膜的纳米孔的流动的纳米流体装置。
[0033]Sunkara等人在于2005年11月24日公布的美国专利申请公布2005 / 0260119中公开了使用微波等离子辅助的化学气相沉积方法合成被称为纳米吸量管的呈锥形晶须形式的管状碳纳米结构的方法。
[0034]Chen 的于 2008 年 10 月 2 日公布的名称为 “Nanopore structuredelectrochemical biosensors, ”的美国20080237063公开了用于直接测量葡萄糖的生物传感器，该生物传感器附接了具有纳米孔结构和催化活性的环糊精。
[0035]Choi 等人 “B iosensing with conical Iy shaped nanopores andnanotubes, ” Phys.Chem.Chem.Phys.8:4976-4988 (2006)讨论了使用径迹蚀刻工艺合成的圆锥形的纳米孔的制备和表征。还公开了能够整流在外加的跨膜电位下流过这些孔的离子电流的圆锥形纳米孔的设计和功能。
[0036]Li 等人 “Development of boronic acid grafted random copolymer sensingfluid for continuous glucose monitoring, ^BiomacromoleculeslO(I):113-118(2009)公开了用于基于粘性的葡萄糖感测的生物相容共聚物聚(丙烯酰胺-无规-3-丙烯酰氨基苯基硼酸)(PAA-无规-PAAPBA)。
[0037]Sun, Z.；Han, C.；ffen, L.；Tian, D.；Li, H.；Jiang, L., pH gated glucoseresponsive biomimetic single nanochannels.Chem.Commun.(剑桥，英国)(2012)描述了在被苯基硼酸受体共价地改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的被径迹蚀刻的圆锥形的纳米通道。
[0038]Nguyen, Q.H.；Ali, Μ.；Neumann, R.；Ensinger, ff., Saccharide / glycoproteinrecognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid Sensorsand Actuators B:Chemical2012, 162 (I), 216-222.)描述了在被苯基硼酸受体共价地改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的被径迹蚀刻的圆锥形的纳米通道。通道响应于单糖以及糖蛋白。
[0039]发明概述
[0040]以下的概述不意图包括本发明的所有特征和方面，其也不意味着本发明必须包括在本概述中讨论的所有特征和方面。
[0041]本发明在某些方面涉及用于在检测样品中的分析物的设备中使用的纳米吸量管，包括:毛细管部分，其界定所述纳米吸量管的通向纳米孔开口的内部孔隙；所述内部孔隙适于在其内容纳电极并且适于容纳经过所述纳米孔与外部溶液连通的内部溶液(对于电极构型，见例如图1，其中孔隙是长形的并且成锥形至开口)；以及在所述纳米孔的内表面上的涂层，其包含:聚合电解质，其被直接地结合于(即接触)所述内表面(通常是石英)；以及结合分子，其被连接于所述聚合电解质，特异性地结合选自由离子或小分子组成的组的分析物。
[0042]在本发明的某些方面，被连接于聚合电解质的结合分子可以是硼酸用于感测葡萄糖，和/或聚合电解质可以是聚阳离子，由此涂层的电荷改变；和/或聚合电解质可以是聚烷基吡啶或聚胺。
[0043]在本发明的某些方面，聚合电解质/感测分子被施用于纳米孔，从而延伸入纳米孔中并且部分地堵塞纳米孔，把更多的感测分子暴露于样品。
[0044]在本发明的某些方面，结合分子是被连接于聚合物或聚合电解质涂层的螯合剂。聚合物涂层可以还包括在吸量管孔隙和离子结合聚合物(ion binding polymer)之间的聚合电解质层。层可以呈涂层的形式，并且优选地是连续的，由此未修饰的季铵化合物(barequart)被覆盖。在某些实施方案中，螯合剂可以是为多糖例如壳聚糖(一种线性多糖)的离子结合聚合物。在某些实施方案中，螯合剂可以是多肽。在某些其他的实施方案中，涂层可以包含糖结合分子。在某些实施方案中，糖结合分子可以是蛋白质，例如凝集素。在某些实施方案中，糖结合分子包括硼酸或硼酸酯类。
[0045]在另外的实施方案中，本发明包括用于感测碳水化合物分子，特别地具有顺式二醇基团的碳水化合物，并且更特别是葡萄糖，的纳米吸量管装置。装置可以包括承载纳米孔的惰性基体，其中纳米孔包括通道。在某些方面，通道是石英纳米通道。在某些方面，惰性基体界定被经过通道到达的内部部分和用于与样品接触的外部部分。在某些方面，纳米孔还包括在通道内的聚合物涂层，所述聚合物被联接于碳水化合物结合分子(“CBM”，例如硼酸)。在某些方面，纳米孔还包括被联接于所述CBM的聚合物，其中CBM被内嵌在聚合物内以形成在通道内的半渗透的基质。
[0046]装置使用测量电路被操作，其中在纳米孔处的离子条件的离子电流整流通过结合葡萄糖分析物来调制。在一个优选的实施方案中，将糖结合于聚合物联接的硼酸导致离子整流的逆转。因此，装置可以包括用于产生经过通道的电流并且测量经过通道的电流的改变的电子电路，由此所述样品中的碳水化合物分子结合于所述CBM，产生测量到的电流改变，电流改变表明样品中存在碳水化合物。
[0047]在某些方面，本发明包括纳米吸量管测量电路，其包括具有内部电极的纳米吸量管、用于容纳内部溶液的孔隙、用于外部溶液的容器以及在内部电极和适于并且被定位为与外部溶液接触的外部电极之间的测量电路，其中测量电路包括用于在所述内部电极相对于外部电极之间输送可逆的电压差的放大器，并且还包括用于测量孔隙和外部溶液之间的电流的检测器。
[0048]本发明的某些方面涉及用于通过组合溶液即纳米尺度反应器中的两种不同的离子产生离子化合物的方法，包括以下步骤:提供在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的至少一种第一离子，所述纳米吸量管在所述纳米吸量管的内部和外部溶液之间具有纳米孔；提供在所述外部溶液中的第二离子物质；以及把横跨具有相反电荷的所述纳米孔的电压施加于在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的所述一种离子，所述电压足以导致所述离子物质向所述纳米孔迁移以与所述第二离子反应以形成所述离子化合物。在某些实施方案中，指示离子化合物的形成的电流的改变可以是振荡。
[0049]在某些方面，本发明的方法还包括测量经过所述纳米孔的离子电流并且检测指示所述离子化合物的形成的电流的改变的步骤。
[0050]在某些实施方案中，所述离子化合物是不可溶解的。方法可以还包括在沉淀物形成之后逆转所述电压的步骤。
[0051]第一或第二离子可以是与阴离子反应以形成离子化合物的金属离子。金属可以是过渡金属。金属离子来自由以下组成的组:Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr6+、Cd2+、Mo2+、Co3+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Al3+、Al2+、Ar3+、Ar3-以及 Pb2+。阴离子可以来自由以下组成的组:磷酸根、氯离子、硫酸根、单磷酸根、焦磷酸根、偏磷酸根、三聚磷酸根、四偏磷酸根以及正磷酸根。在某些实施方案中，阴离子可以选自由有机羧酸阴离子组成的组，所述有机羧酸阴离子选自由以下组成的组:葡糖酸根、酒石酸根、富马酸根、马来酸根、丙二酸根、苹果酸根、乳酸根、柠檬酸根、EDTA、柠康酸根、柠苹酸根、硬脂酸根、油酸根、月桂酸根、辛酸根、抗坏血酸根、吡啶甲酸根以及乳清酸根。在某些其他的实施方案中，阴离子可以是蛋白质。
[0052]在某些方面，本发明涉及把离子从纳米吸量管内侧递送入外部溶液中的方法，包括:提供在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的至少一种第一离子，所述纳米吸量管在所述纳米吸量管的内部和外部溶液之间具有纳米孔；以及把横跨具有相反电荷的纳米孔的电压施加于所述第一离子，所述电压足以导致离子跨越纳米孔的迁移。[0053]附图简述
[0054]图1是电化学装置和将二价铜离子可逆地结合在传感器上的示意图，该传感器被官能化以把二价铜离子特异性地结合在纳米吸量管的内部附近，邻近末端。
[0055]图2是如图1中的电化学装置的示意图，其中在纳米孔处形成沉淀导致离子电流的可测量的堵塞。
[0056]图3是示出了在用于测量沉淀的纳米吸量管设置中的电流振荡的图，使用在浴中的2微摩尔的氯化锌和_350mV的电势。插图:其中一个打开状态的放大图。
[0057]图4是示出了来自将如在图1中的108处示出的被施加的离子结合表面改性(调钙蛋白/ PAA / PLL)的数据的IV曲线图，并且示出了纳米吸量管生物传感器的离子灵敏性。实线——未修饰的吸量管；虚线——PAA2 ;三角形——CaM。
[0058]图5A是示出了传感器CaM-1的表面的整流系数的图。
[0059]图5B是图5A的传感器的电流轨迹。
[0060]图6是示出了未修饰的纳米吸量管(三角形)和被壳聚糖/ PAA改进的纳米吸量管传感器(圆形)的pH响应的图。
[0061 ] 图7是示出了在pH3和7下整流系数的变化相对于沉积的壳聚糖/ PAA层数的图。
[0062]图8是示出了未修饰的纳米吸量管(三角形)和壳聚糖/ PAA传感器(圆形)的pH响应的图。
[0063]图9是示出了在各种条件下的离子电流的图，指示使用在0.1M KCl，10mM磷酸盐缓冲溶液中的壳聚糖官能化传感器的效果。
[0064]图10是示出了在传感器的回收之后的整流系数的变化的图。Cu2+浓度:100 μ M。传感器通过把传感器浸没入ΡΗ3溶液中60秒被再生。
[0065]图11是示出了传感器对在0.1M KCl，IOmM Tris-HCl，ρΗ7中的各种浓度的Cu2+的响应的轨迹。在I / ^和I / Cw (未示出)之间的线性拟合被计算(R=0.997)。离子电流由施加于纳米吸量管圆筒中的电极的_500mV的电势确定。
[0066]图12是描绘关于二价铜离子与纳米吸量管的相互作用的电泳的作用的动画图。
[0067]图13是示出了输出电流的轨迹，箭头指示Cu2+离子的加入(溶液中的最终的浓度150 μ Μ)。在施加正电压时没有检测到改变，但是在切换至导致之后的正的步骤发生变化的负电势时发生立即的响应。
[0068]图14是因从在纳米吸量管的末端处的纳米孔清除沉淀物引起的离子电流振荡的动画图图示。
[0069]图15Α是在把负电势施加于被磷酸盐缓冲液(ρΗ7)填充并且被浸没在Tris-HCl缓冲液(ΡΗ7)与2微摩尔的氯化锌的浴中的吸量管时的振荡的图。
[0070]图15Β是示出了在高电导和低电导的状态中的来自图15Α的事件的直方图。
[0071]图16是示出了用于纳米吸量管的改性的阳离子型聚合电解质的合成的图示。聚阳离子由烷基骨架上的吡啶基重复单元代表。
[0072]图17是示出了使用硼酸直接二步骤官能化石英表面172的示意图。
[0073]图18Α、18Β和18C是示出了纳米孔的端视图并且图示用于受体固定于纳米孔的三种方法的一系列图。图18Α示出了受 体直接共价附接于纳米孔壁。图18Β示出了官能化聚合物吸附于孔壁，其中受体被连接于聚合物。图18C示出了三维的官能化基质固定在孔内侦牝其中聚合物上的受体形成跨越纳米孔的网格状的网络，即涂层延伸入所述纳米孔中并且部分地堵塞所述纳米孔。
[0074]图19A、19B和19C是示出了对照和用pH7磷酸盐缓冲液中的葡萄糖(3mM)官能化的吸量管的响应的一组图。吸量管被3-氨基丙基三乙基氧基硅烷和随后的间溴甲基苯基硼酸官能化。插图:从在+500和-500mV的离子电流计算的整流系数。图19A是示出了未被改性的吸量管的离子电流响应的图；图19B是示出了被硼酸改性的吸量管的离子电流响应的图，并且图19C是示出了在图19A和B中示出的吸量管系统的整流的图。
[0075]图20是示出了 PVP-BA在单糖存在下的沉淀的柱状图。PVP-BA在甲醇/水中在PH2的搅拌溶液被使用氢氧化钠滴定，直到沉淀发生。误差柱示出了来自三次单独实验的标准偏差。
[0076]图21是示出了在I微摩尔的聚合物浓度的聚合物PVP-BA和PVP-Bn的存在下ARS的吸光度的改变的图。染料溶液是在1:1甲醇/水中0.25mM。
[0077]图22是示出了在ARS存在下的离子渗透性的调制的IV曲线图。被聚合物PVP-BA内嵌的纳米吸量管被浸没在含有0、60、或360 μ M ARS的ρΗ9.5碳酸盐缓冲液中。误差柱示出了来自重复的电压斜线上升的标准偏差(Ν=5)。
[0078]图23是示出了果糖的离子电流整流的逆转的图。电流-电压曲线用于没有和有IOmM果糖的在ρΗ9.5的被PVP-BA内嵌的纳米通道。
[0079]图24是示出了在有和没有果糖时在-0.5V测量的离子电流调制的顺次循环的图。误差柱示出了来自重复的电压扫描的标准偏差(Ν=5)。平衡时间是在每个条件5分钟。
[0080]图25是示出了对于三个单独的纳米吸量管传感器的可逆的离子电流整流值的图。传感器被浸没在有或没有果糖(IOmM)的碳酸盐缓冲液(ρΗ9.5)中。在254示出了在缓冲液中传感器SI的正的整流。在252示出了在果糖中传感器SI的负的整流。
[0081]图26是示出了在溶液相荧光测定中使用PVP-BA的果糖的结合等温线的线图。
[0082]图27是如在图26中示出的使用改性的圆锥形纳米通道的电化学方法的数据的图。图26和27通过果糖滴定到具有25%甲醇的ρΗ9.5碳酸盐缓冲液中的含有PVP-BA (0.003% w / V)和HPTS (1.5 μ Μ)的探针溶液中来生成。误差柱示出了来自三次单独滴定的标准偏差。图B示出了对于被PVP-BA内嵌的圆锥形纳米通道在电势_500mV的离子电流，使用果糖的在碳酸盐缓冲液中增加的浓度。误差柱示出了来自5个顺次电压扫描的标准偏差。数据点被拟合至结合等温线，如在实验部分中描述的。
[0083]优选实施方案的详细描述
[0084]综述
[0085]本发明涉及纳米孔装置，即纳米吸量管，其被包括在电化学传感器中。装置被配置为容纳包括第一电极的内部区，并且被配置为与包括另一个电极的外部溶液接触。这些电极被连接于感测电路，在纳米孔发生的现象可以在感测电路中被检测和测量。在优选的实施方案中，纳米孔是纳米吸量管的一部分，如例如在上面来自同一个受让人的参考文献US2010 / 0072080中描述的。术语“纳米”是指将具有在<200nm的数量级的直径的孔隙内和伴随的零件例如内部电极的尺寸。本发明的尺寸对于产生在下文详细地描述的电化学行为来说是重要的。
[0086]本发明还涉及可以结合和检测小的离子例如H+和金属阳离子以及二醇(在下文讨论的)的结合的可逆的离子传感器。可逆的传感器是就逆转传感器腔(即纳米吸量管的孔隙)内的极性而言是可逆的并且，重要地是，在于离子被以可逆的方式结合于纳米孔。本发明的装置可以被用于导致离子在传感器内迁移以及迁移离开传感器纳米孔，该传感器优选地呈纳米吸量管的形式。离子在吸量管内的结合可以通过吸量管末端浸没在没有结合离子的溶液中被逆转。小的离子的结合也可以通过改变溶液中的条件例如PH被释放。本发明还涉及基于纳米吸量管的可逆的离子迁移装置。这样的离子迁移可以由纳米吸量管内侧相对于外部溶液的电压电势的改变来引起。离子迁移可以被用于引发因离子迁移离开纳米吸量管的孔隙而在外部溶液中产生过量的离子所导致的沉淀。沉淀发生在纳米吸量管的纳米孔末端的附近并且可以在早期阶段通过在末端处经过纳米孔的电流振荡的改变被检测。沉淀造成经过纳米孔末端的离子电流发生改变，这由内部和外部溶液之间所施加的电压电势引起。以小的离子浓度和小的沉淀物尺寸来检测沉淀可以被应用于多种体系。例如，可以使用少量的蛋白质就检测到蛋白质结晶。
[0087]本发明的传感器技术依赖于可以以无标记的方式转导在官能化的纳米吸量管的末端处的结合事件的简单的电化学读出器。纳米吸量管末端的高阻抗约束装置的灵敏度，使末端孔口的尺寸和几何构型对于传感器性能来说是关键的。此外，本发明的传感器技术可以被容易地与压电致动器集成以产生具有高空间分辨率的传感器。当纳米吸量管接近表面时，经过吸量管的离子电流将由于“电流挤压”而减小，其是熟知的效应，在扫描离子电导显微镜(SICM)中很好地利用了该效应。除了感测之外，基于纳米吸量管的平台已经被用于研究单分子生物物理学，用于在单细胞内受控地递送分子以及用于在纳米尺度使细胞成像。
[0088]在某些实施方案中，本发明的装置示出了用于采用在固态纳米孔中沉淀来引起和/或测量电流振荡的新机制。该技术可以被用于主动地引导离子迁移至两种溶液在纳米吸量管的末端处的界面。因为孔仅在阈值电位下受到堵塞，所以反应可以在时间上和在空间上被控制。这样的沉淀可以使用多种离子被进行。这种控制和测量纳米尺度的盐沉淀的动力学的能力使用于研究动力学过程例如生物矿化和溶解的新技术成为可能。通过电压振荡在纳米反应器内捕获沉淀物是用于研究纳米颗粒的尺寸和表面电荷的另一种工具。不可溶解的盐的受控的纳米沉淀在开发选择性的且灵敏的离子传感器方面也是有价值的。下文描述的反应能够检测少至2微摩尔的盐，并且不被存在的其他阳离子影响。例如，低浓度(最多2μΜ)的硫酸锌盐被检测到并且不被其他的阳离子例如钾或镁的存在影响。此外，被沉淀堵塞的纳米孔通过振荡电势被疏通的能力可以扩展使用纳米孔感测的应用。例如，恒电压可以被用于检测纳米沉淀物，并且振荡电势可以被用于测量离子电流以用于其他的感测应用。
[0089]本发明的方法可以被在多种蛋白质结晶方法中使用。不同的结晶方法被用于使蛋白质溶液过饱和，通常通过逐渐降低蛋白质的溶解度。在蛋白质结晶中用于降低蛋白质溶解度的最常见的方式是通过添加沉淀剂例如聚乙二醇和硫酸铵。沉淀剂在其浓度被增加时结合水，例如通过使用蒸气扩散的方法。因此用于蛋白质的溶剂的量被减小，这基本上意味着蛋白质的浓度被增加。在某个有效的蛋白质浓度，蛋白质将开始沉淀，产生晶体，如果条件适当的话。适当的结晶条件，包括合适的pH、离子强度、温度、蛋白质浓度、各种盐、配体或添加剂的存在、沉淀剂的类型和实际的结晶方法(悬滴、坐滴、透析等等)的组合，是实际上不可能事先预测的；因此，使用不同条件的结晶筛已经被开发。本发明的装置可以被在多种平行实验中采用以测试不同的蛋白质结晶条件的效果。
[0090]本发明的方法的另一个应用是在分析离子感测的领域中。被认为是第一次的，化学官能化的固态纳米孔的分析应用被示出用于离子感测。外加电压的频率和波形被发现是可调整的以最大化信噪比，显示外加电压可以触发Cu2+结合在传感器上。在时间上和在空间上引导分子结合的能力允许开发能够研究分析物-受体相互作用的热力学和动力学性质的精密的生物感测装置。
[0091]本文公开的生物传感器显示出在整流纳米孔中的选择性的和可逆的结合。这种类型的可逆传感器克服了与制造基于ICR的传感器中具有一致的孔结构的纳米孔相关联的挑战。监测聚合电解质层的沉积有效地确保进一步的化学改性被局限于ICR是最灵敏的孔处。进一步的实验和理论模型以及表征纳米孔表面的先进方法将被需要以确定聚合电解质向孔中渗透多远并且进一步探索在本体溶液和外部的纳米吸量管孔的界面处的相互作用。在该领域中的进展将推进纳米孔传感器作为分析工具的使用。可逆的纳米吸量管传感器，例如在此描述的那些，可以被用于水品质的监测、离子浓度在纳米尺度的空间分辨(功能绘图)或特定分析物的连续的细胞内测量。
[0092]本发明的装置适用于葡萄糖感测，如可能被具有糖尿病的风险的受试者需要的。它们可以被构建为可以被应用于来自需要葡萄糖监测的受试者的全血或甚至在需要葡萄糖监测的受试者中的全血的便携式装置。即，例如，石英纳米吸量管末端可以穿透皮肤以接触在真皮附近的体液中的葡萄糖。
[0093]本发明的葡萄糖感测装置优选地采用被结合于受体例如硼酸(用于糖的受体)的聚合物并且混合物被施用于纳米吸量管的内表面，在末端(纳米孔)处或末端附近。糖结合聚合物混合物最优选地具有以下的性质:1)聚合物是带正电荷的从而增加与带负电荷的孔壁的相互作用。2)聚合物的每个正电荷将具有约一个硼酸，导致聚合物在转化成硼酸盐形式时中和。3)聚合物在有机溶剂中是可溶解的但在水介质中是不可溶解的，使得聚合物可以被捕获在纳米吸量管的末端中。4)由聚合物形成的不可溶解的基质对水、离子和分析物是可渗透的。5)不应当为了逆转传感器中的信号调制而需要改变溶剂或介质。
[0094]可渗透基质的方法被认为优于其他的纳米孔官能化方法，因为纳米孔的整个容积而不是仅孔壁容纳受体。被聚合物结合的受体(例如硼酸)与行进经过纳米孔的离子将具有更大的相互作用，并且因此在分析物的存在下给予更高的信号调制。此外，许多聚合物在分析物结合时经受构象的改变，这可以进一步增强离子电流调制。最后，重要的是注意，分析物不需要被电场驱动经过孔-而是分析物被动扩散经过聚合物基质将调制电信号。这些特征把固定化的聚合物网络与受体的共价附接或官能化聚合物的逐层沉积区分。基于聚(4-乙烯基吡啶)(PVP)的体系被选择，如下文描述的。
[0095]如在下文详细描述的，在其中容纳硼酸葡萄糖受体的官能化聚阳离子被内嵌在石英纳米通道中的纳米吸量管装置被制造。之前为了使用硼酸直接地改性纳米通道(即纳米孔)的壁的努力已经导致对糖的适度的响应，但是存在应当提供对离子电流更大控制的基于硼酸的受体的几个方面。第一，硼酸结合到碳水化合物是完全地可逆的，并且没有证据表明在纳米通道中也是这样。更重要地，硼酸在中性碳水化合物的存在下可以经受静电荷的改变，这种改变应当很大地影响纳米孔中的电流整流。为了利用这些性质用于工程纳米通道，基于聚(4-乙烯基吡啶)的阳离子型聚合物被选择作为硼酸受体基质(图26)。对于每个正电荷，聚合物的烷基化精确地产生一个硼酸。阳离子型聚合物可以基于静电相互作用被固定化于石英纳米吸量管，静电相互作用是可以基于整流被监测的相互作用。
[0096]硼酸，如在此使用的，是简单的人工受体，它们结合糖的能力已得到确认。硼酸有几个性质可以被利用来制造传感器和致动器。在结合I，2- 二醇(例如I，2- 二羟基苯、乙二醇)时，硼酸的路易斯酸性被增强。例如，苯基硼酸与儿荼酚(1，2_苯二醇)形成与带负电荷的硼物质平衡的络合物(见Artificial Receptors for Chemical Sensors,由 VladimirM.Mirsky、Anatoly Yatsimirsky、Wiley-CH 编辑,第 6 章(2011))。因此，如果 pKa 被移至低于缓冲介质的PH的值，那么碳水化合物的结合导致硼酸转化成阴离子型硼酸酯。迄今被报道的使用硼酸的探针和传感器中的许多是基于荧光的。然而，因为硼酸的多功能性，这种受体也已经被用于碳水化合物分离、基于聚合物材料的溶胀的光学传感器以及电化学传感器。结合中性的糖可以实现硼酸电荷的改变的事实使这种受体是用于工程化响应性的纳米流体二极管的极佳候选者。
[0097]纳米通道内的改性的纳米孔显示出来源于聚合物的阳离子电荷的强的整流，一种可以在中性碳水化合物的存在下被逆转的整流。纳米通道显示出使用果糖的毫摩尔的浓度的可逆的行为。表征溶液中的聚合物的能力显示出取决于1，2-二醇与硼酸的相互作用以及静电荷的结合模式。已改性的纳米通道显示出对阴离子型的含儿荼酚的染料、硫酸茜红(ARS)的特别高的灵敏度，具有使用仅60 μ M染料时的整流的消除。重要地，离子渗透性的调制不依赖于限制离子电导性，而是依赖于因静电荷改变整流的极性。这个应用将使独立于电压的用于调制经过纳米通道的离子流的新技术成为可能。
[0098]定义
[0099]除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的意思。虽然相似或等同于本文描述的那些的任何方法和材料可以被在本发明的实践或测试中使用，但是优选的方法和材料被描述。通常，关于细胞和分子生物学和化学利用的命名法以及细胞和分子生物学和化学的技术是本领域中熟知的并且普遍地使用的那些。某些实验技术，不特别地限定，通常根据本领域中熟知的并且如在本发明的说明书全文中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中描述的常规的方法被进行。为了清楚性的目的，以下的术语在下文被定义。
[0100]术语“直王”意指其中电子总数不等于质子总数，给予其净的正电荷或负电荷的原子或分子，术语具体地是指原子的或单原子的离子，如果离子由单个原子组成的话，以及是指小分子的多原子的离子。
[0101]术语“小分子”意指具有小于约1，000原子质量单位或在某些实施方案中小于200原子质量单位的分子量的化合物。小分子不包括高于该大小限制的多元核酸或多肽，但是包括在细胞中通常发现的其他小分子。以实例的方式，腺嘌呤是约135原子质量单位；葡萄糖是约180原子质量单位；尿素是约60原子质量单位；肌酸酐是约113原子质量单位。
[0102]术语“纳米吸暈管”意指具有纳米尺度的圆锥形末端开口即纳米孔的中空的、自支撑的、惰性的、非生物的结构，其具有0.05nm至约500nm，优选地约(+或-20% ) 50nm或约80nm或约IOOnm的末端开口。中空的结构可以是例如玻璃或石英，并且适于在其内侧容纳被传递经过末端开口的流体。纳米吸量管的内部被选择或修改以最小化分析物的非特异性结合。纳米吸量管的内部典型地呈长形的圆锥体形式，具有石英或其他的生物学上惰性的材料的单层的均一的壁厚度，并且被控制大小以允许插入接触纳米吸量管中的溶液的电极。在本文中使用的纳米吸量管典型地具有单个孔隙，但是具有多个同心孔隙的纳米吸量管可以通过拉动二孔隙毛细管被制备。末端区中的外径典型地是小于约I μ In。
[0103]术语“纳米孔”意指在电绝缘的膜中的小的孔洞，优选地纳米吸量管的末端，如描述的。纳米孔将在末端区中，末端区是纳米吸量管孔隙的毗邻于纳米孔的最后的几mm。纳米孔，如下文描述的，被控制大小，使得小的分子络合物将影响离子和分子经过纳米孔的运动。纳米孔被设计为在监测当电压被施加跨越膜时经过纳米孔的离子电流的装置中起作用。纳米孔将具有被纳米吸量管主体形成的通道区，并且，优选地，将具有锥形的例如截头锥的构型。通过拉动石英毛细管，如下文描述的，可再现的并且被限定的纳米孔形状可以被获得。
[0104]术语“整流”意指当带电荷的纳米孔使用不对称的输出电流响应于对称的输入电压时的效应。当扩散双电层厚度与孔径是差不多时，纳米孔表面上的固定的带电荷物质和溶液中的离子物质之间的静电相互作用改变纳米吸量管的选择通透性。整流系数r被定义为在特定的正电压下测量的电流和在相同的但具有相反极性的电压下测量的电流之间的比的对数，即r = Log10I+ / 1-。
[0105]该系数是纳米吸量管的整流性质的以及因此在传感器表面上的固定的电荷的有用的指示物。石英纳米孔是带负电荷的，显示出负的整流(r〈0)。整流可以通过使用带电荷的官能化层例如聚L-赖氨酸、树枝状大分子、氨基硅烷和壳聚糖改性的纳米孔表面被逆转(r>0)。
[0106]术语“纳米吸暈管设备”意指被操作性地连接于电流检测电路并且适于接收与纳米吸量管和任何参比电极接触的样品流体的纳米吸量管。
[0107]术语“电流检测电路”意指用于检测电流和/或电压并且把其施加在电路，例如被连接于如本文描述的纳米吸量管和参比电极的电路，中的装置。电路可以包括任何用于基于10-10000微微安的基准电流检测电流在1-100、10-100或1-10微微安数量级的改变的灵敏性装置。术语另外地是指是时间响应性的并且相对独立于温度的或允许温度的改变被补偿的电路。其应当具有在提供已知电压的电路中的输入。灵敏的检测电路是已知的，包括电压钳放大器和跨阻抗放大器。术语“电压钳”在此是指利用具有被连接于可变命令电压的一个输入部、被连接于测量到的电压的另一个输入部以及反馈电路的差分放大器的电路。电压钳使用负反馈把体系保持在命令电压，命令电压在这种情况下是预确定的交流信号，例如来自信号发生器的交流电压信号。输出电流遵从输入电压的改变并且电流的小的改变可以被检测到。
[0108]术语“五英”意指纳米吸量管介质是熔凝硅石或无定形石英，其是比结晶石英的成本低。然而，结晶石英可以被利用。陶瓷和玻璃陶瓷和硼硅玻璃也可以被利用，但是精确度不如石英好。术语“石英”意图并且被定义为包括专门的材料以及适用的陶瓷、玻璃陶瓷或硼硅玻璃。应当注意，各种类型的玻璃或石英可以在本发明的纳米吸量管制造中被使用。主要的考虑是材料的被拉动至窄直径的开口的能力。优选的纳米吸量管材料基本上由二氧化硅组成，如被以各种类型的玻璃和石英的形式包括的。熔融石英和熔凝硅石是主要地含有无定形(非晶的)形式的二氧化硅的玻璃的类型。[0109]术语“电解质”意指含有电解质固体即自由离子的材料。典型的离子包括钠、钾、钙、镁、氯、磷酸根和碳酸氢根。其他的离子物质可以被使用。材料通常将是液体，其将包含含有分析物的样品以及在溶液中的离子。样品本身可以是电解质，例如人血浆或其他的体液、水样品等等。电解质应当输送离子电流；约IO-1OOmM,优选地约IOOmM的正的和负的离子物质被认为是为了这个功能所需要的。本发明的装置可以在纳米吸量管内部中和在样品材料中采用相同的或不同的电解质。
[0110]术语“聚合电解质”在本文中以其常规的意义被使用，即其重复单元具有电解质基团的聚合物。这些基团将在水溶液(水)中离解，使聚合物带电荷。聚合电解质的性质因此相似于电解质(盐)和聚合物(高分子量化合物)二者，并且有时被称为聚盐。相似于盐，它们的溶液是导电性的。相似于聚合物，它们的溶液经常是粘性的。带电荷的分子链普遍地在软材料体系中存在，在决定各种分子组合的结构、稳定性和相互作用中起基本的作用。聚合电解质包括含有带电荷的官能团和合成聚合物的生物聚合物。生物源的聚合电解质的实例包括但不限于寡核苷酸类、核酸、蛋白质、肽、诸如果胶的多糖、角叉菜胶、藻酸盐和壳聚糖。合成聚合物的实例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚苯乙烯磺酸钠、聚丙稀酸等等。
[0111]聚合电解质上的电荷可以直接地来源于单体单元或它们可以通过前体聚合物上的化学反应被引入。例如，聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(“PDAD”)通过聚合二烯丙基二甲基氯化铵被制造，二烯丙基二甲基氯化铵是带正电荷的水溶性乙烯基单体。带正电荷的共聚物PDAD-共-PAC (即聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚丙烯酰胺共聚物)通过二烯丙基二甲基氯化铵和丙烯酰胺(在聚合物中保持中性的中性单体)的聚合被制造。聚苯乙烯磺酸可以通过中性聚苯乙烯的磺化被制造。聚苯乙烯磺酸也可以通过聚合带负电荷的苯乙烯磺酸盐单体被制造。
[0112]各种包含聚阴离子的聚合电解质可以在本发明中使用。弱的聚阴离子典型地包括羧酸基团并且强的聚阴离子典型地包括磺酸基团、膦酸基团或硫酸根基团。带负电荷的聚合电解质的实例包括包含磺酸根基团(-SO3)的聚合电解质，例如聚苯乙烯磺酸(“PSS”)、聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸)(“PAMPS”)、磺化聚醚醚酮(“SPEEK”)、磺化木质素、聚(乙烯基磺酸)、聚(甲基丙烯酰氧基乙基磺酸)、它们的盐、和其共聚物；聚羧酸，例如聚丙烯酸(“PAA”)和聚(甲基丙烯酸)；以及硫酸盐，例如角叉菜胶。其他的聚阴离子包括HV-藻酸钠、藻酸钠、透明质酸钠、硫酸肝素、硫酸纤维素、卡拉胶、三聚磷酸五钠、低酯化果胶(聚半乳糖醛酸)、聚谷氨酸、羧甲基纤维素、硫酸软骨素_6、硫酸软骨素_4、和胶原蛋白。聚阴离子的分子量和电荷密度被选择，使得化合物与合适的聚阳离子形成聚合电解质络合物。
[0113]是聚阳离子的各种聚合电解质也可以被用作阳离子型聚合物。示例性的聚阳离子包括聚烯亚胺，例如聚乙烯亚胺(“PEI”)和聚丙烯亚胺。其他的聚阳离子包括聚胺，即在其中单体单元具有侧链胺基团的聚合物，例如聚乙烯聚胺、聚丙烯聚胺、聚乙烯基胺、聚烯丙基胺、聚(乙烯基醇/乙烯基胺)、壳聚糖、聚赖氨酸、多粘菌素、盐酸精胺、硫酸精蛋白、盐酸聚(亚甲基-共-胍)、聚乙氧基化乙烯亚胺、改性的聚乙烯亚胺表氯醇、石英化聚酰胺、和聚二烯丙基二甲基氯化铵-共-丙烯酰胺。如本领域中已知的，壳聚糖是由无规分布的β-(1-4)-联接的D-葡萄糖胺(脱乙酰化的单元)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰化的单元)组成的线性多糖。
[0114]带正电荷的聚合电解质的其他的实例包括季铵基团，例如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(“PDAD”)、聚(乙烯基苄基三甲基铵)(“PVBTA”)、紫罗烯类、聚(丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵)、聚(甲基丙烯酰氧基(2-羟基)丙基三甲基氯化铵)和其共聚物；包含吡啶鎗基团的聚合电解质，例如聚(N-甲基乙烯基吡啶)(“PMVP”)、其他的聚(N-烷基乙烯基吡啶)和其共聚物；以及质子化的聚胺，例如聚盐酸烯丙基胺(“PAH”)。聚阳离子的分子量和电荷密度被选择，使得化合物与合适的聚阴离子形成聚合电解质络合物。基于吡啶基的阳离子型聚合物的进一步的描述可以例如在US4, 384，075 “Cationic Alkenyl Azabenzenesand Rubber Modified Asphalts”中找到。聚乙烯基卩密唳类例如聚(4_乙烯基卩比唳)(Mw?60，000)，在下文示例的，以及例如聚(4-乙烯基吡啶-共-甲基丙烯酸丁酯)也被明确地定义为阳离子型聚合物。几个组中的任何可以被用于烷基化基于吡啶基的聚合物并且产生聚阳离子。组可以含有受体，例如硼酸、生物素和螯合配体。因此，如本领域中理解的，本发明的聚合电解质可以是聚烷基吡啶，即具有带侧链吡啶基的烷基骨架的聚合物。聚烷基吡啶将典型地具有，如图16中所示的，“η”个重复单元的烷基(例如乙烯基)骨架，取决于分子量(例如1，000-10，000)，以及被经过连接基团附接于某些，如果不是所有单体单元的话，直接地结合于单体或结合于重复单体单元的吡啶基。
[0115]术语“盐”在本文中以其常规的意义被使用，以是指可以来源于酸和碱的中和反应的离子化合物。它们由阳离子(带正电荷的离子)和阴离子(负离子)组成，使得产物是电中性的(没有净电荷)。这些组分离子可以是无机的，例如氯离子(CD，以及有机的，例如乙酸根(CH3COO-),和单原子的离子，例如氟离子(F—)，以及多原子的离子，例如硫酸根(so42_)。具有盐的几个变体。当被溶解在水中时水解以产生氢氧根离子的盐是碱性盐并且在水中水解以产生水合氢离子的盐是酸性盐。中性盐是既不是酸性盐也不是碱性盐的那些。两性离子含有在同一个分子中的阴离子型中心和阳离子型中心但是不被认为是盐。实例包括氨基酸、许多代谢物、肽和蛋白质。熔融盐类和含有溶解盐类的溶液(例如在水中的氯化钠)被称为电解质，因为它们能够传导电。
[0116]术语“聚丙烯酸” (PAA)意指丙烯酸单元的聚合物。PAA的分子式是(C3H402)n。重复单元的数量可以被选择以获得具有例如2，000至约24，000的分子量的聚合物。在以中性的PH的水溶液中，PAA的侧链中的许多损失它们的质子并且获取负电荷。这使PAA是聚合电解质，并且是弱酸阳离子。
[0117]术语“多篮”意指聚合性碳水化合物结构，由被糖苷键接合在一起的重复单元(单糖或二糖)形成。这些结构经常是线性的，但是可以含有各种支化度。多糖经常是非常非均质的，含有重复单元的略微的修改。取决于结构，这些大分子可以具有来自它们的单糖构造块的分立的性质。当多糖中的所有的单糖是同一个类型时多糖被称为同多糖，但是当单糖的多于一个类型存在时它们被称为杂多糖。多糖具有Cx(H2O)y的通式，其中X通常是在200至2500之间的大的数字。实例包括但不限于储存多糖，例如淀粉和糖原；结构多糖，例如纤维素、甲壳素和阿拉伯糖基木聚糖类；细菌多糖，例如肽聚糖。其他的实例包括果胶、角叉菜胶、藻酸盐、壳聚糖等等。
[0118]离子结合多糖是诸如示例的壳聚糖、黄原胶、藻酸、甲壳素和果胶的那些。如在此描述的离子结合多糖通过螯合起作用。[0119]术语“螯佥”以其常规的意义被使用，以是指螯合剂的活动。螯合物是由金属离子和螯合剂组成的化合物。螯合剂是其分子可以形成向一个单一的金属离子的多个键的物质。换句话说，螯合剂是多齿配体。螯合剂，根据ASTM-A-380，是“与某些金属离子形成可溶解的络合分子，使离子灭活，使得它们不能够与其他的元素或离子正常地反应以产生沉淀或结垢的化学物”。
[0120]术语“壳聚糖”在本文中以其常规的意义被使用，以是指由无规分布的β -(1-4)-联接的D-葡萄糖胺(脱乙酰基化的单元)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(乙酰化的单元)组成的线性多糖。壳聚糖中的氨基基团具有~6.5的pKa值，这导致在具有取决于？!1和％ DD(脱乙酰基化的程度)值的电荷密度的酸性的至中性的溶液中的质子化。这使壳聚糖是可溶于水的并且是容易地结合于带负电荷的表面例如黏膜的生物黏附物。壳聚糖增强极性药物的经过上皮面的传输，并且是生物相容的并且生物可降解的。壳聚糖在商业上通过甲壳素的脱乙酰基化被生产，甲壳素是在甲壳纲动物(螃蟹、虾等等)的外骨骼以及真菌的细胞壁中的结构元素。脱乙酰基化的程度(％DD)可以通过NMR谱被测定，并且商业壳聚糖中的％ DD在60-100%的范围内。平均地，商业上生产的壳聚糖的分子量在3800至20，000道尔顿之间。壳聚糖已经被描述为对于金属离子的聚集合适的生物聚合物，因为壳聚糖链上的氨基基团和羟基基团可以作为用于金属离子的螯合位点起作用。关于被壳聚糖结合的铜的进一步的细节可以在Food Chemistryll4(2009)962-969中找到。壳聚糖已经被描述为对于金属离子的聚集合适的生物聚合物，因为壳聚糖链上的氨基基团和羟基基团可以作为用于金属离子的螯合位点起作用。其具有例如在US201I / 0136255中图示的结构。
[0121]术语“调韩蛋白”(calmodulin,用于CALcium MODULated proteIN 的缩写)在本文中以其常规的意义被使用，是指在所有的真核细胞中被表达的钙结合蛋白质。其可以结合于并且调节多种不同的蛋白质靶材，由此影响许多不同的细胞功能。调钙蛋白在结合于钙时经受构象改变，这使其能够结合于特异性的蛋白质以用于特异性的响应。调钙蛋白可以结合高至四个钙离子，并且可以经受翻译`后修饰，例如磷酸化、乙酰基化、甲基化和溶蛋白性裂解，其中的每个可以潜在地调制其动作。调钙蛋白是小的酸性的蛋白质，约148个氨基酸长(16706道尔顿)并且，据此，是对于测试蛋白质模拟软件有利的。其含有四个EF手“基序”，其中的每个结合一个Ca2+离子。蛋白质具有两个近似地对称的域，其被柔性的“铰链”区分隔。钙通过EF手基序的使用被结合，EF手基序供应用于离子配位的阴电性环境。在钙结合之后，来自蛋氨酸残基的疏水性甲基基团通过构象改变成为在蛋白质上被暴露的。这呈现疏水的表面，疏水的表面可以进而结合于靶蛋白上的碱性两亲螺旋(BAA螺旋)。这些螺旋含有互补的疏水性区。
[0122]调钙蛋白是示例的结合钙的离子结合蛋白质。其他的钙结合蛋白质包括肌钙蛋白C和S100B。其他的不天然地是金属离子结合蛋白质的蛋白质可以被耦合于小分子螯合剂。其他的合适的离子结合蛋白质包括CopA和金属硫因(结合铜)、锌指蛋白、胞苷脱氨酶和神经生长因子(结合锌)。
[0123]术语“硼盧”在本文中以其常规的意义被使用，以是指属于有机硼烷的较大的类别的含有碳-硼键的被烷基或芳基取代的硼酸。硼酸作为路易斯酸起作用。它们的独特的特征是它们能够与糖、氨基酸、异羟肟酸等等(具有被邻位地(1，2)或间位地(1，3)取代的路易斯碱供体的分子(醇、胺、羧化物))形成可逆的共价配合物。硼酸的PKa是?9，但是当在水溶液中络合时，它们形成具有PKa?7的四面体的硼酸盐络合物。它们偶尔地在分子识别的领域中使用以结合于糖以用于荧光检测或糖的经过膜的选择性的传输。硼酸酯是在硼酸和醇之间形成的酯。硼酸具有分子式RB(OH)2，其中R可以是任何基团，例如烷基。硼酸酯具有分子式RB (OR)2。
[0124]在水体系中在硼酸和1，2_或1，3_ 二醇之间的共价的成对的相互作用是快速的并且可逆的。据此，在糖上存在的在硼酸和羟基基团之间建立的平衡可以被采用以开发很多的用于糖的传感器。对于这种相互作用的潜在的应用包括用于监测糖尿病血糖水平的系统。
[0125]硼酸和硼酸酯类可以被用于官能化在本文中实施的纳米吸量管以在检测糖，包括单糖、二糖、寡糖和多糖，包括葡萄糖(一种单糖)，中被使用。单糖是最简单的碳水化合物，因为它们不能够被水解为更小的碳水化合物。它们是具有两个或更多个羟基基团的醛或酮。未被改性的单糖的一般的化学式是(C.H2O)n，照字面地“碳水化物”。单糖是重要的燃料分子以及用于核酸的构造块。最小的单糖，对于其n=3，是二羟基丙酮和D-和L-甘油醛。两个接合的单糖被称为二糖并且这些是最简单的多糖。可以被硼酸涂覆感测的二糖的实例包括蔗糖和乳糖。是寡糖的分析物的实例包括二糖、三糖棉子糖和四糖水苏糖。多糖的实例包括淀粉、糖原、甲壳素、纤维素、胼胝质或昆布多糖、金藻昆布多糖、木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖和半乳甘露聚糖。
[0126]术语“糖结合蛋白质”意指特异性地结合于碳水化合物的蛋白质。术语“糖”被与“碳水化合物”同义地使用。碳水化合物结合蛋白质的实例是凝集素的族。实例包括伴刀豆球蛋白、甘露糖结合蛋白质、花生凝集素、雪花莲凝集素、蓖麻毒蛋白。
[0127]一般的方法和设备
[0128]本文描述了用于通过被电压引导的离子迁移控制水溶液中的沉淀以及用于通过沉淀对经过纳米吸量管末端的离子电流的影响研究沉淀的方法和设备。研究纳米尺度的沉淀的最早阶段在技术上是有挑战性的，但是非常有价值的，因为现象反映了重要的过程，例如结晶和生物矿化。使用石英纳米吸量管作为纳米反应器，不可溶解的盐的沉淀被诱导以产生振荡电流阻滞。该可逆的过程可以被用于测量沉淀的动力学和所得到的纳米颗粒的相对大小二者。
[0129]图1示出了根据本发明的测量经过石英纳米吸量管102的离子电流振荡的电化学装置的实施例，使石英纳米吸量管102的末端在含有各种离子物质和/或碳水化合物物质112的溶液106中。在纳米吸量管中设置了用于测量离子电流振荡的电子部件。离子电流因响应于纳米吸量管的内侧和外侧之间的电压差而使离子经过纳米孔流入纳米吸量管或流出纳米吸量管所产生。电子部件包括与吸量管内的溶液接触的电极104 ;放大器105，例如Axopatch电阻反馈膜片钳和高速电流夹持器放大器,其由Molecular Devices制造,具有被连接于电极104的负输出部；以及参比电极110，其在样品溶液106中，在纳米吸量管内部的外侧。这种示例性的设置测量了经过石英纳米吸量管的离子电流。在末端处的孔径典型地是40-60nm。如在下文示例的以及在此示出的，溶液含有各种离子例如KCl (0.1M)并且在pH7被缓冲，具有在圆筒102中的IOmM磷酸钾和在浴104中的IOmMTris-HCl。氯化锌被以2至20 μ M的浓度包含在浴中。在浴中使用不含有磷酸盐的缓冲液防止在浴溶液中的沉淀。据此，当来自圆筒内的磷酸盐与来自浴溶液的锌离子混合时，沉淀被局限于纳米吸量管的末端。关于电压钳电路的进一步的细节可以在美国专利7，785，785 “Chargeperturbation detection system for DNA and other molecules，，中找至Ij0
[0130]呈不同构型的相同的装置可以被用于测量离子电流整流，作为用于检测金属离子的手段，如例如在图4和9中图示的。在本实施方案中，缓冲液例如pH7的磷酸盐作为用于纳米吸量管的圆筒和浴溶液二者的电解质。也在图1中示出的是在内侧孔隙上的邻近纳米吸量管末端的涂层108。该区被称为“纳米孔”，并且在其内界定“纳米通道”。涂层108，如在下文进一步描述的，可以在网格状的结构中延伸遍及末端，或可以是在内表面上的单涂层，并且可以被用于所选择的离子或碳水化合物的特异性的结合。如下文描述的，聚丙烯酸可以如示出的被在108施用，即施用于纳米吸量管的硅酸盐表面并且壳聚糖被施用在聚丙烯酸之上。Cu离子被示出为结合于壳聚糖，但是在pH3被释放。
[0131]通过使用螯合剂感测金属离子不同于测量电流振荡的由在纳米孔处的纳米沉淀导致的改变。当螯合剂结合阳离子时，负的离子电流整流指示这样的结合，如下文描述的。
[0132]聚合物被合成使得其是阳离子型的，并且聚合物，当被内嵌在纳米孔中时，显示正的整流。在结合糖时，正电荷被中和，并且离子电流被负整流。在文献中的其中硼酸被直接地附接于玻璃的其他体系不是这样。那些体系在糖结合时实现整流的适度的改变(负的至略微更负的)。
[0133]如已知的，1-V曲线(电流电压曲线)将展示各种特征，取决于带电荷的离子经过纳米孔的流动。如果整流发生，那么IV曲线将不是线性的，而是将具有响应于正电压的(正的整流)或响应于负电压的(负的整流)的更大的电流通过。电压的极性参照纳米吸量管内的电极被给予。因此，在操作中，本发明的装置将连续地施加在负的范围内，然后在正的范围内的多个电压水平。例如，在图4中，-400mV至O和O至+400mV的电压被在14个不连续的水平施加并且电流在每个水平被测量，以产生ι-v曲线。当给定的系统的特定的参数被确定时，该范围可以被变窄。
[0134]图2示出了导致离子电流振荡的纳米吸量管电路和溶液的配置。纳米吸量管圆筒202中的负电势(被示出为V〈0)把锌阳离子从浴106 (图1)拉动入孔即纳米吸量管的开口中，而磷酸根离子被从纳米吸量管圆筒102推动出来(图1)。离子的混合(阴离子与阳离子混合)在纳米吸量管末端区118中发生。当具有足够大小的沉淀物被形成时，如在206示出的，孔被堵塞并且离子电流减小。
[0135]如下文描述的，用于高度不溶于水的磷酸锌盐的反离子被纳米吸量管的孔分离并且电势被施加以导致离子迁移向界面。通过分析被206处的阴影图示的孔堵塞的动力学，两种不同的机制被确认:一种因从溶液的沉淀导致的较慢的过程，以及一种归因于被捕获的沉淀物的被电压驱动的迁移的较快的过程。这些技术可以被用于研究沉淀动力学以及对纳米反应器内的被捕获的颗粒实施的测量，纳米反应器可以被认为是“反应区”，如图2中所示的。在给出的实施例中，颗粒是磷酸锌盐。其他的颗粒可以包括蛋白质，特别是带电荷的那些蛋白质，并且纳米吸量管可以被用于测试用于接种晶体的条件，例如在结晶学中使用的那些。装置还可以被用作基于与反离子的纳米沉淀而用于阳离子或阴离子的电传感器。
[0136]还公开了使用被受体官能化的纳米吸量管可逆地结合离子的电传感器。给出的实例是用于pH、钙、铜和碳水化合物的传感器。受体可以是具有酸性的或碱性官能团的分子、金属螯合剂或蛋白质。作为用于钙生物传感器的构思的证据，蛋白质调钙蛋白被固定化于纳米吸量管末端的内部。传感器显示出对于具有中性的PH的电解质中的钙的优于镁的选择性，并且钙信号是简单地通过浸没在新鲜的溶液中是可逆的。该传感器被用于使用可再现的并且取决于浓度的信号进行超过20次单独的测量。
[0137]此外，验证了被某些聚合电解质官能化的纳米吸量管可逆地结合过渡金属。作为构思的证据，被作为外层的壳聚糖改性的纳米吸量管以及被层叠至石英内部上的聚丙烯酸(PAA)被显示出可逆地结合铜。在这种情况下，壳聚糖/ PAA被应用，如下文描述的。纳米吸量管的外侧被处理，例如使用硅烷。Cu离子结合于与纳米吸量管的内表面上的聚丙烯酸组合的壳聚糖。在PH3，Cu2+离子离开壳聚糖。纳米吸量管的外侧的表面处理可以被进行以帮助纳米吸量管的经过膜例如脂质双分子层、细胞膜的渗透。纳米吸量管的外侧的表面处理不改变受体结合至纳米吸量管。
[0138]此外，如下文示出的，外加电压可以被用于调节纳米吸量管的结合性质。在某些实施方案中，纳米吸量管被蛋白质官能化以结合于离子，包括结合于碳水化合物。在某些其他的实施方案中，纳米吸量管被硼酸或硼酸酯类官能化以检测碳水化合物。此外，用于PH的传感器通过使用含有胺基团或羧酸基团的聚合电解质、含有胺的生物聚合物壳聚糖或氨基硅烷官能化纳米吸量管被制备。PH传感器还显示出对pH3至pH8的不同缓冲液的快速可逆的响应。这些类型的传感器可以被用于许多不同的需要可逆的并且连续的传感器或传感器的阵列的应用，例如水品质的监测、体内单一细胞鉴定或功能性离子绘图。
实施例
[0139]实施例1:具有PLL和PAA聚合电解质层的纳米吸暈管生物传感器的制备和表征
[0140]使用来自Sutter (Novato,加利福尼亚州)的具有细丝的石英毛细管(QF100-70-7.5)作为被Sutter P-2000激光拉制仪接收和拉制以得到纳米吸量管。所使用的拉制仪设置是热620、细丝4、速度60、延迟170、拉动180。该设置是可变的，取决于拉制仪，并且被按需调整，以提供显示出具有期望的电导的负的离子电流整流的纳米吸量管。把吸量管使用被缓冲的电解质(pH7Tris-HCl，IOmM和KCl，IOOmM)回填，除非另有指示。所描述的两个传感器是来自一个被拉动的毛细管的一对吸量管。传感器CaM-1在聚合电解质沉积之前不被处理，并且CaM-2使用气相沉积使用三甲基氯硅烷(TMCS)被硅烷化。把纳米吸量管放置在具有约0.1mL的TMCS的0.5L容积的密封室中10分钟。然后把两个吸量管二者使用被缓冲的电解质回填并且浸没在同一缓冲液的浴中。借助使用在吸量管圆筒中的Ag / AgCl电极和在浴中的接地电极的Axopatch700B放大器(Axon)测量离子电流。施加+500mV至-500mV(5Hz)的正弦电势以监测在后续的表面处理期间的离子电流。通过吸量管末端相继地浸没在含有以3ppm的浓度的PLL或PAA的被缓冲的电解质中把聚合电解质聚L赖氨酸(PLL)和聚丙烯酸(PAA)沉积在纳米吸量管的表面上，且在每次聚合电解质沉积之后，在缓冲液中浸没以洗涤。如果所得到的电流整流的改变(对于PLL来说正的，对于PAA来说负的)在缓冲液中的浸没期间被保持，那么聚合电解质层被确定为是稳定的。CaM-1和CaM-2 二者被四个层官能化:PLL、PAA、PLL以及然后PAA。然后把吸量管浸没在含有每个IOmg / mL的NHS和EDC(IOOmM pH6.1MES缓冲液，具有50mM KCl)的溶液中一小时。最后，把吸量管的末端洗涤并且浸没在调钙蛋白的溶液(牛脑，在具有50mM KCl的pH6.1MES缓冲液(IOOmM)中0.05mg / mL)中并且在4°C温育18h。
[0141]使用上文描述的电设置分析传感器的电性质和对金属盐的响应。所有的测量在PH7缓冲的电解质溶液中进行，且等份的氯化钙或氯化镁(I至IOyL体积)直接加入到
0.3mL缓冲液的浴中。使用pClamp软件以200Hz的速率采集数据并且使用0riginPro8.5处理。对于连续的测量数据，检测来自正弦的外加电压的负的离子电流峰并且对随时间的变化作图。使用50%百分位滤波和10点移动窗口进行曲线平滑，使用以下的等式计算整流系数(r):r = 1glOI+ / 1-。其中I+是500mV电势的离子电流的量级，并且1_是_500mV电势的离子电流的量级。离子电流的误差反映在1+和1-的三次单独测量之间的标准偏差，使用在测量之间在缓冲液中洗涤之后的同一个纳米吸量管。[0142]实施例2:被固定于纳米吸暈管的调钙蛋白的选择性的并且可逆的Ca^结合
[0143]为了实现与生物受体的可逆的并且选择性的离子结合，被调钙蛋白(以高选择性可逆地螯合钙的钙结合蛋白(Kd~ I(T6M))改性的纳米吸量管传感器被研究。使用固定化的调钙蛋白的电传感器已经在之前被Cui等人在2001年在Science293卷:1289-1292 页中(“Nanowire nanosensors for highly sensitive and selectivedetection of biological and chemical species”)报道用于探查钙浓度并且被 Ivnitiski 等人(“An amperometric biosensor for real-time analysis ofmolecular recognition，，Bioelectrochem.Bioenerg.1998, 45 (I), 27-32)以及被Lin 等人(“Label-free detection of protein-protein interactions using acalmodulin-modified nanowire transistor，，Proc.Natl.Acad.Set U.S.A.2010,107 (3),1047-1052)报道用于蛋白质-蛋白质相互作用。我们的策略把蛋白质固定到孔以及为了把受体局限于孔溶液界面以用于快速的并且可逆的离子响应考虑在内。
[0144]在初步的研究中，对阳离子的最高的灵敏度使用显示出负的整流的孔被观察到，并且我们的用于表面官能化的途径确保了最终的传感器是基于这样的孔。聚合电解质具有与带电荷的孔表面的强的静电相互作用，并且离子电流整流是聚合电解质结合于纳米孔的极佳的指示物。出于这种考虑，离子电流测量被用于监测聚合电解质在纳米吸量管中的逐层沉积并且提供具有期望的电导的负整流的纳米孔。在蛋白质中的胺基团和最外的聚合电解质层上的羧酸根基团之间的酰胺键形成把蛋白质耦合于石英表面。为了把受体局限在与本体溶液具有更大相互作用的孔-溶液界面处，孔仅通过浸没被官能化，使纳米吸量管的内侧被缓冲液填充。因为这样的途径将官能化表面的相对大的区域以及直接地围绕孔的区，所以在其中外部表面被疏水性硅烷涂覆的纳米吸量管也被测试。
[0145]在多个步骤中实时地监测纳米吸量管的表面处理以确定表面化学的稳定性。从同一个毛细管拉动的一对纳米吸量管被用于表面处理的相同的步骤。处理涉及与在二氧化硅的表面上的侧链氧基团反应。施用PAA和PLL层，产生侧链羧基基团；调钙蛋白被结合于这些基团。因此在石英上的表面官能化通过聚合电解质层(聚L-赖氨酸)PLL;(聚丙烯酸)PAA的沉积以及随后的使用NHS / EDC耦合的向CaM(调钙蛋白)蛋白质的酰胺键形成被实现。实际上，产生了石英-PLL-PAA-PLL-PAA的夹层物。
[0146]传感器CaM-1在拉制之后被直接地使用，并且CaM_2首先被三甲基氯硅烷(TMCS)蒸气处理以硅烷化外吸量管末端。当纳米吸量管被浸没在含有阳离子型聚L-赖氨酸(PLL)或阴离子型聚丙烯酸(PAA)的中性缓冲液中时监测离子电流整流(ICR)，其中后续的层的加入仅在整流在纯的缓冲液中保持稳定之后。如被图4中的电流-电压曲线示出的，未修饰的纳米吸量管具有负的ICR，其中未修饰的吸量管的电流-电压响应( )，在两个层的PLL和PAA之后(.)，以及在与CaM耦合之后(▲)。在两个层的PLL / PAA之后，电流仍然被负地整流，但是是在量级上更小，指示在沉积之后更小的孔。这种行为在调钙蛋白蛋白质的固定化之后继续，调钙蛋白蛋白质在中性的PH也是带负电荷的(pi~4)。整流系数反映在电流电压曲线中看到的行为:r=-0.27+0.03 (未修饰的吸量管)、-0.71 ±0.02 (PLL /PAA的第二层)以及-0.533+0.0H(CaM)。这些测量中的低的误差表明在每个步骤的表面的稳定性。纳米吸量管的整流反映表面涂层(见图5A，示出了随着不同官能化的不同的整流系数)。在施用PLL之后，整流具有正的值，并且在施用PAA之后，整流是负的。使用振荡正弦电势(-500至500mV，5Hz)测量电流。误差柱反映使用同一个纳米吸量管的三次单独的测量，且每次测量之间在缓冲液中洗涤。被CaM改性的纳米吸量管也示出了负的整流，与来源于含有羧酸盐的残基的蛋白质的总的负电荷一致。在_500mV电势的电流被钙离子的存在严重地影响，如图5B中所示的。离子电流被示出，在pH7缓冲液中随时间的变化，且添加0.1mM氯化镁，并且在0.1mM氯化钙的存在下。对钙的选择性通过对钙离子比相对于镁离子大的信号变化来图示。结合的可逆性通过信号因浸没在纯的缓冲液且随后浸没在氯化钙中而被恢复来显示。
[0147]实施例3:被金属离子结合聚合物(壳聚糖结合Cu)官能化的pH灵敏的纳米吸暈管传感器
[0148]pH的传感器通过使用氨基硅烷、含有胺的生物聚合物壳聚糖(图6)或含有胺基团或羧酸基团的聚合电解质官能化纳米吸量管被制备。PH传感器显示出对pH3至pH8的不同缓冲液的快速可逆的响应。把纳米吸量管使用PH7电解质(IOOmM KCl与IOmM Tris-HCl缓冲液)填充并且浸入具有变化的PH的被缓冲的电解质(IOOmM KCl与IOmM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液)中。在施加以5Hz的-500至500mV的正弦电势的同时测量离子电流。测量在被IOmM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲至期望pH的0.1M KCl溶液中进行。从使用同一个传感器的至少四次不同的PH测量计算误差柱(图6)。图6示出了在不同pH值的对于未修饰的和被壳聚糖/ PAA官能化的纳米吸量管的整流系数的比较。整流系数对于官能化的纳米吸量管的PH是更灵敏的，这是由于可质子化的羧酸根基团和胺基团。在中性的pH，已官能化的纳米吸量管显示出比未修饰的纳米吸量管显著更多的负的整流，显示出涂覆导致在纳米孔的表面处更多的带负电荷的基团。
[0149]实施例4:聚合电解质和壳聚糖在纳米吸暈管上的静电物理吸附
[0150]把壳聚糖和聚丙烯酸使用以下的程序物理吸附:把纳米吸量管浸没入350 μ L的ΡΗ3的缓冲溶液中并且把10 μ L的壳聚糖储备溶液加入储液器中。壳聚糖的物理吸附应当在酸性的pH发生，因为这种聚合电解质在中性的pH下是不可溶解的。然后把纳米吸量管转移入350 μ L的ρΗ7的缓冲溶液中并且把10 μ L的PAA储备溶液加入储液器中。然后把官能化的纳米吸量管在两种溶液之间循环，直到在传感器上达到期望的层数。
[0151]圆锥形的几何构型以及纳米尺寸孔在固态纳米孔上产生令人感兴趣的电化学行为。例如，带电荷的纳米孔使 用不对称的电流输出响应于对称的输入电压，这是一种被称为整流的效应。纳米吸量管中的这种效应的起源已经在被本发明的两位发明人发表的最新的综述中广泛地描述(Actis, P.；Mak, A.； Pourmand, N.BioanalyticalReviews2010, I, 177.)。简要地说，当扩散双电层厚度与孔径是差不多时，纳米孔表面上的固定的带电荷的物质和溶液中的离子物质之间的静电相互作用改变离子传输性质。为了量化整流的程度，已经引入被称为整流系数或，在某些情况下，整流程度的有用的参数，其被定义为在特定的正电压下测量的电流和在相同的但是具有相反极性的电压下测量的电流之间的比的对数，即r=Log1(lI+ / 1_。
[0152]石英纳米孔是带负电荷的，显示出负的整流(KO)。整流可以通过使用带电荷的官能化层例如聚L_赖氨酸、树枝状大分子、氨基硅烷和壳聚糖改性纳米孔表面被逆转(r>0)。
[0153]聚合电解质的静电物理吸附可以通过简单的电化学测量被监测。来自壳聚糖骨架的带正电荷的氨基基团允许聚合电解质物理吸附到带负电荷的纳米吸量管的表面上。壳聚糖物理吸附仅在酸性的PH发生，因为该多糖在中性的pH是不可溶解的。相似地，聚丙烯酸(PAA)的羧基基团在中性的pH向聚合物赋予负电荷，允许物理吸附到带正电荷的壳聚糖纳米吸量管上。每个聚合电解质层的沉积通过电化学测量被监测。整流系数是纳米吸量管表面电荷的指示。该参数被用于量化在石英纳米吸量管上的逐层组装的作用。引人注意地，多层组装增强纳米吸量管的整流性质:在5层的壳聚糖/ PAA的物理吸附之后，在丸粒处的整流系数从-0.1，对于未修饰的纳米吸量管，增加至-0.8，并且然后出现平台。相似地，在PH3，整流系数在5层之后从O增加至0.65 (图7)。除了整流系数之外，在5层之后，在PAA或壳聚糖的进一步的加入时不产生总电流的改变。这指示没有聚合电解质被沉积在已经被壳聚糖PAA混合层完全覆盖的传感器表面上。这些结果与被Ali等人描述的结果形成对t匕。(Ali, M.；Yameen,B.；Cervera,J.；Ramirez,P.；Neumann,R.；Ensinger, ff.；KnolI,ff.；Azzaroni,0.Journal of the American Chemical Society2010, 132，8338) Ali 等人描述的结果显示在PET膜中的单一的不对称的纳米通道的表面电荷随着被组装入其中的层的数量很大地减小。这种行为可以通过形成不完美的多层来解释，形成不完美的多层导致混合的层而不是完美的逐层组装。因此，被壳聚糖/ PAA改性的纳米吸量管的pH响应被研究以印证这种假设。测量在被IOmM磷酸盐/柠檬酸盐缓冲至期望pH的0.1M KCl溶液中进行。从使用同一个传感器的至少四次不同的PH测量计算误差柱(图8)。壳聚糖具有?
6.5的pKa值，并且PAA具有4.8的pKa值。假设完美的逐层组装，如果PAA是最外的层，那么纳米吸量管在pH〈4.8应当是不带电的并且在pH>4.8是带负电荷的。同样地，如果壳聚糖是最外的层，那么纳米吸量管在pH〈6.5应当是带正电荷的并且在高于pH6.5是中性电荷的。然而，壳聚糖/ PAA纳米吸量管的整流系数在pH〈5是正的并且在pH>5是负的。这指示在pH〈5，纳米吸量管选择通透性被壳聚糖的质子化氨基基团决定，并且在pH>5，被PAA的带负电荷的羧基基团决定，从而表明混合层形成。
[0154]实施例5:在被壳聚糖和PAA多层静电改性的石英纳米吸暈管上的选择性的并且可逆的Cu21结合
[0155]壳聚糖和PAA层在石英纳米吸量管上的物理吸附给予其在未修饰的传感器不被观察到的可逆的金属结合性质。壳聚糖和PAA的螯合性质是熟知的并且在文献中充分地描述。壳聚糖结合多种金属离子；然而其显示出对二价铜离子较强的亲合力。因此，决定，作为模型体系，研究铜离子对壳聚糖/ PAA传感器的络合。
[0156]试剂:壳聚糖从CERMAY购买。pH3的HCl溶液中5mg / ml壳聚糖的储备溶液被制备并且用于本论文中描述的所有的实验。聚丙烯酸从Sigma Aldrich (圣路易斯，密苏里州)购买。在PH7.4的PBS溶液使用标准的方法制备。水性试剂使用具有>18ΜΩ cm 1电阻的超纯水制备。
[0157] 传感器制造:纳米吸量管使用细丝从石英毛细管制造，具有1.0mm的外径和0.70mm 的内径(QF100-70-5 ；Sutter Instrument C0.)。然后使用被预编程的 P-2000 激光拉制仪(Sutter Instrument C0.)拉动毛细管以制造具有50nm的内径的纳米吸量管。所使用的参数是:热625、细丝4、速度60、延迟150、和拉动192。所得到的纳米吸量管末端具有范围在37至82nm的内径，具有56nm的平均直径。
[0158]测量设置:所有的测量被在二电极设置中进行，因为流动经过纳米吸量管的电流是过于小的以致于不能极化参比电极。把用作工作电极的传感器使用被在PH7缓冲的0.1MKCiaOmM Tris-HCl回填，并且插入一个Ag/AgCl电极。把另一个Ag/AgCl接地电极放置在本体溶液中，作为辅助/参比电极起作用。把两个电极二者都连接于具有DigiDatal322A数字器的Axopatch700B放大器(Molecular Devices)以及配备有pClamplO软件的PC (Molecular Devices) 0体系在测量的持续时间内保持不被搅拌，测量在室温进行。
[0159]图9示出了对于未修饰的纳米吸量管传感器和已经被PLL / PAA涂覆的纳米吸量管传感器在-500和+500mV电势的离子电流。Cu2+加入在储液器中立即影响传感器的选择通透性，导致在_500mV电势的离子电流减小。结合是完全地可逆的，并且传感器被再生高至5次，而没有性能的任何损失。再生通过传感器浸没在pH3缓冲液中60秒来进行。酸性的PH质子化壳聚糖氨基基团，从而导致溶液中的二价铜离子的释放(图10)。可选择的再生的方法，例如浸没在中性的pH的柠檬酸盐缓冲液和0.1 % EDTA中，显示出同样的成功。重要的是考虑两种聚合电解质对于铜结合的组合的影响。当纳米吸量管仅被壳聚糖和PAA官能化时进行的实验显示出当铜加入在本体溶液中时几乎没有输出电流的变化。此外，聚合电解质和石英之间的界面不是稳定的，因为传感器在铜结合性质完全损失之前仅被再生一次。当壳聚糖和PAA的混合层被在纳米吸量管上构建时，界面在多个检测循环内是稳定的。通过FTIR测量，Wang和共同工作者验证了 _ΝΗ2、_0Η和COOH基团全部都在被壳聚糖/ PAA凹凸棒石复合物的铜吸附中被涉及(Wang, X.；Zheng, V.；ffang, A.Journal of HazardousMaterials2009, 168:970)。推测，相似的螯合机理在壳聚糖/ PAA传感器中发生，增强金属结合能力。
[0160]传感器对不同浓度的铜离子的响应被研究(图11)。传感器线性地响应于增加的Cu2+浓度(图11，插图)。归一化电流相对于Cu2+浓度的变化类似于朗缪尔吸附等温式。电流根据以下被归一化:
[0161]
【权利要求】
1.一种用于在检测样品中的分析物的设备中使用的纳米吸量管，包括: (a)毛细管部分，其界定所述纳米吸量管的通向纳米孔的内部孔隙； (b)所述内部孔隙适于在其内容纳电极和通过所述纳米孔与外部溶液连通的内部溶液；以及 (c)涂层，其在所述纳米孔的内表面上，包含 (i)聚合电解质层，其被直接地结合于所述内表面；以及 (?)结合分子，其被连接于所述聚合电解质，特异性地结合选自由离子或小分子组成的组的分析物。
2.根据权利要求1所述的纳米吸量管，其中所述结合分子是硼酸。
3.根据权利要求2所述的纳米吸量管，其中所述聚合电解质是聚阳离子。
4.根据权利要求3所述的纳米吸量管，其中所述聚阳离子是聚烷基吡啶或聚胺。
5.根据权利要求2所述的纳米吸量管，其中所述涂层还包括延伸入所述纳米孔中并且部分地堵塞所述纳米孔的部分。
6.根据权利要求1所述的纳米吸量管，其中所述结合分子是螯合剂。
7.根据权利要求6所述的纳米吸量管，其中所述聚合电解质层选自由(a)聚丙烯酸层、(b)聚胺层；以及(c)聚丙烯酸和聚胺的交替层组成的组。
8.根据权利要求7所述 的纳米吸量管，其中所述聚胺是聚烷基吡啶。
9.根据权利要求1所述的纳米吸量管，其中所述结合分子是离子结合聚合物，所述离子结合聚合物是多糖或多肽。
10.根据权利要求9所述的纳米吸量管，其中所述聚合物是壳聚糖。
11.根据权利要求9所述的纳米吸量管，其中所述聚合物是调钙蛋白。
12.一种用于测量样品中的糖分析物的纳米吸量管设备，包括: (a)纳米吸量管，其具有内部孔隙和通到所述样品的纳米孔； (b)电极和参比电极，所述电极在所述内部孔隙内，被布置成接触内部溶液，所述参比电极被布置用于接触所述样品； (c)涂层，其在所述纳米孔的内表面上； (d)所述涂层包含特异性结合糖并且对于结合所述糖有效的结合分子；以及 (e)电压控制电路，其用于在电极之间产生电压并且测量经过所述样品、所述纳米孔和所述内部溶液的正离子电流和负离子电流，由此所述样品中的糖在被结合于包含所述结合分子的所述涂层时导致负离子电流的浓度依赖性变化。
13.根据权利要求12所述的纳米吸量管设备，其中所述结合分子是蛋白质。
14.根据权利要求12所述的纳米吸量管设备，其中所述结合分子是硼酸。
15.根据权利要求12所述的纳米吸量管设备，其中所述纳米吸量管是石英。
16.根据权利要求12所述的纳米吸量管设备，其中所述电压控制电路包括电压钳放大器。
17.根据权利要求12所述的纳米吸量管设备，其中所述涂层包含聚阳离子。
18.一种用于从溶液中的两种不同的离子产生离子化合物的方法，包括: (a)提供在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的至少一种第一离子，所述纳米吸量管在所述纳米吸量管的内部和外部溶液之间具有纳米孔；(b)提供在所述外部溶液中的第二离子物质；以及 (c)把横跨具有相反电荷的所述纳米孔的电压施加于在纳米吸量管的内侧的溶液中具有电荷的所述一种离子，所述电压足以导致所述离子物质向所述纳米孔迁移以与所述第二离子反应以形成离子化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括测量经过所述纳米孔的离子电流并且检测指示所述离子化合物的形成的电流的改变的步骤。
20.根据权利要求18所述的方法，其中指示所述离子化合物的形成的所述电流的改变是振荡。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述离子化合物是不可溶解的。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一离子或所述第二离子是与阴离子反应形成所述离子化合物的金属阳离子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述金属阳离子是过渡金属。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述金属阳离子选自由以下组成的组:Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr6+、Cd2+、Mo2+、Co3+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Al3+、Al2+、Ar3+、Ar3—以及 Pb2+。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述阴离子选自由以下组成的组:磷酸根、氯离子、硫酸根、单磷酸根、焦磷酸根、偏磷酸根、三聚磷酸根、四偏磷酸根以及正磷酸根。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述阴离子选自由有机羧酸阴离子组成的组，所述有机羧酸阴离子选自由以下组成的组:葡糖酸根、酒石酸根、富马酸根、马来酸根、丙二酸根、苹果酸根、乳酸根、柠檬酸根、EDTA、柠康酸根、柠苹酸根、硬脂酸根、油酸根、月桂酸根、辛酸根、抗坏血酸根、吡啶甲酸根和乳清酸根。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述阴离子是蛋白质。
28.根据权利要求18所述的方法，还包括在沉淀物形成之后逆转所述电压的步骤。
29.根据权利要求18所述的方法，还包括检测所产生的离子化合物的形成的步骤。
【文档编号】G01N27/26GK103502804SQ201280021765
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年3月2日 优先权日:2011年3月4日
【发明者】纳德·普曼德, 波阿斯·维洛兹尼, 保罗·阿克蒂斯, R·亚当·赛格, 巴克森·辛加拉姆 申请人:加利福尼亚大学董事会