粒子的光学检测及分析的制作方法

粒子的光学检测及分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种分析包括次微米粒子的样本的方法，该方法包括：通过纳米粒子跟踪分析在该样本中确定关于粒子大小及粒子数量的第一信息；通过动态光散射在该样本中确定关于粒子的平均粒子大小的第二信息；从该第一信息中确定代表所检测粒子对于可通过动态光散射获得的结果的理论影响的第三信息；并且使用该第三信息调整该第二信息以产生代表关于平均粒子大小的所调整信息的第四信息。
【专利说明】粒子的光学检测及分析
【技术领域】
[0001]本发明涉及粒子的光学检测及分析，具体涉及包括纳米粒子的次微米粒子，即通常主要尺寸小于100 μ m (通常小于50 μ m)的粒子。
【背景技术】
[0002]纳米粒子分析是工业领域的广泛范围内普遍存在的要求。产品性能及稳定性经常取决于将粒子悬浮物制造成不存在污染物或聚合物的精细公差。此类分析中最重要的是粒子大小及大小分布测量，对于此许多技术已颇具规模并且已在常规质量控制以及研发环境中普遍使用。取决于产品的性质以及所寻求的粒子特征，采用了一系列分析方法中的一个或多个，其中包括电子显微镜、动态光散射(DLS)、夫琅和费(Fraunhofer)散射、单粒子检测技术、光学显微镜等。然而，对于纳米级的粒子，只经常使用这些示例中的前两个。虽然广泛使用，两者都有缺点，包括资本和运行成本、分析周转时间、以及在动态光散射的情况下分解粒子大小分布曲线的有限能力。
[0003]动态光散射(DLS)
[0004]如光子关联光谱学(PCS)的动态光散射技术分析数千粒子的一个大总体，其中仅获得了 z平均粒子直径(即，强度加权的粒子平均直径)以及指示粒子大小分布宽度的多分散性系数(Pecora，R.，(Ed) (1985)动态光散射，光子关联光谱学应用，施普林格出版社(Plenum Press)，美国纽约)。该技术通常实践于包括液体中纳米粒子悬浮物的样本中，该液体由适当聚焦的约100微米直径的相干、单色激光束照明，从其中散射出的光由光子计数光电倍增器检测。借助针孔及缝隙的组合或单模光纤，该检测器被配置成用于观察从该样本散射到远场中的光的一个单一相干区或点。该相干区内的光强通过干扰作用波动，原因是纳米粒子的随机布朗运动及强度波动的特征时标由数字相关器分析。强度波动的平均变化率可以用粒子扩散系数(Dt)表示，从其中可以估算激光束的路径中球体等效水动力粒子直径。可以此种方式确定小至2-3nm的粒子最大尺寸(例如，直径)。然而，由于所有粒子在DLS中是同时测量的，情况通常是较小数量的高度散射的较大粒子(例如，污染物或聚合物)可以支配信号并且有效地掩盖可能存在的大多数较小粒子的存在。在一些有限的环境中，可以通过各种去卷积算法的应用来从所获得的结果中提取粒子大小分布结构(例如，双峰分布)，但是此种方法仅在两个总体本身不过于多分散或粒子大小上不过于紧凑时才可靠。事实上，直径差别小于3的比率的粒子不能正常分解。这表示应用中的严重限制，其中要求关于粒子大小分布的精确信息，但是这些样本包含较大的粒子(例如，污染物或聚合物)，这些粒子使结果显著偏移并且可以部分地或完全地掩饰较小粒子的存在。同样地，包含广泛范围粒子大小的固有复杂的多分散的及异质的样本产生经常严重歪曲成存在的较大粒子的分布。最后，作为总体技术，没有关于任何特定粒子大小或大小等级的数量的直接信息可以从DLS中恢复。
[0005]纳米粒子跟踪分析(NTA)
[0006]纳米粒子跟踪分析是一种最近研发出的用于液体中纳米粒子的直接和实时可视化及分析的方法。参见例如W003/093801。基于激光照明的显微镜技术，纳米粒子的布朗运动由一个电荷耦合器件(CCD)照相机实时分析，每个粒子被一个专用粒子跟踪图像分析程序同时地但单独地进行可视化以及跟踪。由于每个粒子被单独地可视化和分析，得到的粒子大小及粒子大小分布的估算不受到强度加权的、Z-平均分布的限制，这是大小制度中粒子筛选常规总体方法的基准，例如如上描述的动态光散射(DLS)。NTA同时测量粒子大小及粒子散射强度的能力允许异质粒子混合物能够被分解，并且重要地是粒子浓度能够被直接估算，NTA获得的粒子大小分布曲线为直接数字/频率分布。
[0007]NTA已成为行内术语，被相关领域技术人员认可。有超过250篇提及使用NTA收集的数据的科学论文及演示文稿。此外，该术语还被例如ASTM国际组织(以前的美国材料试验协会)、环境保护局(EPA)、食品及药物管理局(FDA)及NIH使用。
[0008]NTA能够分析的粒子大小范围取决于粒子类型。考虑到每个粒子必须散射足够的光以使其能够如上面所描述的被检测及跟踪，较低的粒子大小限制由粒子大小及粒子折射率定义。对于具有非常高折射率的粒子(如胶体金)，粒子大小的精确确定可以实现在最大尺寸低至约IOnm的粒子上。对于较低折射率粒子(如生物起源地的那些)，最小可检测粒子大小可以在25-50nm的范围内。相应地，NTA受到其检测低于一个特定粒子大小的粒子的能力的限制。
[0009]对于NTA，粒子的存在及分析中的每一项都散射出足够单独检测到的光，即使面对包括例如非常小的粒子总体(如蛋白质分子、低于IOnm的无机物质、高分子溶液、纳米乳剂等)的‘背景’物质也仍然可以执行，每个粒子都小到无法单独检测却以足够高的浓度存在以集体形成一种散射光的背景薄雾。NTA无法分析此背景但是NTA可以分析在此背景中作为嵌入其中的离散光散射实体的可见粒子。当然，此背景的强度将确定就最小可检测粒子大小而言NTA的敏感性限制。此外，NTA能够识别、跟踪及分析适当粒子大小的粒子，即使是在它们存在于包含大批较大粒子的异质样本中时。
[0010]通过使用合适的荧光激发光源及适当的荧光滤波器，NTA能够进一步在非荧光背景存在时检测及分析荧光或贴上荧光标签的纳米粒子。NTA能够使用多个滤波器或一个彩色照相机进一步在一个样本内测量多于一个突光波长。
[0011]因此，DLS可以满足低至2-3nm粒子大小的纳米粒子大小的分析要求，但是严重遭受加权至样本中较大粒子(如污染物或聚合物)的强度之苦，并且不能提供关于粒子数量的信息，然而NTA可以检测、分析和计算粒子大小例如说低至10-50nm的单独粒子但不能检测及分析低于此粒子大小限制的粒子，这些粒子存在时表现为背景薄雾。此处NTA-可检测粒子被称为相对较大粒子或污染物粒子，并且NTA无法检测的较小粒子此处被称为相对较小粒子、薄雾或背景。
[0012]发明概沭
[0013]根据本发明，提供了一种分析包括次微米粒子的样本的方法，该方法包括:通过纳米粒子跟踪分析在该样本中确定关于粒子大小及粒子数量的第一信息；通过动态光散射在该样本中确定关于粒子的平均粒子大小的第二信息；从该第一信息中确定代表所检测粒子对于可通过动态光散射获得的结果的理论影响的第三信息；并且使用该第三信息调整该第二信息以产生代表关于平均粒子大小的所调整信息的第四信息。
[0014]本发明基于的是以下发现:通过NTA分析获得的关于粒子大小、相对光散射强度及非光学可分解纳米粒子物质(薄雾)(第一信息)的背景中存在的单独可检测的相对大粒子(污染物粒子)的数量的信息可被用来修改和改善此类样本的DLS分析所获得的结果(第二信息)。已经示出可以使用此数据来进行建模并且因此估算此类相对较大粒子将对此样本的DLS测量作出的贡献(第三信息)，去除此类粒子对于DLS分析的影响并且因此获得‘污染物校正的’ DLS结果(第四信息)。以此种方式，可以获得关于相对较小粒子的迄今为止更加准确的信息。
[0015]本发明因此可以获取相对较小粒子的DLS分析的好处，而相对较大粒子的存在不会如迄今为止那样不利地影响此类相对较小粒子的分析精确度。
[0016]本发明因此适用于包括以下内容的样本，即包括具有不同粒子大小尤其是多种不同粒子大小的粒子，以及特别是包括具有小于约10-50nm的最大尺寸的相对较小粒子以及作为污染物的相对较大粒子二者。
[0017]该第一及第二信息优选地从相同样本中同时获得。然而，对于测量体积中包含如此足够高数量粒子的样本，以致使得相邻区域包含类似粒子大小分布的统计学上类似数量的粒子，可以从该样本的不同区域中获得该第一及第二信息的测量，而不会导致精确度受到显著地不利影响。在该样本不随时间显著变化的情况下，该第一及第二信息不需要同时获得，虽然在比如说粒子粒子大小随时间变化的情况下(例如通过聚合、沉淀、分解、散布等)这是不恰当的。
[0018]该样本将通常但不一定包括一种液体，该液体包括其他粒子的一种悬浮物或散布。这些粒子可以是固体或可想到地可以是液体(如乳剂中的细微滴液)。液体样本将通常但不一定是水状液体。
[0019]方便的样本容量通常为500 μ I或250 μ I，同时该样本方便地包含在适当的样本室中。
[0020]该样本由适当聚焦的发光束通常是激光束照明。
[0021]可以以总体上常规的方式执行ΝΤΑ，如W003/093801中所描述的。
[0022]NTA获得的第一信息可取地包括关于粒子亮度/光谱特征、以及粒子大小及粒子数量的信息。
[0023]可以以总体上常规的方式执行DLS，如上面描述的。
[0024]DLS获得的第二信息包括关于Z-平均粒子直径形式的平均粒子大小的信息，并且可选地还包括关于粒子大小分布的信息。
[0025]通常使用对应的检测器系统执行NTA和DLS，这些系统可能是常规构造并且各自包括一个适当的光检测器(通常是(XD)。然而，可以将单个C⑶照相机用于NTA及DLS测量两者，条件是该照相机具有用于DLS的适当效率及响应速度。按照惯例，DLS可以使用光子探测器/倍增器，如雪崩光电二极管(APD)。
[0026]第一信息优选地用来生成针对所检测粒子大小中的一个或多个的理论相关曲线或函数(g2(T))。这些相关函数优选地是按照粒子大小加权的，较大的粒子给予较大的权重。然后可以对这些针对不同粒子大小的优选地按照粒子大小加权的相关函数进行求和。
[0027]可取的是，第一信息包括关于由每个所检测粒子散射的相对光量的信息，例如通过对由每个粒子散射的光点进行成像的CCD照相机像素中的灰阶值进行求和。此信息可以用来直接估算每个NTA-检测的粒子对DLS检测到的总信号所做出的贡献的程度，以生成第— {η 息 O
[0028]这些相对较小的粒子通常包括蛋白质，同时该样本还包含较大粒子，如污染物、蛋白质聚合物等。
[0029]这些相对较大(ΝΤΑ-可检测)的粒子本质上可以是生物的，如DNA的大分子或如病毒的超分子构造。这些相对较大粒子可以可替代地包括工程化的纳米粒子。
[0030]在一个实施例中，该样本包括细胞胞质(组成相对较小的、PCS可测量的背景粒子)以及相对较大粒子(如工程化的纳米粒子)。
[0031]这些粒子(特别是相对较大的粒子)可以是荧光的或可以用一个或多个荧光基团贴上标签，可以使用多个具有可以在光谱上及空间上区分的不同荧光特征的不同荧光基团。
[0032]关于较大粒子的NTA数据可以用来允许PCS-可测量的物质的相对量或浓度上的改变得以监控。
[0033]该样本可以是使得较大NTA-可检测粒子通过背景物质的聚合或沉淀而显现并且变大并且因此可以被检测和枚举。
[0034]该样本可以是使得较大NTA-可检测粒子可以通过分解、散布或溶解而渐进地消失并且变小，以便成为PCS可测量的背景物质并且因此在贯穿该过程的阶段中可以被检测和枚举。
[0035]PCS可检测试剂(如蛋白质)的两个总体可以相互作用或起化学反应以形成NTA可检测的结构(如粒子大小上的改变或光学上可检测的参数(如荧光)的增强或发展)。
[0036]可以通过原动力的应用(电性、磁性、重力等)操控NTA可检测粒子，尤其以便在存在较小背景粒子时进行移动。因此，例如，可以在用户应用的电场中经历电泳或在用户应用的磁场中经历磁导入时通过NTA对这些粒子进行分析。
[0037]这些NTA可检测粒子可以是能动的。
[0038]可以使这些背景粒子移动，其中该移动可由激光多普勒速度计在DLS的变体中进行分析。
[0039]可以测量这些背景粒子与这些较大污染物粒子之间的移动差异。
[0040]例如由于胶凝作用或溶解、或由于化学充电(如pH)导致的流变学性质上的PCS可测量背景变化可导致这些较大的NTA可检测粒子的性态上的修改。通过监控NTA可检测粒子中的这些变化，可以监控背景粒子中的变化。
[0041]这些NTA粒子修改这些PCS可检测背景粒子的性态和性质。
[0042]NTA-导出的第一信息可以被实时地用来修改DLS/PCS第二数据(或者时间上或者空间上)的捕获。
[0043]在一个第二方面，本发明提供了一种用于执行第一方面的方法的装置，该装置包括:
[0044]—个光源装置，用于产生一个适当聚焦的发光束以对样本进行照明；
[0045]一个第一检测器系统，用于使用NTA获得关于这些粒子的第一信息；
[0046]—个第二检测器系统，用于使用动态光散射获得关于这些粒子的第二信息；以及
[0047]数据处理装置，被编程成用来从该第一信息中确定该第三信息。
[0048]在优选实施例中，该数据处理装置将被进一步编程成用来使用该第三信息调整该第二信息，以便生成代表关于该样本中粒子的平均粒子大小的调整信息的第四信息。
[0049]可以设想本发明的装置的若干不同实施例，并且这些实施例包括以下类别:
[0050](a)空间上相同并且时间上相同(即，该第一及第二检测器系统用来在同一时间询问所照明样本的大体上相同的部分)；
[0051](b)空间上相同但时间上不同(即，该第一及第二检测器系统用来在大体上不同的时间(例如循序地)询问所照明样本的大体上相同的部分)；以及
[0052](c)空间上不同但时间上相同(即，该第一及第二检测器系统用来在大体上同一时间询问所照明样本的不同部分)。
[0053]还有一种第四类别(d)，其中该第一及第二检测器系统时间及空间上都不同，但是此类别相比于优选的类别(a)-(c)并未提供明显优势。
[0054]类别(a)装置中至少有两种子类别:
[0055](e)两个检测器系统相对于彼此成角，以便允许它们即使是从不同的角度询问所照明样本的相同部分一(只要该角度已为第二检测器系统所知，这并不是难题)；或者
[0056](f)来自该样本的光路被分离，其中一部分传送到用于NTA的CCD等，另一部分传送到用于DLS的AH)等。本实施例中暗示了用于两个检测器系统的光路至少最初是相同的。例如，该光路可由一个位于普通显微镜物镜下游的分束器分离。该分离在这两个检测器系统之间可以为50: 50，但这不是必须的。
[0057]结果就是，至少在本发明的一些实施例中，有利的是可能有一个或多个组件，包括但不限于透镜及分束器，其对于该第一及第二检测器系统是相同的。
[0058]上面参照的类别(b)下的本发明的装置将涉及在不同时间询问大致上该样本相同部分的该第一及第二检测器系统。如果该样本的特征在询问该第一检测器系统与询问该第二检测系统之间并未以显著的方式改变，那么这是可以接受的。通常，该样本流动或进入到样本室中将在计算机化发动机的控制下，所以此要求可以得到满足。
[0059]类别(c)下的装置的潜在缺点是，该第一及第二检测器系统询问的是所照明样本的不同部分一可靠的是，不仅该样本必须是大致上同质的，而且该照明在被对应的检测器系统询问的样本中的两个位置处必须大致上完全相同，并且这可能更难以安排，尤其是如果这两个位置不是很接近。
[0060]为了避免疑虑，特此明确地规定，本文中所描述的如“优选的”、“期望的”、“有利的”、“方便的”等特征可以孤立地出现在本发明中，或与如此描述的任何一个或多个其他此类特征任意组合，除非内容另外规定。此外，关于本发明的一方面的如“优选的”、“期望的”、“有利的”、“方便的”等描述的特征将被理解为同样地适用于本发明的其他方面，除非内容另外规定。
[0061]将通过图解的方式并且参照附图对本发明在下面非限制性示例中进行进一步描述，其中:
[0062]图1至图3是适合用于执行本发明的方法的装置的不同实施例的示意图；
[0063]图4是针对模拟粒子样本的粒子直径(nm)的信号强度(任意单位)的图表，并且图5是示出了示例2中所描述的不同相关函数的图表。
[0064]参照图1，该图示出了用于执行NTA的装置(通常由参考号2表示)，以及用于执行DLS的装置(通常由参考号4表示)，该NTA装置2及DLS装置4被安排成用来分析时间或空间上(但不是两者皆是)一致的样本。该NTA装置2包括一个C⑶或EMCXD照相机
6、透镜8、以及一个显微镜物镜10，被安排成用来分析由激光束12所照明的样本的体积。
[0065]该DLS装置4包括一个光子计数检测器14、一个光纤16、以及一个显微镜头18，被安排成用来分析由该激光束12所照明的一个样本体积或区域，或盘是在与NTA装置2分析该样本的玉厘体积或区域的同时，或盍是分析由该NTA装置在不同时间分析的样本的相同体积或区域。
[0066]参照图2，该图示意性地展示了用于执行本发明方法的装置的一个第二实施例。功能相若的组件由图1中所使用的相同参考号指示。所展示的实施例是一种空间及时间上相同的安排，其中该NTA装置2及DLS装置4用来在同一时间但在不同的角度(该NTA装置是与该激光束成直角的，该DLS装置在Θ角度，20)分析相同的样本体积或区域。
[0067]图3示意性地展示了用于执行本发明方法的装置的一个第三实施例。再者，功能相若的组件由图1及图2中所使用的相同参考号指示。所展示的实施例是一种空间及时间上相同的安排，其中该NTA装置2及该DLS装置4用来在同一时间并且在相同的角度(与图2中示出的安排对比)分析相同的样本体积或区域，这是通过分束器或分色镜22的方式实现的。
[0068]示例
[0069]示例 I [0070]在典型实施例中，如蛋白质物质的样本(组成相对较小的DLS-可检测粒子)包含DLS不可检测的统计学上显著数量的较大粒子(如污染物或聚合物)，该样本被引入到穿过样本室的激光束的路径中。
[0071]DLS测量一从照明激光束的所选区域(测量体积)中存在的粒子中以某个角度散射的光如上面所描述的由适当配置的检测器检测并且由常规DLS方法分析。结果展示为Z-平均(强度加权的)总体平均数。在相关函数由适当去卷积算法(如傅里叶变换)分析的情况下，还可以生成一个粒子大小分布曲线。这些结果分别或者是一个强度加权的总体平均数或者是一个粒子大小分布曲线，该粒子大小分布曲线同样强度加权到该样本中较大的(如污染物)粒子并且凭借粒子大小分布分析的劣性适应性质限制分辨率。这些结果组成第二信息。
[0072]NTA测量-使用一个包括显微镜物镜及C⑶照相机的第二检测器系统，从相同测量体积散射的光被NTA优选地同时地进行分析。这些结果展示为这些粒予大小的直接数字频率粒予大小分布曲线，这些粒予大小大到足够通过其布朗行动的分析而被单独识别并且按大小分类。这些结果组成第一信息。然而，NTA将不能报告任何单分子纳米粒子的存在、粒子大小或数量，它们无法被分解为离散光散射中心，如不凝聚的/污染的蛋白质背景。
[0073]融合两个数据集一该第一及第二信息限制现在可以以下方式组合:
[0074]对于NTA检测及按大小分类的每个单独粒子，知道了获得粒子大小的温度T及在此温度下分析粒子的溶剂的粘度Π I的情况下，在DLS分析下，可以生成一个应该来自每个粒子半径rh的理论二阶自相关曲线g2 ( τ )。
[0075]对于粒子大小的一个单一值(如单一的扩散系数Dt)，产生的自相关函数描述了一个指数。
[0076]g2 ( τ ) =Ae^2rt[0077]其中
[0078]gamma =qDt
[0079]假设，
【权利要求】
1.一种分析包括次微米粒子的样本的方法，该方法包括:通过纳米粒子跟踪分析在该样本中确定关于粒子大小及粒子数量的第一信息；通过动态光散射在该样本中确定关于粒子的平均粒子大小的第二信息；从该第一信息中确定代表所检测粒子对于可通过动态光散射获得的结果的理论影响的第三信息；并且使用该第三信息调整该第二信息以产生代表关于平均粒子大小的所调整信息的第四信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该第一及第二信息从同一样本中同时获得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该样本包括液体中固态粒子的一种悬浮物或其他散布。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中该样本由适当聚焦的发光束照明，通常是激光束。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一信息进一步包括关于粒子亮度/光谱特征的信息。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第二信息还进一步包括关于粒子大小分布的信息。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一信息及该第二信息是使用对应的检测器系统获得的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一信息用来对所检测的粒子大小中的一个或多个生成理论相关曲线或函数。
9.根据权利要求8所述的方法，其中这些相关函数是粒子大小加权的，较大的粒子给予较大的权重。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中对不同粒子大小的相关函数进行求和。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一信息包括关于由每个所检测粒子散射的相对光量的信息。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该样本包括蛋白质。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该样本包括多个荧光粒子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该第一和/或第二信息是在这些粒子承受一个用户施加的外部电场和/或磁场时获得的。
15.一种适配及配置成用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的装置，该装置包括: 一个光源装置，用于产生一个适当聚焦的发光束以对该样本进行照明； 一个第一检测器系统，用于使用NTA获得该第一信息； 一个第二检测器系统，用于使用动态光散射获得该第二信息；以及 数据处理装置，被编程成用来从该第一信息中确定该第三信息。
16.根据权利要求15所述的装置，其中该数据处理装置被进一步编程成用来使用该第二息调整该第二息，以便生成第四息。
17.根据权利要求15或16所述的装置，其中该第一及第二检测器系统空间上相同并且时间上相同。
18.根据权利要求15或16所述的装置，其中该第一及第二检测器系统空间上相同但时间上不同。
19.根据权利要求15或16所述的装置，其中该第一及第二检测器系统空间上不同但时间上相同。
20.根据权利要求15-18中任一项所述的装置，其中该第一及第二检测器系统共同具有一个或多个组件。
21.根据权利要求1-14中任一项所述的方法大致上如前面所描述的。
22.根据权利要 求15-20中任一项所述的装置大致上如前面所描述的。
【文档编号】G01N15/14GK103890561SQ201280038391
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年8月6日 优先权日:2011年8月5日
【发明者】R.J.G.卡尔, J.P.霍尔, J.B.K.史密斯 申请人:纳米观测有限公司