宽场显微镜照明系统和宽场照明方法
【专利摘要】本发明涉及一种宽场显微镜照明系统和一种照明方法。照明光在位于给定的照明光入射面内部的照明光入射位置上发送到显微镜物镜。这些照明光入射位置由受控的、自动的照明光光路操纵装置自动地以时间间隔改变到多个照明光入射位置，用于使物镜免受射线过负荷的损伤。
【专利说明】宽场显微镜照明系统和宽场照明方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有显微物镜的宽场显微镜照明系统，该显微物镜具有光学物镜轴，其中照明光线通过物镜发送到通过显微镜观察的试样上，本发明还涉及相应的照明方法。
【背景技术】
[0002]近年来，光学显微方法得到发展，该方法能够基于对单个点目标，尤其是荧光分子的有序、随机的定位示出图形结构，该图形结构小于由衍射造成的传统光学显微的分辨极限。这种方法例如在W02006/127692A2 ；DE102006021317B3 ；W02007/128434A1 ；US2009/0134342A1 ；DE102008024568A1 ;“Sub-diffraction-limitimaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)，，，NatureMethods, 793-796 (2006), M.J.Rust, M.Bates, X.Zhang ； ” Resolution of Lambda/IOinfluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”，GeislerC.et al Appl.Phys.A, 88，223-226 (2007)中描述过。显微镜的这种新的分支也称为定位显微镜。
[0003]在这些新的方法中共同的是，通过标记来制备要成像的结构，它们具有两种不同的状态，即“明亮”状态和“黑暗”状态。如果例如使用荧光染料作为标记，则明亮状态是发荧光的状态，黑暗状态是无荧光的状态。为了以低于传统的成像光学系统的分辨率极限的分辨率成像图片结构，现在标记被重复地以小的低剂量制备到明亮状态下。这个低剂量下文称为有效的低剂量。在此这样选择有效的低剂量，使得在明亮状态中相邻标记的平均距离大于成像光学系统的分辨率极限。有效低剂量的亮度信号在空间分辨的光检测器上、例如(XD相机上成像。由此由每个标记检测光斑,其大小通过成像光学系统的分辨率极限确定。
[0004]通过这种方式拍摄许多原数据单像，在其中总是以另一有效的低剂量成像。然后在图形分析过程中在每个原数据单像中确定光斑的重心，它们是位于明亮状态中的标记。然后将由原数据单像获得的光斑重心汇集在总图里面。通过这个总图产生的高分辨率图形再现标记分布。对于代表要成像结构的输出必需检测足够多的信号。但是因为在各有效的低剂量里面的标记数量受到最小平均间隔(两个标记在明亮状态中相互间允许存在的距离)的限制，必需拍摄非常多的原数据单像，用于完全成像结构。原数据单像的数量一般在10，000 至 100，000 范围。
[0005]对于拍摄原数据单像所需的时间向下受到成像检测器的最大图形拍摄率的限制。这对于总图必需的原数据单像系列导致相对较长的总拍摄时间。因此总拍摄时间可能直到几小时。
[0006]为了尽可能减少整个拍摄时间并且尽可能地短，必需使每个单个原数据的拍摄时间尽可能地短。为此必需使产生标记的各个光斑非常快速地出现，其中它们为了良好地定位当然必需是明亮的。这意味着，在标记再过渡到无效状态中之前，位于有效状态的标记非常快速地发出非常多的光子。如果现在单个原数据图形的拍摄时间相应地适配于标记的平均照明时间，则得到尽可能快地拍摄。典型的标记是(可控的或不可控的)荧光分子。它们在一定的时间空间里面发送的光子越多，它们就获得越多的光子激发光。因此必需以高光强辐射分子。只有这样才能够实现尽可能快速的图形拍摄。
[0007]当使用完全通常的、不可控的荧光分子作为标记时，高光强尤其是有利的。它们与特殊控制的染料相比是有利的，通常可更简单地操纵并且实现更好的色彩结果。此外大量不同的染料可供使用。特殊控制的染料在其数量上是有限的并且经常不能方便地操纵。因此这个标准染料的有效状态对应于分子在其基本状态或者第一激励状态，其总是能够发送光子。无效状态是分子的黑暗状态，如同每个通常的荧光分子示出的状态那样，例如三重线状态或者还原或氧化的状态。分子一般以微少的可能性从激发状态变换到黑暗状态并且在一定的时间后再自动过渡到基本状态，在该状态它仍然可以发出荧光。通过这个事实分子显示出闪光特性:它一直发出光子，直到它自主地从激发状态过渡到黑暗状态。这些光子在其整体上形成光斑。现在分子保留在黑暗状态，直到它自主地再过渡到有效的状态。在黑暗状态时间里面分子不发出光子并因此不发出可检测的信号。因为黑暗状态可以非常任意地长，但是在高光强时非常快速地出现光斑，因此这个特性以闪光显示。为了在这个状况下达到只能看到单个的分子的状态，即在有效的状态，激发光的光强必需非常高。只有这样能够使几乎所有分子位于无效状态，因为一旦它们自主地变换到有效状态，它们由于激发光的高强度引起发送快速的光子序列，并且又“闪电式”地消失。由此只能同时看到非常微少的光子。在这里激发光的高强度不仅能够实现快速地拍摄图形，而且用于调整足够小的从有效到无效标记的特性。
[0008]通过上述解释清楚的是，必需将高光功率带到试样里面。一般以所谓的“宽场”方法实现试样照明。这意味着，尽可能均匀地照明试样中的大面积，即，正好是通过成像光学器件在检测器上成像的范围。一般通过相同的物镜实现照明，该物镜也收集荧光，并且利用相应的其它光学器件在检测器上成像试样。
[0009]为了尽可能均匀地照明试样的大范围，使光线聚焦在物镜的后焦面里面。根据聚点在后焦面中的大小，在前焦面中、即在试样面中得到照明场的大小。在此适用的是:在后焦面中的焦点越小，照明场越大，反之亦然。为了可以照明相应大的范围，因此使整个激励光线作为小的光射线偏转到物镜里面。其结果是，在通常的物镜中激励光作为相对窄的射线束横穿物镜中的透镜。在此在物镜中存在这样的范围，在该范围中射线束更宽或更窄。但是在这种形式的照明中透镜的整个孔径一般没有充分利用，而是光线总是只以非常细的射线束通过透镜。因为如上所述一般必需将非常高的光功率加入到试样里面，通过细的射线束在物镜中达到极其高的光强。因此为了达到这个光强对于在定位显微镜中的宽场照明经常使用激光。
[0010]复杂的透镜或透镜系统，如同它们在物镜中出现的那样，一般含有不同的材料，它们在高光强时可能受到损伤。在这里“最弱”的环节一般是光学密封剂，通过它例如使不同的透镜部件相互连接。但是透镜玻璃上的表面覆层或者玻璃本身在极限状况下也有可能受到损伤。
[0011]因此在通过强烈照明提高光学器件“负荷”时，可能导致在光学器件中的损伤，它们可能不利地作用于照明、也包括检测的光路。因此例如可能存在“盲斑”，它们点状地吸收、衍射或强烈散射光线。也可以设想在玻璃中的小孔等。这种损伤可能使物镜完全不能使用。如果例如盲斑正好在照明光路(在那里它尤其通过射线负荷产生)里面，物镜不再能够使用，因为不再由光线或者至少没有干净的照明射线从物镜在试样方向上发出。此外这种损伤也不利地作用于检测光路，因为它同样通过物镜，并且在有损伤的物镜位置上影响，例如散射检测光。
[0012]即使制造没有密封剂的简单光学系统是已知的，但这些系统一般在机械上更脆弱且更不稳定，并且在其它光学特性方面也是不利的。但是与射线负荷相比这些系统明显更稳定，因为去掉了射线负荷脆弱的光学密封剂。但是在复杂的光学系统例如专用物镜中，按照目前的技术手段没有光学密封剂不能加工或者只能以显著更高的费用加工。因此更重要的是，在密封的光学系统中也防止这种损伤，因为否则将强烈地限制物镜在实际使用时的使用寿命。尤其因为物镜是非常费事的零部件并且是相应昂贵的。
[0013]在更准确地观察问题时得出，典型的射线损伤按照类似的模式发生:大多不立刻在光线首次接通时受到损伤。通常使用使有问题的光学元件能够长时间耐用的光功率。但是经常可以确定光学器件透射缓慢地减少。这在密封光学器件中推测源自密封剂在光影响下的变化。但是在一定时间过后达到临界的阈值，有问题的元件在照明位置显示出瞬间突然变化，它可能导致元件在照明位置和其周围点状或者(在相应剧烈反应时)完全不再透射光线，或者使光线例如剧烈散射，并因此不能使用。
[0014]在产生这种突然变化之前，经常可以识别到光学特性的边缘变化，它可以通过适合的和准确的测量方法测到，但是一般被忽略。光学器件因此可以完全正常地使用，直到突然出现变化。因此物镜的损伤或损毁是高度非线性过程，这在下面的发明中被充分利用。
[0015]当然，所述问题不仅在定位显微镜中出现，而且也在各种形式的显微镜中出现，其中使用通过物镜发送的高照明光强。尽管这特别在荧光学显微镜中发生，但是在光学显微镜中也是这种情况。
【发明内容】
[0016]本发明的目的是，在通过显微物镜实现的宽场照明中，而且也在照明光线高光强时防止损伤物镜。
[0017]按照本发明的第一方面，这个目的通过一种宽场显微镜照明系统实现，它具有:显微物镜，它具有光学物镜轴；照明光源，它沿着具有相应照明轴的照明射线光路发送宽场照明光，沿着照明轴照明光通过位于给定的照明光入射面内部的照明光入射位置进入到显微物镜里面；空间分辨的光检测器，它检测由被照明的试样通过显微透镜沿着检测光光路发送的检测光；和由控制器控制的、自动的照明光光路操纵装置，它在照明光光路方向上设置在显微物镜前面，并且利用照明光光路操纵装置使照明轴自动地以时间间隔运动到多个照明光入射位置。
[0018]按照本发明的第二方面，这个目的通过一种宽场照明方法实现，用于照明通过显微镜观察的试样，其中显微镜配有:显微物镜，它具有光学物镜轴；和照明光源，它沿着具有相应照明轴的照明射线光路发送宽场照明光，沿着照明轴照明光通过位于给定的照明光入射面内部的照明光入射位置进入到显微物镜里面；其中所述照明方法配有这样的重复地、自动地、平行地以时间间隔相对于光学物镜轴调整的照明轴，使得自动调整照明轴相对于物镜轴的侧向偏移，由此使照明光入射位置以使所述物镜免受照明光损伤的时间间隔在给定的照明光入射面内部调整。
[0019]按照本发明的优选实施例，所述照明轴总是平行于物镜轴延伸。尽管在物镜中略微偏离的入射角导致对于物镜的照明侧向偏移，这个偏移或者可以忽略，或者在某些特殊应用中甚至是期望的。但是通常至少基本平行于物镜轴选择入射角，至少当要避免补偿从物镜发出的照明光相对于试样更剧烈地侧向偏移的时候。在方法步骤描述中优选的实施例含有相对于物镜轴平行地调整照明轴的步骤，并且在相对于物镜轴自动调整照明轴侧向偏移时保持这种平行性。
[0020]按照本发明的优选实施例，所述宽场显微镜照明系统是定位显微镜的组成部分。这个特殊的应用缘于相对较高的光强作为照明光通过物镜发送，其中对于照明光射线入射到物镜里面只利用相对微小的物镜孔径部分，即射线横截面与物镜的整个入射面相比相对较小，并且可能(但是不强制)只有在通过物镜时才准直到更大的射线横截面。但是也可以在其它显微镜作为定位显微镜时使用，例如在对于照明光使用高光强的光学显微镜中。
[0021]按照本发明的优选实施例，所述显微镜照明系统是TIRF照明系统的组成部分。因此这尤其是有利的，因为通过按照本发明的照明系统通过相对简单地实现照明光相对于光学物镜轴的侧向偏移能够在物面中调整不同的照明角度。按照本发明的有利改进方案，按照本发明方法的特征相应地在于，由至少两个附属于不同的照明模式的不同照明光入射面中选择给定的照明光入射面，所述不同的照明模式可以有利地是落射荧光(epif luoreszen)照明和TIRF照明。在此落射荧光照明也可以通过略微偏离光轴的角度实现，但是该偏离对于照明试样是可忽略的。尽管在实践中可以通过小得多的偏差工作，但是对于许多用于照明试样的应用甚至可以忽略与光学物镜轴30度的偏差。
[0022]按照本发明的优选实施例，所述照明光光路操纵装置具有光学机构、声光调制器(AOM)或者电光调制器(Ε0Μ)，它们调整可调整的射线偏移并因此调整与光学物镜轴相比可调整的照明光入射位置。尤其AOM和EOM提供了非常快速地实现照明光光路的侧向偏移的可能性。但是因为物镜已经在一个确定的时间空间上承受射线负荷，因此在转换速度方面光学机构也足够了。
[0023]按照本发明的优选实施例，所述控制器具有随机激励器，它在针对照明光在物镜中的给定的照明光入射面的范围中控制许可的可调整的射线偏移，其中所有由控制器许可的照明光入射位置位于这个给定的照明光入射面内部。在按照本发明方法的表述形式中，有利地在给定的照明光入射面内部随机地选择照明光的各照明光入射位置，并且在各时间间隔上保持这些照明光入射位置，直到在给定的照明光入射位置内部随机地选择下一照明光入射位置。作为备选方案可以按照给定的模式选择不同的照明光入射位置，即，在给定照明光入射面内部按照给定的模式选择照明光的各照明光入射位置，并且在各时间间隔上保持这些照明光入射位置，直到在给定的照明光入射位置内部按照给定的模式选择下一照明光入射位置。
[0024]按照本发明的优选实施例，储存已经运行的照明光入射位置和在其上发送的射线量。由此一方面对于使用者能够推导，何时物镜可能损坏，由此可以预防性地更换。此外通过这些信息自动的照明光调整装置在更换照明光入射位置时总是这样选择新的照明光入射位置，即使它落入到一个范围，它与其它位置相比还更少地损伤过。由此与纯随机控制地调整相比，能够达到更均匀且由此延长使用寿命的效果。
[0025]按照本发明的优选实施例，设有控制界面，利用它可以输入用于调整所述给定的照明光入射面的控制命令。这或者可以调整不同的照明模式，它伴随不同给定的照明光入射面，或者可以找到保护物镜的其它选择，例如另一远离光轴的位置，如果靠近光学物镜轴的位置由于太高的射线负荷被所谓的消耗的时候。
[0026]按照本发明的优选实施例，所述给定的照明光入射面是圆形的、圆环形的、环形的或环扇形的表面。但是也可以选择各种其它任意的表面，例如正方形、矩形或三角形。
[0027]按照本发明的优选实施例，设有一测量装置，它监控物镜的透射并且如果透射落到给定极限值以下发送控制信号给控制器。换言之，对于各个照明光入射位置测量物镜的光学透射，并且对应于各照明光入射位置的光学透射在时间上的变化调整时间间隔。由此只有当以前的位置所谓耗尽时，才调整物镜里面的照明光入射面。由此能够限制转换过程的次数。但是因为这些干扰是最小的并且大多根本感觉不到，也可以在给定的时间间隔中实现转换，或者以通过控制信号调整的时间间隔。
[0028]下面更详细地描述本发明:
[0029]如果在一定的照明时间过后，但是它位于光学器件损坏阈值以下，照明光路在光学器件中自动地在位于附近的位置导引，由此可以防止光学器件在第一位置损坏。现在，在照明光路又被移动到另一位置之前，新的位置又可以被照明相应的时间。通过这种方式使原先被照明的位置如上所述只以光学上可忽略的方式损伤。根据光射线具有怎样的直径和光射线可以在其上移动的光学器件范围多大，直到损坏阈值之前可以照明非常多的不同光学器件位置，而在之后的光路中没有不期望的影响。根据能够照明的位置数量得到允许延长物镜的使用寿命的系数。
[0030]如同在上面的段落中已经表明的那样，一般不能以任意的方式和方法移动光学器件中的光路，因为这导致光路在后面的部位中变化。但是在非常小的射线直径和相应大小的相关光学器件时经常提供足够的作用空间，可以运行许多不同的位置并因此数倍地提高光学器件的寿命。这在大面积照明显微试样的具体示例上是明显的。在这种情况下临界的零部件是物镜。存在不同的典型的照明形式，例如落射荧光照明。在这里激励光聚集在后焦面的中心。其结果是，从物镜中心发出准直的光并且在试样中大范围地照明。如果现在照明光路略微偏移，光以确定的角度从物镜发出。这个角度越大，光射线越远离物镜孔径中心。
[0031]但是在实践中对于许多试样完全不重要的是，它们是否被垂直的或者略微倾斜的光线照明。试样经常是非常扁平的(例如盖玻片上的细胞)，因此某个角度根本不重要。如果光线以略微偏离垂直、即光学的物镜轴走向的角度照射到试样上，试样犹如与垂直照射一致地被照亮，尽管在物镜本身中是另一位置被照明。尤其在上述显微技术中主要以平面的试样工作，因为在较厚的试样中本来就存在得到不期望的背景信号的问题。因此存在大量可能的替代照明光路供使用，它们能够实现数倍的物镜使用寿命。对于所有入射到环内部的物镜里面的光路，可以忽略光线在试样里面的偏转。但是它们都在物镜内部占据不同的路径。
[0032]另一照明形式是TIRF照明，它在所述的显微技术中同样是非常受欢迎的。在这里照明光路在物镜孔径的边缘上移动。现在在物镜上的输出角度这样大，使得在适合的试样中产生全反射，并且试样只被瞬逝场照明。因此使背景光渐隐。瞬逝光的进入深度取决于角度。但是对于所有位于以确定的半径围绕孔径中心的圆上的点，它们具有相同的输出角度。因此大量的点可以在这个圆上运行，而不会改变在试样中的进入深度。此外在这里附加利用的另一效应是=TIRF的效应也是非常非线性的。即，突然使用全反射和相关的TIRF效应，并且使进入深度的变化随着角度的变化是相对微小并且在许多应用中不是最为重要的。特别重要的是，完全实现TIRF效应。在许多应用中进入深度是否为90nm或200nm是次要的。因此根据相关具体进入深度的重要性也可以运行更小或更大半径的范围，但是仍然保持得到TIRF效应。因此在物镜中存在许多其它位置供使用，它们提供可选择的光路。
[0033]由上述解释能够认识到，通过所述的方法正好可以在示例的应用中实现物镜寿命的极大延长，不会明显限制显微镜的功能性。
[0034]在上述应用中，即在具有落射荧光照明或TIRF照明的宽场显微镜中通常已经设有光学器件、声光学器件或光机械，它们允许根据对于TIRF效应或者对于落射荧光照明必需的输出角度操纵照明光。因此也可以使用该光机械以实现小的实现上述效果的射线偏移距离。可以按照不同的模式实现射线偏移，例如射线可以按照事先确定的模式以适合的时间间隔自动地总是运行到物镜上的其它点。例如也可以实现随机发生控制的运行，它例如在每次测量时或者在另一适合的时刻以后照明在物镜中的随机的另一点。因此在大的时间空间上实现物镜的均匀射线负荷。运行的点要位于一范围内，它在与理想状况的不期望的光学偏差方面还是能够容忍的。
[0035]可以通过不同的方式确定适合于新的点运行的时刻。一方面可以按照相对短的时间空间变换位置，但是在物镜寿命过程中多次地运行每个位置。因此物镜在较长的时间空间上看去均匀地被照明，这是值得期望的。
[0036]另一方面也可以直到快达到损坏的射线量之前照明每个位置，然后运行另一点。可以不同地获得达到损坏射线量的时刻，例如测试测量可以获得常见的量。然后对应于每个点要远在损坏阈值以下照明，由此使物镜不会提前出现损伤。
[0037]作为另一选择也可以通过在照明期间的测量获得达到损坏阈值。如上所述，能够以足够准确的测量仪确定光学器件在射线影响下的变化，例如在其中光学器件的透射逐点地略微降低。可以在测量期间监控这个透射并且可以自紧邻于损坏阈值之前的预定的临界透射起变换照明点。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]下面借助于本发明的优选实施例参照附图详细解释本发明。在附图中示出:
[0039]图1按照本发明的显微镜示意图，没有照明光光路相对于物镜光轴的侧向偏移，
[0040]图2按照本发明的显微镜示意图，具有照明光光路相对于物镜光轴的侧向偏移，
[0041]图3在图4中以Y-Z表示的物镜剖面，具有不同的照明光光路A，B，C，
[0042]图4在图3中以X表示的物镜俯视图，具有不同的照明光光路A，B, C，
[0043]图5目标和目标支架的侧视图，具有两个不同的照明光光路A和B，
[0044]图6目标和目标支架的侧视图，具有两个不同的照明光光路A和C，其中照明光光路C演示TIRF照明的特殊情况。【具体实施方式】
[0045]图1简示出显微镜，在其中作为组成部分安装了按照本发明的宽场显微镜照明系统。为了更清楚地表示，示意图相对较多地偏离实际的比例。所示的显微镜原理结构是一种倒置显微镜，在其中试样位于上方，照明光从下向上发出，用于在上方照射试样并且照明试样。当然，也可以使用常见的结构，具有位于下面的试样和位于上面的检测器。光源1、例如激光发出第一光束2到照明光光路操纵装置21，它例如由可翻转的反射镜3和透镜4组成。由照明光光路操纵装置21发出的光束5在二向色镜6上以收敛的光束7形式反射到物镜8，它在这里为了简化以简单的透镜表示。物镜8准直光束并且发送这个光束作为准直的光束9到物面10。从这里开始要检测的检测光11从在这里未示出的目标发出。在这里只示例地示出从目标的一个点发出的检测光11。当然目标也可以在所有其它照明点上发出光。要被检测的光通过物镜8和在检测光路方向上透射的反射镜6并且被管透镜12偏转到检测器13上，后者对于接收的光强允许指定方位。对于这种指定方位的检测器的示例是CCD相机或CMOS相机。如同由图1的视图看到的那样，物镜8与管透镜12共同作用聚焦检测光在检测器13上。
[0046]点划线表示光学物镜轴14和照明光操纵装置21的附加对称轴15。按照图1的视图由照明光光路操纵装置21没有调整用于照明光光路的侧向偏移，即，照明光光路沿着光学物镜轴14发送到物镜8，或者换言之，照明光光路的对称轴与光学物镜轴14重合。这是落射荧光照明的特殊情况，其中照明光一般中心地通过物镜8发送。
[0047]图2示出与图1类似的视图，仍以明显偏离的比例以表明其功能。在这里示出照明光光束7的侧向偏移，其对称轴与光学物镜轴14侧向偏移地延伸。为此照明光光路操纵装置21得到一控制命令，根据该命令照明光光路操纵装置21使在其中含有的反射镜3偏转，由此使源自光源I的光束2在其方向上这样改变，使它在照明光光路操纵装置21的透镜4后面侧向偏移并且会聚，这通过从照明光光路操纵装置21发出的光束5表示。反射镜3的倾翻可以在两个不同的方向上实现，即，在图面内和离开图面或进入图面。通过两个倾翻方向使任意的点在物面上运行。作为廉价的解决方案也可以只实现一个倾翻方向，由此使照明光只能沿着一个透镜侧向相对于光学物镜轴偏移。
[0048]收敛的光束5的侧向偏移在反射镜6上反射后继续，并且在通过物镜8以后导致由物镜8发出的照明光光束9准直并且具有相对于光学物镜轴14的角度a。但是这个角度a对于目标16的有效照明小到可以忽略。从目标16发出检测光11。在这里为了更清楚地表示，与图1 一样只示例地示出从目标16的一个点发出的光。当然，实际上目标16的许多点都发出光。它可以是由所期望的荧光以及被试样反射的和散射的光的混合体。它被物镜8与管透镜12的共同作用聚焦在检测器13上。因为对于大多数应用、至少对于在定位显微镜中的应用首先要检测在所有方向上发出的突光，并且被目标反射和散射的光对于大多数应用甚至通过滤色镜阻挡，因此照明光入射到目标16上的角度尤其被忽略，因为这个角度对于反射方向的影响不影响评价，如果反射光本来就被阻挡并且只检测本来在所有方向上发射的突光。
[0049]实际上进入到物镜8里面的照明光光束7具有比物面相比更小的横截面，如同在图2所示的那样，即，只有很少比例的孔径或物镜面积被利用。
[0050]在图3中示出物镜8的示例，它在图1和2中为了简化仅仅以简单透镜表示。图3示出按照在图4中以YZ表示的示意剖面图。代替由简单透镜组成，实际上物镜一般由具有多个透镜的透镜组组成，它们经常至少局部地通过光学密封剂相互连接。典型的密封面在图3中通过附图标记22表示。如上所述，这个密封面22在太长时间区间上的太高射线负荷方面是特别敏感的。
[0051]在图3的视图中示出三个不同的光路。第一光路A与光学物镜轴一致，第二光路B与光学物镜轴略微偏移地设置，第三光路C更远地相对于光学物镜轴14偏移。孔径通过D表示。图4示出物镜8的俯视图。这个俯视图在图3中通过X表示。
[0052]当然，沿着光路A，B，C (它们在图3中只通过其各自的光轴表示)，实际上光束通过确定的横截面发送到物镜8里面，并且被物镜准直，如同已经借助于图1和2所示和解释的那样。因为是宽场照明，因此需要按照其照明在物面10中的相关场。
[0053]如同由图3可以清楚看到的那样，照明光光路A，B, C侧向相对于光学物镜轴偏移越多，照明光以越大的角度α在物面10中入射。按照照明光光路B照明光只以非常微小的偏离光轴的输出角从物镜8入射到物面10里面。被照明的试样在所有方向上发射出，一方面荧光、另一方面反射的和散射的光。对于定位显微镜尤其荧光是有意义的，在检测光发送到指定方位的检测器13上之前，它例如可以通过滤色镜从整个检测光中滤出(见图2)。
[0054]如图4所示，仍为照明光光路B的小平行偏移，但实现多个照明光入射位置，即以圆环23的形式，它围绕光学物镜轴14同心地延伸。当然，如果仍允许按照光路B的偏移，也可以有更小的偏移，因为它们导致更小的偏差角a。因此在物镜8上得到允许的照明光入射面24，它可以预先给定并且根据应用也可以通过控制信号改变。
[0055]在图5和6中简示出本发明的另一特殊应用。在各实施例中照明光光路也从下向上延伸，这例如是在倒置显微镜中的情况。目标16例如可以是细胞，它们设置在盖玻片17上面。在这个视图中也示出许多按照光路A和B的射线，如同例如在图3和4中解释的那样，其中光路B相对于光学物镜轴略微偏移。它是宽场照明，由此在按照图5的视图中已经考虑到，示出多个按照光路A和B的射线，而不是只示出如图3所示的光路A，B和C的光轴。如同看到的那样，对于目标16的照明在实践中略微偏离落射荧光照明的角度是可以忽略的。
[0056]按照图6示出光路C，同样具有对应于宽场照明的多个射线，具有大的偏离光轴的角度，如同在照明光入射位置相对于物镜光轴大偏移时所调整的那样，这与在图3和4中所示的相同。这个大角度α的特殊情况可以用于所谓的TIRF照明。对于这种照明充分利用在介质界面上的全反射效应，其条件是目标16 (在这里是细胞)的折射率小于目标支架(在这里是盖玻片17)的折射率。在大角度α时在盖玻片17与目标16之间的界面上产生全反射。但是在这种情况下也存在目标16的照明，但是只在瞬逝场中。由此得到本发明的另一应用，即，在试样的正常照明与TIRF照明之间转换的可能性。对于这种转换只需在控制器20 (见图2)上给出控制命令，通过它改变给定的照明光入射面。在光学物镜轴与照明光入射位置之间的理论上最大可能的偏移通过孔径D确定。因为角度α越大，偏移越大，角度α越小偏移越小。但是对于TIRF照明不允许角度α落到产生全反射的角度以下。因此，定义对于TIRF照明允许的照明光入射位置的给定的照明光入射面形成圆环形的表面。而对于正常照明允许的、给定的照明光入射面24可以是圆表面(见图4)，它被圆环形的、给定的TIRF照明光入射面包围。[0057]在对于各种应用允许的、给定的照明光入射面内，自动地改变照明光入射位置，这可以在固定给定的时间区间并且按照固定给定的模式实现，但是也可以根据测量信号实现，例如如同在图2中所示的那样，通过测量装置18测量物镜8的透射，如果透射落到一定的极限值以下的时候，测量装置18可以通过信号导线19发送信号到控制器20，然后改变照明光入射位置。对于根据时间改变照明光入射位置的另一判据可以是射线负荷，它由对于各照明光入射位置的射线强度与时间的乘积给出。也可以通过随机激励器随时间改变入射位置，激励器是控制器20的组成部分。
[0058]附图标记清单
[0059]I 光源
[0060]2射线束
[0061]3反射镜
[0062]4 透镜
[0063]5射线束(从照明光路操纵装置发出)
[0064]6 二色的反射镜
[0065]7射线束(会聚，被二向色镜反射)
[0066]8 物镜
[0067]9射线束(从物镜作为准直的照明光发出)
[0068]10 物面
[0069]11检测光
[0070]12管透镜
[0071]13检测器
[0072]14光学物镜轴
[0073]15附加对称轴
[0074]16 目标
[0075]17盖玻片
[0076]18测量装置
[0077]19信号导线
[0078]20控制器
[0079]21照明光线光路操纵装置
[0080]22密封剂面
[0081]23 圆环
[0082]24允许的照明光进入面
【权利要求】
1.一种宽场显微镜照明系统具有: 显微物镜(8)，具有光学物镜轴(14)； 照明光源(1)，它沿着具有相应照明轴的照明射线光路(A，B，C)发送宽场照明光，沿着照明轴照明光通过位于给定的照明光入射面(24)内部的照明光入射位置进入到显微物镜(8)里面； 空间分辨的光检测器(13)，它检测由被照明的试样通过显微透镜(8)沿着检测光光路发送的检测光(11);以及 由控制器(20)控制的、自动的照明光光路操纵装置(21)，它在照明光光路方向上设置在显微物镜(8 )前面，并且利用照明光光路操纵装置(21)使照明轴自动地以时间间隔运动到多个照明光入射位置。
2.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述照明轴总是平行于物镜轴(14)延伸。
3.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述宽场显微镜照明系统是定位显微镜的组成部分。
4.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述显微镜照明系统是TIRF照明系统的组成部 分。
5.如权利要求1至4中任一项所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述照明光光路操纵装置(21)具有光学机构、声光调制器(AOM)或者电光调制器(EOM)，其调整可调整的射线偏移并因此调整与光学物镜轴(14)相比可调整的照明光入射位置。
6.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述控制器(20)这样配置，它按照给定的模式在针对照明光在物镜(8)中的给定的照明光入射面(24)的范围中自动控制许可的可调整的射线偏移，其中所有由控制器(20)许可的照明光入射位置都位于这个给定的照明光入射面(24)内。
7.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于，所述控制器(20)具有随机激励器，它在针对照明光在物镜(8)中的给定的照明光入射面(24)的范围中控制许可的可调整的射线偏移，其中所有由控制器(20)许可的照明光入射位置都位于这个给定的照明光入射面(24)内。
8.如权利要求1所述的宽场显微镜照明系统，其特征在于控制界面，利用它能够输入用于调整所述给定的照明光入射面(24)的控制命令。
9.如权利要求1-8中任一项所述的显微镜照明系统，其特征在于，所述给定的照明光入射面(24)是圆形的、圆环形的、环形的或环扇形的表面。
10.如权利要求1-9中任一项所述的显微镜照明系统，其特征在于测量装置(18)，它监控物镜(8)的透射并且如果透射位于给定极限值以下时，发送控制信号给控制器(20)。
11.一种宽场照明方法，用于照明通过显微镜观察的试样，其中所述显微镜配有: 显微物镜，具有光学物镜轴；和 照明光源，它沿着具有相应照明轴的照明射线光路发送宽场照明光，沿着照明轴照明光通过位于给定的照明光入射面内部的照明光入射位置进入到显微物镜里面；其中 所述照明方法配有这样的重复地、自动地、平行地以时间间隔相对于光学物镜轴调整的照明轴，使得自动调整照明轴相对于物镜轴的侧向偏移，由此使照明光入射位置以使所述物镜免受照明光损伤的时间间隔在给定的照明光入射面内部调整。
12.如权利要求11所述的照明方法，其特征在于相对于物镜轴平行地调整照明轴，并且在自动调整照明轴相对于物镜轴的侧向偏移时保持这种平行性。
13.如权利要求11所述的照明方法，其特征在于由至少两个附属于不同的照明模式的不同照明光入射面中选择给定的照明光入射面。
14.如权利要求13所述的照明方法，其特征在于，所述不同的照明模式是落射荧光照明和TIRF照明。
15.如权利要求10-13中任一项所述的照明方法，其特征在于在给定的照明光入射面内部随机地选择照明光的各照明光入射位置，并且在各时间间隔上保持这些照明光入射位置，直到在给定的照明光入射位置内部随机地选择下一照明光入射位置。
16.如权利要求10-13中任一项所述的照明方法，其特征在于在给定的照明光入射面内部按照给定模式选择照明光的各照明光入射位置，并且在各时间间隔上保持这些照明光入射位置，直到在给定的照明光入射位置内部按照给定的模式选择下一照明光入射位置。
17.如权利要求10-13中任一项所述的照明方法，其特征在于对于各照明光入射位置测量物镜的光学透射，并且对应于各照明光入射位置的光学透射在时间上的变化调整时间间隔。·
【文档编号】G01N21/64GK103597396SQ201280029234
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月11日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】J·弗凌 申请人:徕卡显微系统复合显微镜有限公司