免疫测定产品和过程的制作方法
【专利摘要】本文公开的实施例涉及在对印迹膜上的化合物进行检测时有用的设备。该设备包括多个层，包括在（一个或多个）印迹膜下面的多孔支撑层、在（一个或多个）印迹膜上面的流量分配器和任选地在流量分配器上的阱，阱将液体容纳到期望区域并允许此类液体的较低起始体积。优选地，流量分配器是非结合或低结合亲水多孔膜，诸如0.22微米膜，并且支撑层是格栅或烧结多孔材料。分配器和支撑体被保持在一起以在（一个或多个）膜周围形成封套。在这样做时，优选地使用铰链、夹持件及其他此类装置。
【专利说明】免疫测定产品和过程
[0001]本申请要求2011年5月11日提交的临时申请序号61/484，701的优先权，其公开内容通过引用结合到本文中。
【技术领域】
[0002]本文公开的实施例涉及用于检测和定位包含在印迹膜中的物质的设备和过程。更特别地，其涉及一种用于向印迹膜施加试剂、洗液和检测化学的技术，以经由真空或正压的使用而快速地实现此检测。
【背景技术】
[0003]凝胶电泳的使用当前是用于生物材料的分离的普遍技术。非生物材料也能够使用凝胶或其他色谱支持来分离，但是相对于生物制剂的努力范围更大。典型的应用包括序列确定背景下；多形态检测中；或者其他背景下的尺寸验证中的各种尺寸的核酸片段的分离。还频繁地执行的是蛋白质、糖蛋白、蛋白质片段的分离和凝胶分离作为均匀性或纯净度的验证、翻译后改性的识别和分子量确认的应用。
[0004]在所有这些程序中，生物实体的混合样本被施加于电泳凝胶，并且通过跨凝胶施加电场来分离各组分。无论用来使凝胶显影的方式如何，都必须以某种方式来检测结果产生的包含在样本中的物质的迁移的图案。
[0005]为了执行此检测，通常，使凝胶支撑体与印记膜接触，物质被以其出现在凝胶上的相同图案传输到该印记膜。然后至少通过用蛋白质或洗涤液阻断膜来检测“斑点”以减少非特定粘合(否则其将导致高水平的噪声和低水平的检测)。典型的阻断剂包括干酪素、牛血清白蛋白(BSA)、具有TWEEN?表面活性剂的缓血酸胺盐溶液(TBS-T溶液)中的脱脂奶粉(一般地约1-5%)或具有TWEEN?表面活性剂的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS-T溶液)。然后用膜上的抗原所特定的抗体来培育生物实体。然后全面地洗涤膜以去除任何污染物、未结合阻断蛋白质或抗体等。然后用一级抗体所特定的二级酶、放射性同位素、氟(f luorf Iuor)或生物素偶联抗体来处理和培育膜。然后全面地洗涤膜以去除未结合二级抗体。然后，施加检测试剂，一般地为发色、化学发光、荧光、放射性或链亲和素标签材料，其结合到或者是酶偶联剂培养基。最后，使用适当的检测设备来确定生物实体的存在、不存在、位置、量等。最后六个步骤一般花费从3-6个小时至整夜，这取决于所选试剂、膜和生物实体之间的反应速度。该过程要求膜在摇动或其他适当的混合平台上的多个培育时段。其是大多数研究人员不喜欢的冗长过程且消耗(浪费)大量的试剂。
[0006]某些研究人员已经建议使用吸收剂材料的毛细管作用，诸如放置在膜下面的滤纸，以通过膜吸取剩余流体并改善该过程、尤其是洗涤步骤的速度。
[0007]US 5，155，049 提到了一种由 Hoefer Scientific Instruments 公司销售的称为Hybrid-Ease ?杂交室的系统。此室包括膜被夹在其之间的两个格栅。格栅板被卡合到围绕膜的位置，以及配合到由格栅产生的开放空间中的注射器。一个注射器被用来施加试剂和洗涤，并且另一个用来收回多余量。该系统要求大量的液体以便进行操作，采用起来是麻烦的，并且仍是相当耗时的。其还提到在某些特定试验中，诸如ELISA试验，在小体积阱中(诸如96孔微量滴定板)中，其他人已使用真空来在洗涤步骤中通过膜吸取液体。然而，这使其努力打折扣，因为其仅在小体积应用中可用且仍是不可控的。他们替代地建议更好的方法是使用在滤纸顶部和覆盖层上具有膜且然后压紧被夹在两个板之间的膜以挤压液体通过膜并进入纸中的手动压力机。
[0008]在2005年12月3日提交的USSN 60/732, 994中，有人建议人们使用由多个层形成的设备，其包括在一层或多层印迹膜下面的多孔支撑层、在印迹膜上面的流量分配器和在流量分配器上以将液体包含在期望区域并允许此类液体的较低起始体积的阱。优选地，该流量分配器是非结合或低结合多孔膜。
[0009]在2006年10月18日提交的共同待审的美国序号11/582，727和11/582，599中，公开了一种设备，其中，保持流体导向器的保持器和多孔支撑体能够配合到歧管设备中以处理各种流体并检测生物实体。该歧管具有带有或没有阱的盖体和与保持器的中心开口成一直线的中心开口虽然有用，但其具有抑制其普遍使用和接受的限制。
[0010]很明显，需要一种用于检测印迹膜上的生物材料或实体的更高效方法。本文公开的实施例允许印迹膜中的生物实体的更有效和高效检测。
【发明内容】
[0011]根据某些实施例，提供了免疫检测系统和方法。该系统包括适合于与诸如真空的驱动力连通的歧管底座。该歧管保持载体，载体支撑印迹膜保持器。印迹膜保持器保持蛋白质能够经由电泳被结合到的印迹膜。该系统和方法使得用户能够快速且高效地使蛋白质印迹准备好用于检测，诸如通过化学发光。
[0012]在一个实施例中，提供了一种在执行本文公开的方法时有用的设备。该设备包括印迹膜保持器(也称为印迹保持器，或者简单地称为保持器)，印迹膜保持器由下多孔支撑层和上流量分配器形成。两者通过诸如用铰链、夹持件、弹性带、粘合剂、球窝、插销和凹坑的方法或者协作接合紧固件或其他此类手段被保持在一起。保持器被打开且一个或多个印迹膜被放置在下层和上层之间。保持器然后被关闭并被放置到由上板和下板形成的载体中，所述上板和下板每个具有至少一个开口，所述开口允许流体通过载体的上板，通过保持器和包含在其内的膜，并且然后通过载体的下板。载体然后被设置于歧管设备中以处理印迹膜上的样本。在该过程完成时，载体被从歧管去除，打开，并且印迹膜保持器被去除。然后，印迹膜保持器被打开并且印迹膜被抽出以用于下游检测。
[0013]在另一实施例中，保持器由选自由塑料和纸组成的组的材料形成，该保持器具有顶部和底部，每个顶部和底部具有外边缘、顶面和底面以及顶面与底面之间的厚度，所述部分中的至少一个具有从外边缘向内的实心部分，至少顶部具有从外边缘向内的开口、在底部的顶面上形成的多孔支撑体以及在顶部的下表面上形成的流量分配器，该分配器覆盖顶部的开口，其中，保持器具有用于在保持器的顶部和底部被对准时可释放地将第一和第二部分相互固定的装置，使得顶部的底面和底部的顶面被对准且被相互邻近地布置以使顶部和底部在一起。
[0014]在另一实施例中，保持器被形成为使得顶部和底部每个具有沿着一侧的穿孔，并且该穿孔在顶部和底部上对准，并且该穿孔易于被撕裂以打开保持器以取回印迹膜。[0015]在一个实施例中，载体具有外周界壁，外周界壁从载体顶板的开口向上延伸以形成阱以保持试剂和洗涤流体。
[0016]在另一实施例中，载体具有一个或多个水平指示器以指示载体的顶面是否至少沿着其长度且优选地沿着其长度和宽度在水平平面中水平。该水平也可以在歧管上。
[0017]在另一实施例中，水平指示器是单个360度气泡指示器。
[0018]在另一实施例中，水平指示器是至少两个线水平气泡指示器，至少一个被沿着顶板的顶面的长度布置并且至少一个被沿着顶板的顶面的宽度设置。
[0019]在另一实施例中，(一个或多个)载体内表面包含用以使保持器中的一个或多个印迹膜伸展从而避免膜中形成褶皱并使膜的表面尽可能平坦或平面化的特征。
[0020]在另一实施例中，载体具有由位于顶板或底板的内表面中的至少一个上的凸缘密封形成的伸展特征。优选地，其具有至少在底板的相邻内表面上形成的凸缘密封。更优选地，凸缘密封所定位的宽度和长度大于保持器的开口但小于保持器外边缘的宽度和长度。
[0021]在另一实施例中，载体具有由位于载体的一半上的可压缩或柔性构件与载体的另一半上的相对凸起的刚性特征组成的伸展特征。
[0022]在一个实施例中，歧管被再分成两个或更多子阱以并行操作印迹膜或者一个印迹膜的子部分，每个膜通常被用至少一种不同的试剂处理。
[0023]在另一实施例中，载体被再分成两个或更多子阱，保持器也被再分成相应的子阱。
[0024]在另一实施例中，载体子阱被单独地与相应的保持器子阱密封并对准从而防止阱之间的流体迁移。
[0025]在另一实施例中，歧管具有找平脚，当结合载体的一个实施例的一个或多个水平指示器来使用时，找平脚允许歧管和载体在水平面中水平。
[0026]在一个实施例中，歧管具有一系列脚，其能够被沿着竖直方向调整，从而当载体被附接于歧管时相对于载体上的(一个或多个)水平指示器使歧管水平。
[0027]在另一实施例中，所述一系列脚具有螺钉，螺钉配合到歧管底部的螺纹部分中以允许脚被沿着竖直方向单独地升高或下降。
[0028]在另一实施例中，歧管被再分成两个或更多子阱以并行操作载体与不同的印迹膜或一个印迹膜的子部分，每个膜通常被用至少一种不同的试剂来处理。
[0029]在另一实施例中，载体顶板开口具有盖，盖被定位于开口的上边缘上以使长期、即整夜培育期间的蒸发最小化。
[0030]在另一实施例中，盖与阱具有可再密封关系。
[0031 ] 在另一实施例中，盖是遮光的，诸如由不透明材料制成。
[0032]在另一实施例中，载体底板上的开口具有盖体以防止流体泄漏。
[0033]在另一实施例中，盖体被被可释放地密封。
[0034]在另一实施例中，盖体具有阀特征。
[0035]在另一实施例中，阀具有鸭嘴或伞状构造。
[0036]在另一实施例中，阀可用压力差操作并且在阀上不存在压力差时闭合。
[0037]在另一实施例中，提供了一种用以检测印迹膜上的一个或多个生物实体的快速、高效且方便的方法。该检测可涉及膜上的生物物质的位置、性质或量。该方法涉及选自正压或真空的压力辅助体系(regiment)，用于向印迹膜供应试剂以及从印迹膜去除试剂，并且允许从被嵌入膜中的物质洗涤污染物，其将使用非常低量的液体和试剂来检测。这种方法使得能够在不损害印迹质量的情况下在约30-45分钟内完成阻断、洗涤和抗体结合步骤。人们简单地获取保持器、将其打开并在表面之一上放置(一个或多个)印迹膜，使得当该设备在(一个或多个)膜周围被闭合时印迹膜的下表面邻近于多孔支撑体且印迹膜的上表面邻近于流量分配器。该设备被放置在具有压力或真空源的歧管上或内，并且所述过程开始。
[0038]本文公开的实施例的另一目的是提供一种用于执行一个或多个印迹的压力或真空辅助免疫测定的设备，该设备包括真空歧管、被设计成配合在歧管上的载体及被设计成配合在载体内以便处理印迹的保持器以及收集抗体中的一个或多个的装置。
[0039]本文公开的实施例的另一目的是提供一种用于对一个或多个膜执行真空辅助免疫测定的过程，该过程包括步骤:
a.提供真空歧管、用于保持保持器的载体、用于一个或多个印迹膜的保持器、包含将要进行试验的一个或多个生物实体的一个或多个膜，该载体由顶板和底板形成，顶板和底板每个具有穿过其厚度形成以允许流体从其中流过的至少一个开口，该保持器能够位于载体的顶板与底板之间并与载体的每个板的至少一个开口流体连通，该保持器由被保持在一起的多孔支撑体和流量分配器形成，所述(一个或多个)膜被放置在多孔支撑体上，流量分配器位于膜的顶部上且保持器被放置在载体的顶板与底板之间，使得流量分配器邻近于顶板的底部或内表面并且多孔支撑体邻近于底板的顶面的内部，
b.向载体顶板的所述至少一个开口添加一种或多种试剂并施加真空以通过顶板中的开口、保持器的流量分配器和多孔支撑体以及底板的开口将试剂拉入膜中，以及
c.向一个或多个阱添加一种或多种洗涤剂并施加真空以拉动洗涤剂和任何未结合的试剂通过顶板开口、流量分配器、膜和多孔支撑体以及载体底板的开口并进入真空歧管中，以及
d.根据期望或需要将步骤(b和c)重复附加的一次或多次。
[0040]在某些实施例中，公开了一种用于执行免疫测定的设备，该设备包括由选自由塑料和纸组成的组的材料形成的保持器，该保持器具有顶部和底部，每个顶部和底部具有外边缘、顶面和底面以及顶面与底面之间的厚度，所述部分中的至少一个具有从外边缘向内的实心部分，至少顶部具有从外边缘向内的开口、在底部的顶面上形成的多孔支撑体和在顶部的下表面上形成的流量分配器，该分配器覆盖顶部的开口，其中，保持器具有用于在保持器的顶部和底部被对准时将第一和第二部分可释放地相互固定的装置，使得顶部的底面和底部的顶面被对准并相互邻近地布置，以使顶部和底部在一起。
[0041]在某些实施例中，用于可释放地固定的装置可以包括在外面形成并围绕多孔支撑体开口的密封材料。保持器的顶部和底部可以由单块材料制成，并且保持器可以具有折痕部，折痕部延伸保持器的宽度以形成第一部分和第二部分。该折痕部可以是铰链。
[0042]在某些实施例中，流量分配器可以具有下表面和上表面，并且流量分配器的上表面可以被附接于保持器的顶部的底面，使得第一部分的厚度形成流量分配器的上表面上的一个或多个阱。顶部的开口居中地位于顶部的外边缘内。
[0043]在某些实施例中，用于执行免疫测定的设备可以包括保持器和用于保持器的载体，该保持器由选自由塑料和纸组成的组的材料形成，该保持器可以具有顶部和底部，每个顶部和底部可以具有外边缘、顶面和底面以及在顶面与底面之间的厚度，所述部分中的至少一个可以具有从外边缘向内的实心部分，至少顶部可以具有从外边缘向内的开口、在底部的顶面上形成的多孔支撑体和在顶部的下表面上形成的流量分配器，该分配器覆盖顶部的开口，其中，保持器可以具有用于在保持器的顶部和底部被对准时将第一和第二部分可释放地相互固定的装置，使得顶部的底面和底部的顶面被对准并相互邻近地布置，以使顶部和底部在一起。
[0044]在某些实施例中，该设备还可以包括由顶板和底板组成的用于保持器的载体，顶板和底板每个具有宽度和长度、顶面和底面以及在顶面与底面之间的厚度、外边缘和至少一个开口，所述板具有大于保持器的长度和宽度的长度和宽度，载体的顶板具有在宽度和长度方面基本等于保持器的顶部开口的开口，顶板的底面和底板的顶面每个具有在两个板相互邻近时相互对准的一个或多个密封，并且所述密封被以大于顶板开口但小于保持器外尺寸的宽度和长度布置在每个表面上，板中的至少一个具有邻近于板的外边缘且从该板的密封向外形成的密封，以及用于将顶板和底板可释放地保持在一起的装置。
[0045]在某些实施例中，顶板的底面和底板的顶面中的密封可以是凸缘密封。
[0046]在某些实施例中，可以存在被附接于顶板的上表面的至少一个水平指示设备，并且其可以包括360度指示器。可以存在两个水平指示器，一个沿着顶板的顶面的长度且另一个沿着顶板的顶面的宽度。
[0047]在某些实施例中，公开了一种用于执行真空辅助免疫测定的设备，该设备包括真空歧管和由塑料或纸形成的保持器，该保持器具有折痕部，折痕部延伸保持器的宽度以形成第一部分和第二部分，每个部分具有在保持器沿着折痕部被折叠闭合时对准的开口，多孔支撑体覆盖第一开口且流量分配器覆盖第二开口，其中，该保持器具有用于在保持器沿着折痕部被折叠闭合时将第一和第二部分可释放地相互固定的装置，以使第一和第二部分在一起。流量分配器可以是膜。
[0048]在某些实施例中，公开了一种用于执行免疫测定的设备，该设备包括具有底座的真空歧管，该底座具有上支撑表面和在支撑体下面的排水沟(drain)，上支撑表面用于支撑包含将要被处理的保持器的一个或多个载体，上表面包含从其中延伸通过的一个或多个中心开口，并且所述一个或多个中心开口与一个或多个载体对准。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1是根据某些实施例的载体的分解图；
图2是根据某些实施例的处于打开位置的载体的透视图；
图3是根据某些实施例的处于闭合位置的载体的透视图；
图4是根据某些实施例的载体的用横截面示出的透视图；
图4A是根据某些实施例的具有伞阀的载体的用横截面示出的透视图；
图5是根据某些实施例的包括印迹膜的印迹膜保持器的透视图；
图5A是根据某些实施例的示出了流量分配器的印迹膜保持器的透视图；
图5B是根据某些实施例的印迹膜保持器的从底侧看的透视图；
图6是根据某些实施例的包括图5的保持器的处于打开位置的载体的透视图；
图7是根据某些实施例的载体的底侧的分解透视图；
图8是根据某些实施例的盖体就位情况下的载体的底侧的透视图；图9是根据某些实施例的歧管的透视图；
图9A是根据某些实施例的具有收集器皿的歧管的透视图；
图10是根据某些实施例的包括载体的歧管的分解透视图；以及 图1OA是根据某些实施例的歧管、保持器和载体的透视图。
【具体实施方式】
[0050]首先转到图1，示出了根据某些实施例的载体10。在所示的实施例中，载体10包括盖11、载体顶板12、载体底板13、盖体14以及在载体顶板12上的气泡水平仪15。根据某些实施例，载体10用于保持印迹保持器扁平，并向印迹保持器输送诸如抗体、洗涤缓冲剂等之类的试剂。根据某些实施例，载体10是与歧管底座(下文讨论)分开的独立器件，其允许用户同时设置多个印迹。因此，每个载体10能够被选择性地加载包含印迹的印迹保持器，添加其各自的抗体，并且然后进行培育。
[0051]图2示出了处于打开位置的载体10的实施例，在图中的左侧示出顶板12的底侧且在右侧示出底板13的顶侧。在所示的实施例中，顶板12和底板13在16处被铰链连接。如在本实施例中所示，铰链是将两个部分结合在一起的“活动(live)”铰链。替代地，可以单独地制作铰链并使用粘合剂、热结合或机械紧固件将其附接。其他实施例不使用铰链(未示出)而是使用夹持件、弹性带或协作接合紧固件(诸如缝槽和制动器)、摩擦配合销等，在相应的顶部和底部上或中形成以在使用期间将其保持在一起。其他相当的装置对于本领域技术人员将是明显的，并且也意图包括它们。
[0052]根据某些实施例，载体顶板12可以具有一个或多个阱22，其能够在使用期间被用于保持和/或输送洗涤流体和试剂。(一个或多个)阱22可以被形成为具有直立壁22a、22b、22c和22d (图1)的载体顶板12的顶面的一部分，或者作为单独件，其被简单地附接或放置在载体顶板12的顶上。盖11能够被放置在载体10上以覆盖阱22并防止抗体及其他流体在延长的培育时段期间、特别是在整夜培育期间蒸发。
[0053]载体底板13包括多孔支撑体4，其可以是简单筛子、格栅、流量导向格栅或烧结多孔结构，诸如P0REX?膜或者粗或大孔的微孔过滤器，诸如纺织或无纺纸、聚丙烯或聚乙烯织物、玻璃垫或纸或者ι-?ο微米微孔过滤器。此类支撑体可以由聚合物、玻璃、陶瓷或金属材料制成，包括但不限于诸如不锈钢或合金钢、铝等金属以及诸如聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚醚砜、苯乙烯、尼龙等聚合物。图2示出了流量导向格栅的形式的多孔支撑体4，其包括一系列凹槽72和开口 74。开口 74位于从多孔支撑体4的周界向内的位置。开口 74与凹槽72流体连通，使得流体被收集在凹槽72中并被指引通过开口 74。凹槽72收集用过的流体并将用过的流体输送到开口 74，其将流体指引到废物室或收集托盘(未示出)。如果研究人员希望收集流体中的一种或多种，则可以适当地将收集托盘定位成这样做。本领域的技术人员将认识到的是可以使用其他图案的凹槽或开口，因为期望的结果是将用过的流体指引至开口或一系列开口，其将用过的流体指引到预定目的地。
[0054]载体顶板12和支撑体4的外边缘可以由与支撑体4相同的材料制成。当使用整体式铰链时，其必须由诸如聚乙烯、聚丙烯、弹性体的柔性材料或诸如ABS、K树脂等冲击改性材料中的一个制成。当使用单独的铰链、夹持件、弹性带、粘性膜或其他固定装置时，其可以根据期望由金属、塑料或弹性体制成。[0055]根据某些实施例，第一凸缘密封30A被定位于如所示的载体顶板12的上侧上，并且可与绕着载体底板13上的多孔支撑体4定位的第二凸缘密封30B协作，当顶板和底板在印迹保持器被接合的情况下处于闭合位置时维持不透流体系统。因此，凸缘密封30A和30B被定位成使得当载体顶板12相对于载体底板13旋转至闭合位置时，两个密封相互配准或对准以将载体密封。在某些实施例中，每个凸缘密封30A、30B优选地由诸如硅树脂或热塑性弹性体(TPE)的柔性弹性体制成，并且是V形的，V的一个支腿短于另一个。每个V形凸缘密封的长端座置在载体顶板和底板的相应凹坑中(图4)。每个V形密封的短支腿是凸起的、可容易变形的特征。在载体闭合和密封位置，载体顶板上的V的较短支腿将接触印迹保持器的顶面。载体底板上的V的较短支腿将接触印迹保持器的底部并偏斜，如在图4中最好地看到的。密封的倾斜几何结构在偏斜时施加力以拉动保持器50或使其伸展，其“敲击(drum)”膜并保持其平坦。平坦膜避免可能在膜表面上产生尖顶和凹处的变形，所述尖顶和凹处聚集抗体体积，这进而导致印迹膜区域或多或少暴露于抗体，导致不良且不一致的结果。此密封防止泄露并使得能够实现长期(例如，整夜)培育。密封的设计还允许低力密封机构和载体10所需的低夹持力。这帮助维持保持器和印迹膜的平坦性。可释放闩锁35或其他锁定机构将载体锁定在闭合位置(图3)。根据某些实施例，能够使用单个凸缘密封，优选地用于底板的凸缘密封30B。底部凸缘密封30B用于使印迹保持器伸展。一旦被伸展，界面被设计成使得载体顶部和底部将印迹保持器夹持就位。在图4中还示出了外凸缘密封300A、300B。
[0056]图5、5A和5B示出了根据某些实施例的保持器2。保持器2包括框架40，框架40具有被构造成支撑蛋白质印迹膜45的周界边缘。在某些实施例中，框架40由塑料或纸构成。在某些实施例中，框架40的材料可以是生物树脂、纸板、HIPS、纸或能够支撑膜并保持其平坦的任何其他适当刚性材料。根据某些实施例，诸如GVPP膜的流量分配器46被层压或附接于框架，并且能够将印迹膜45定位于其上面。流量分配器46被附接于框架，并且当印迹保持器被闭合时，印迹膜被夹在流量分配器46与多孔支撑体47之间。印迹保持器上的多孔支撑体47被支撑并与载体底板的多孔支撑体4接触。流量分配器46用于使阻断溶液和抗体均匀地分布在印迹膜上。其还在施加真空时调节这些溶液的流量。保持器2还包括多孔支撑体47，诸如沿着一个边缘被结合到框架的一块聚丙烯无纺网格，允许用户容易接近以添加印迹膜，并且其支撑印迹膜且防止其在真空力下被损坏。支撑体47是多孔的以允许液体通过印迹保持器2的自由流动。在图6中示出了适当地位于载体10中的保持器2。
[0057]在某些实施例中，能够通过将压敏粘合剂层压到聚丙烯网格的背面来制作保持器2，使得在向保持器添加印迹膜之后，用户去除背衬条以暴露压敏粘合剂，并且然后将网格密封到流量分配器(例如，GVPP膜)以产生密封封套。为了去除印迹膜，可包括穿孔和拉链以撕开封套。
[0058]在某些实施例中，将薄蔬菜纸、蜡纸或纸材料的其他薄片纸张材料层压到聚丙烯网格的一侧。当保持器被用水润湿时(如在过程中要求的)，润湿的纸背衬粘到GVPP膜，产生临时密封。在该过程完成之后，印迹膜易于去除而不必撕裂任何东西或处理粘的粘合剂。保持器然后被去掉，因为在纸背衬干燥之后，其卷曲且保持器变得不可使用。
[0059]图7和8图示出载体底板13的底侧。在图7中可见的是多孔支撑体4中的多个开口 74。盖体14被用来覆盖开口以防止培育期间的抗体泄漏，特别是当长时间培育时，诸如整夜，如在图8中看到的。根据某些实施例，开口 74被环形凸起环49围绕，并且盖体14具有被构造成与环形环49配合的相应环形缝槽60 (图4)，并且因此盖体能够被压到环上以将其固定到载体板13。
[0060]替代地，可以取消盖体14，并且可使用伞阀144来在培育期间保持流体，如图4A中所示。当真空被开启时，阀打开且流体流出。优选地，由于EPDM (乙烯丙烯二烯系单体)的硬度以及能够在真空被关闭时快速地闭合，阀由EPDM制成。这帮助防止背压和空气夹带，背压和空气夹带(在硅树脂阀的情况下)造成印迹保持器弯曲并导致不利的抗体聚集。抗体聚集(不均匀覆盖)导致最终印迹读出上的不均匀信号，夹带空气附近的区域将具有弱信号(模糊的)并且具有聚集抗体的区域将具有强信号(醒目的)。
[0061]如图9和10中所示，根据某些实施例，歧管8是能够被附接于适当的真空源(未示出)的真空歧管。歧管8可以包括废物收集设备(未示出)，诸如位于歧管中的容器(未示出)以收集被拉动通过载体10的液体。
[0062]根据某些实施例，歧管8具有底座42，其具有排水沟和支撑表面44，一个或多个载体10被放置在支撑表面44上。支撑表面44包括一个或多个阱或载体接收区域55A、55B(在图9中示出两个)，其可以包括接收载体底板13的底侧以将载体10以稳定方式保持在歧管8中的多个直立肋56。还示出了用于管理和监视歧管8和该过程的任选的相应控制机构62。如果期望的话，该设备能够与自动化液体搬运器等一起使用。在歧管8被再分成一个或多个阱或载体接收区域的情况下，歧管能够处理超过一个保持器，以并行操作载体与不同的印迹膜或一个印迹膜的子部分，通常用至少一种不同试剂来处理每个膜。歧管8可具有公共压力源，或者可单独地对每个站载体接收区域进行压力控制。
[0063]在另一实施例中，歧管具有找平脚，找平脚当结合载体的一个实施例的一个或多个水平指示器来使用时允许歧管和载体在水平面中水平。在一个实施例中，歧管具有一系列脚，其能够被沿着竖直方向调整，从而当载体被附接于歧管时相对于载体上的(一个或多个)水平指示器使歧管水平。在另一实施例中，所述一系列脚具有螺钉，螺钉配合到歧管底部的螺纹部分中以允许脚被沿着竖直方向单独地升高或下降。
[0064]在本文公开的实施例中可以使用各种方法。关键因素是它们均依赖于液体的真空或正压驱动过滤以接近膜的大的内表面区域，允许遍及整个深度的所有分子的3D相互作用而不是如过去发生的那样在表面处的仅2D相互作用。在使用正压的情况下，底座可以是可容纳载体的封闭室，并且盖11可变成压力歧管以向载体的阱22施加压力。
[0065]最简单方法是使用本文所公开的实施例来执行洗涤循环中的一个或多个。通常，每个洗涤循环由一个或多个洗涤步骤组成。一般地，每个循环使用2-5个步骤。
[0066]另一方法是在需要使液体移动穿过印迹膜的每个步骤中使用本文公开的实施例，诸如在抗体的培育之后或在洗涤步骤中。
[0067]在所有这些过程中，可使用适合于使(一种或多种)液体穿过设备并进入歧管的任何驱动力。这可根据被选择用于印迹的膜和所使用的歧管、过滤的期望速度、以及研究人员可用的真空或正压源而变化。
[0068]一般地，可用真空可以在100和760 mmHg (133毫巴和1013毫巴)之间改变。阀、压力限制器等的使用还可以用来针对所使用的膜将真空保持在允许范围内。一个实施例的优选真空歧管使用约100 mmHg的真空。其他适当的真空歧管包括但不限于可从马萨诸塞州 Billerica 的 Millipore 公司获得的 MULTISCREENm^P MULTISCREEN ? HTS 真空歧管。
[0069]一般地，正压由从约2 psi至约15 psi范围内的压力下的空气线路来供应。阀、压力限制器等的使用还可以用来针对所使用的膜将压力保持在允许范围内。此类压力系统包括但不限于可从马萨诸塞州Billerica的Millipore公司获得的Amicon?搅拌单元设备和可从马萨诸塞州Hopkinton的Caliper Life Sciences公司获得的正压过滤单元。
[0070]为了使用根据本文公开的实施例的设备，人们简单地获取保持器，将其打开并将(一个或多个)印迹膜放置在表面中的一个上，使得当设备在(一个或多个)膜周围被闭合时，印迹膜的下表面邻近于多孔支撑体且印迹膜的上表面邻近于流量分配器，从而在印迹与流量分配器之间不具有气泡。这两个表面之间的气泡能够导致无流量区域。印迹保持器然后被放置在载体内，该载体然后被用闩锁机构牢固地闭合。该设备被放置在具有压力源(真空或正压)的歧管上或中。优选地，(一个或多个)印迹膜已被预先润湿。压力(真空或正压)被开启并且诸如洗涤液或试剂的液体被放置在载体的阱中。该压力持续直至液体已经移动穿过该设备和(一个或多个)膜。然后压力被关掉。
[0071]当使用不止一个印迹膜时，能够将它们串联地相互重叠地布置，并且能够容易地使包含相同期望试剂的足够液体在一个过程步骤中移动穿过多个层。一般地，当使用不止一个层时，优选的是人们每次使用2层和10层之间，优选地在2层和5层之间。
[0072]可在压力源被关闭或压力源仅被短暂地开启的情况下添加液体，从而使液体进入(一个或多个)膜并被允许进行培育(诸如在一级或二级抗体的情况下可能要求的)。压力然后被开启以去除液体和/或用随后使用的另一种液体将其替换。优选地，在洗涤期间，真空被留在开启状态，并且随后添加剩余洗液。
[0073]任选地，如果人们希望 ，人们可将收集器皿70放置在设备下面(图9A)，优选地在歧管本身中或下游，诸如抗体收集托盘。其然后可被用来收集一种或多种未结合试剂，其可能昂贵且可被收集并再循环以供在未来试验中使用。器皿还能够被再分成多个室，多个室与印迹膜的相应部分对准并流体连通。
[0074]另外或替代地，人们可在保持器下面的下游流动路径中放置吸收剂基质，吸收剂基质能够可逆地结合昂贵的一种或多种未结合试剂。该基质优选地采取整块的形式，诸如衬垫、插塞或纸片，其被定位成使得经过印迹膜和保持器的所有液体均经过基质。其然后可被去除且试剂被洗提或者如果期望的话，其可在印迹膜的测试完成之后使结合的试剂就地被洗提。
[0075]还可以将其他过程与本文公开的实施例的设备一起使用。
[0076]该膜在其空隙中包含将要被检测的一种或多种物质。一般地，这些物质由于被从用于电泳或色谱法的实心支撑体印迹或者被直接施加而存在于空隙中，通常以检测特定类型材料的存在、不存在或量，诸如抗体或特定蛋白质，即如上所述的Dot-Blot型试验。然而，膜的定义不限于这些情况，而是适用于膜在其空隙中包含将要被检测的一种或多种物质的任何情况。在被设想供在本文公开的实施例中使用的膜类型中包括一般被用来对电泳凝胶进行印迹的膜，诸如硝化纤维、尼龙或各种其他聚合膜，诸如聚偏二氟乙烯(PVDF)，由马萨诸塞州Billerica的Millipore公司作为IMMOBILON?膜来出售。
[0077]多种材料可被用来复制在各种样本上执行的电泳凝胶的结果，如本领域中所理解的。最常见地，样本包含诸如单独蛋白质、抗体、核酸、低聚核苷酸、复杂碳水化合物类等生物物质，但是该技术的应用不限于这些物质。该技术可应用于在其内部包含将要被检测的物质的任何膜，无论膜或靶物质的化学组成如何。
[0078]当采用表示电泳结果的复制品的膜时，可通过利用包含传输缓冲剂的膜、通过电洗提或通过凝胶的干法印迹来执行要检测的物质从凝胶到膜的传递。用于这些传输的技术在本领域中是公知的，并且并不构成本文公开的实施例的一部分。
[0079]将要被供应的液体可以包含检测试剂，或者可以简单地被作为洗液来提供。检测试剂的性质当然取决于将要被检测的物质。通常，通过抗原与抗体或其免疫反应部分之间的免疫反应来检测蛋白质；通常用适当的低聚核苷酸试样来检测核酸片段的存在。如果需要，可以用标签来补充检测负责与要检测物质的即刻或特定反应的物质，并且可能需要多次施加检测试剂，例如，规程可以包括通过供应用酶(例如，一般地，辣根过氧化物酶)标记的抗体来检测抗原，并且然后通过供应用于此酶的基质来检测此结合。在添加试剂时，虽然并非优选，但可以仅使用正压施主基质来使膜的此组分暴露达限定的时间段。
[0080]在室温下执行本文公开的实施例的方法是最方便的，但是也可使用升高的和较低的温度。这可通过将设备、其周围环境(如在热箱或冷却箱中)或系统中使用的液体加热来实现。
[0081]随后可通过将先前结合的抗体从印迹剥离然后用抗体或其他试样特定其他靶蛋白质进行后续培育而在本发明的设备和过程中用多个抗体或试样来分析印迹。该剥离过程使抗原一抗体键断裂，并且使抗体溶解在周围缓冲剂中。这通常通过清洁剂与热量的组合或通过暴露于高或低PH来实现。该设备与流量分配器组合使得能够使用高或低pH方法来实现印迹的剥离。直接地(例如，使用与用于剥离的相同流量分配器)或随后在储存之后的印迹的后续重新探测可使用与初始探测相同的规程。用于条印迹的适当工具套装可在商标名称 ReBlot ? Plus kit (种类 #2500)、ReBlot Plus-Mild solution (种类 #2502)和ReBlot Plus-Strong solution (种类 #2504)下从 Chemicon International 公司获得。
[0082]在标准西式印迹法中，抗原或靶被传输到膜支撑体，并用适当的试样来探测，诸如抗体、蛋白质(例如，蛋白质A)或血凝素(蛋白质或糖蛋白，其结合到碳水化合物部分)。在某些应用中，使用反向格式(例如，反向阵列)，其中，抗体或其他试样被放置到膜或其他支撑体上(通常以阵列格式)，并且抗原或靶被呈现给阵列上的固定抗体。可通过抗原或靶的标记或通过使用该靶所特定的二级抗体来实现靶一试样结合事件的可视化。反向阵列常常采用靶的混合物，例如用不同的荧光色标记以使得能够实现并行处理的溶解产物。还可用本文公开的实施例来执行反向试验。
【权利要求】
1.一种用于执行免疫测定的设备，所述设备包括由选自由塑料和纸组成的组的材料形成的保持器，保持器具有顶部和底部，每个顶部和底部具有外边缘、顶面和底面以及在顶面与底面之间的厚度，所述部分中的至少一个具有从外边缘向内的实心部分，至少顶部具有从外边缘向内的开口、在底部的顶面上形成的多孔支撑体以及在顶部的下表面上形成的流量分配器，所述分配器覆盖顶部的开口，其中，当保持器的顶部和底部被对准时，第一和第二部分被可释放地相互固定，使得顶部的底面和底部的顶面被对准且被相互邻近地布置，以使顶部和底部在一起。
2.如权利要求1所述的设备，包括密封材料，密封材料在外面形成且围绕多孔支撑体开口以将所述第一和第二部分可释放地相互固定。
3.如权利要求1所述的设备，其中，保持器的顶部和底部由单块材料制成，并且保持器具有折痕部，折痕部延伸保持器的宽度以形成第一部分和第二部分。
4.如权利要求1所述的设备，其中，折痕部是铰链。
5.如权利要求1所述的设备，其中，流量分配器具有下表面和上表面，并且流量分配器的上表面被附接于保持器的顶部的底面，使得第一部分的厚度形成流量分配器的上表面上的一个或多个阱。
6.如权利要求1所述的设备，其中，顶部的开口居中地位于顶部的外边缘内。
7.一种用于执行免疫测定的设备，所述设备包括保持器和用于保持器的载体， a.保持器由选自由塑料和纸组成的组的材料形成，保持器具有顶部和底部，每个顶部和底部具有外边缘、顶面和底面以及在顶面与底面之间的厚度，所述部分中的至少一个具有从外边缘向内的实心部分，至少顶部具有从外边缘向内的开口、在底部的顶面上形成的多孔支撑体以及在顶部的下表面上形成的流量分配器，所述分配器覆盖顶部的开口，其中，当保持器的顶部和底部被对准时，第一和第二部分被可释放地相互固定，使得顶部的底面和底部的顶面被对准且被相互邻近地布置，以使顶部和底部在一起；以及 b.用于保持器的载体由顶板和底板组成，顶板和底板每个具有宽度和长度、顶面和底面以及在顶面与底面之间的厚度、外边缘和至少一个开口，板具有大于保持器的长度和宽度的长度和宽度，载体的顶板具有在宽度和长度方面基本等于保持器的顶部的开口的开口，顶板的底面和底板的顶面每个具有在两个板相互邻近时相互对准的一个或多个密封，并且所述密封被以大于顶板的开口但小于保持器的外尺寸的宽度和长度布置在每个表面上，所述板中的至少一个具有邻近于板的外边缘且从该板的密封向外形成的密封。
8.如权利要求7所述的设备，还包括用于将顶板和底板可释放地保持在一起的装置。
9.如权利要求7所述的设备，其中，底板的顶面中的密封是凸缘密封。
10.如权利要求7所述的设备，还包括被附接于顶板的上表面的至少一个水平指示设备。
11.如权利要求10所述的设备，其中，水平指示器是360度指示器。
12.如权利要求7所述的设备，其中，存在两个水平指示器，一个沿着顶板的顶面的长度且另一个沿着顶板的顶面的宽度。
13.一种用于执行真空辅助免疫测定的设备，所述设备包括真空歧管以及由塑料或纸形成的保持器，保持器具有折痕部，折痕部延伸保持器的宽度以形成第一部分和第二部分，每个部分具有在保持器沿着折痕部被折叠闭合时对准的开口，多孔支撑体覆盖第一开口且流量分配器覆盖第二开口，其中，当保持器沿着折痕部被折叠闭合时，第一和第二部分被可释放地相互固定，以使第一和第二部分在一起。
14.如权利要求1所述的设备，其中，流量分配器是膜。
15.如权利要求7所述的设备，其中，流量分配器是膜。
16.一种用于执行免疫测定的设备，所述设备包括具有底座的真空歧管，底座具有上支撑表面和在支撑体下面的排水沟，上支撑表面用于支撑包含将要被处理的保持器的一个或多个载体，上表面包含从其中延伸通过的一个或多个中心开口，并且所述一个或多个中心开口与所述一个或多个载体对准。
17.如权利要求16所述的设备，其中，底座具有多个站以定位多个载体。
18.如权利要求16所述的设备，其中，底座具有多个站以定位多个载体，并且每个站中的每个载体被再分成两个或更多个阱。
19.如权利要求16所述的设备，还包括:底座具有用于管理和监视歧管及其操作的一个或多个控制机构。
20.如权利要求16所述的设备，底座具有多个站和用于每个站的公共压力源。
21.如权利要求16所述的设备，其中，底座具有多个站，底座具有用于每个站的公共压力源，并且每个站能够被单独地控制。
22.如权利要求16所述的设备，其中，保持器由下多孔支撑体和上流量分配器形成，并且保持器能够在下支撑体与上流量分配器之间保持一个或多个膜，保持器被插到底座的上支撑体上，并且盖体将(一个或多个)`保持器保持就位在底座上。
23.如权利要求1所述的设备，其中，(一个或多个)载体具有被附接于顶板的上表面的一个或多个讲。
24.如权利要求1所述的设备，其中，载体顶板具有开口和位于该开口上的盖。
25.如权利要求24所述的设备，其中，所述盖由遮光材料制成。
26.如权利要求1所述的设备，其中，所述载体底板具有开口和被可释放地密封到所述开口的盖体。
27.如权利要求1所述的设备，其中，所述载体底板具有开口和阀。
28.如权利要求27所述的设备，其中，所述阀具有鸭嘴或伞状构造。
29.如权利要求27所述的设备，其中，所述阀能通过压力差操作，并且在阀上不存在压力差时闭合。
【文档编号】G01N31/22GK103502808SQ201280022626
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年5月10日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】C.斯科特, P.克拉克, K.E.格林尼真, R.A.阿马拉, R.科隆纳 申请人:Emd密理博公司