抗b7-h6多肽的b7-h6治疗性活性单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及诊断方法和手段。具体地，本发明涉及抗体，所述抗体特异性结合至B7-H6多肽的胞外域的一部分。本发明还提供所述抗体用于治疗或诊断癌症或炎性疾病。本发明还提供用于在疑似患有癌症或炎性疾病的受试者的样品中诊断癌症的方法。此外，本发明涉及用于诊断癌症或炎性疾病的装置和试剂盒。
【专利说明】抗B7-H6多肽的B7-H6治疗性活性单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及诊断方法和手段。具体地，本发明涉及抗体，所述抗体特异性结合至B7-H6多肽的胞外域的一部分。此外，提供了所述抗体用于癌症或炎性疾病的治疗或诊断。此外，提供了用于在疑似患有癌症或炎性疾病的受试者的样品中诊断癌症的方法。此外，本发明涉及用于诊断癌症或炎症的装置和试剂盒。
【背景技术】
[0002]迄今，尽管在降低发病率和死亡率以及提高存活率上已经取得了进展(见Jemal等.2010，CA Cancer J Clin.S印_0ct60 (5): 277-300)，在美国，癌症仍然是导致死亡的首要原因之一。由于癌症的发展通常与缺失免疫系统对肿瘤细胞的特异性识别相关，通过改进诊断方法和手段可以加快进一步进展。
[0003]靶向癌症治疗包括干扰特定靶分子(例如，单克隆或多克隆抗体)以直接阻断癌细胞生长的药物。因此，靶向癌症治疗可以比传统的治疗方法(例如，切除术、射线疗法、化学疗法)更有效，并且可以对正常细胞伤害更小。可以设计单克隆抗体(mAb)，以特异性结合至靶细胞的胞外域或细胞表面靶标，从而刺激患者的免疫系统。也可以针对很多严重疾病(例如，炎性疾病或不同种类的癌症)创造单克隆抗体。因此，单克隆抗体可以提供可靠和有效的治疗和诊断方法和手段，以例如检测这些疾病的早期发展阶段或提供治疗方法。
[0004]自然杀伤细胞(NK细胞)构成先天免疫系统的主要成分，其形成炎性和适应性免疫反应(见Vivier等，2008, Nat.1mmun0.9:503-510)，并在排斥转移的和受病毒感染的细胞中起关键作用(见 Smyth 等 ，2002, Nat.Rev.Cancer2:850-861; Lanier2005, Annu.Rev.1mmunol.23:225-274)。NK细胞检查靶细胞中I型主要组织相容性复合体(MHC)的表达(见Parham2005, Nat.Rev.Tmmunol.5:201-204), I型主要组织相容性复合体保护祀细胞免受NK细胞激活和免受NK细胞攻击。缺乏I型MHC的靶细胞由于凋亡(程序性细胞死亡)的诱导而直接被NK细胞杀死。NK激活受体(例如，天然细胞毒性受体(NCR)家族，如NKp30)的发现揭示了，NK细胞的激活和肿瘤细胞裂解也需要激活信号(见Pende等，1999，CancerRes.62:6178-6186; Moretta 等，2001, Annu.Rev.Tmmunol.19:197-223)。
[0005]最近，可能证实，人NKp30与B7家族成员B7-H6直接相互作用，其中B7-H6在肿瘤细胞上的表达诱导NKp30依赖的细胞激活和细胞毒性(见Brandt等，2009，J.Exp.Med.206
(7):1495-1503;US2011/0081346)。由此，NKp30的胞外域与仅在几个肿瘤细胞系的表面上表达的 B7-H6 的胞外域直接相互作用(见 Brandt 等，2009，J.Exp.Med.206 (7): 1495-1503)。
发明概要
[0006]本发明涉及抗体，所述抗体特异性结合至由B7-H6多肽胞外域的一部分形成的表位，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的氨基酸序列。优选地，所述序列为IgV样结构域。
[0007]在本发明抗体的一个优选实施方案中，所述抗体包含SEQ ID N0s:5、7、9、15、17和19 中所示的互补决定区(CDRs)。根据 MGT-0NT0L0GY(见 Giudicelli 和 Lefrancl999, Bioinformaticsl5:1047-1054),对上述Q)Rs的核酸序列进行了注释。
[0008]在本发明抗体的一个优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。更优选地，所述抗体是根据布达佩斯条约、于2011年2月2日以保藏号DSMACC3117保藏在DSMZ(德国，Braunschweig)的抗体。
[0009]本发明涉及本发明抗体用于癌症的治疗或诊断。优选地，所述癌症是T细胞淋巴癌、髓性白血病、结肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。
[0010]此外，本发明涉及本发明的抗体用于炎性疾病的治疗或诊断。优选地，所述炎性疾病是病毒感染。
[0011]本发明涉及用于在疑似患有癌症的受试者的样品中诊断癌症的方法，包括:
[0012]a)在允许本发明抗体与其在B7-H6多肽上的表位结合的条件下，将样品与本发明抗体接触；和
[0013]b)测定抗体与所述表位的结合，由此诊断抗体。
[0014]在本发明方法的一个优选实施方案中，癌症是T细胞淋巴癌、髓性白血病、结肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。
[0015]本发明还涉及用于在疑似患有炎性疾病的受试者的样品中诊断炎性疾病的方法，其包括:
[0016]a)在允许本发明抗体与其在B7-H6多肽上的表位结合的条件下，将样品与本发明抗体接触；和
[0017]b)确定抗体与所述表位的结合，由此诊断炎性疾病。
[0018]在本发明方法的一个优选实施方案中，所述样品是组织或体液样品。
[0019]本发明还包括用于在样品中诊断癌症或炎性疾病的装置，其包括:
[0020]a)包含本发明抗体的分析部件；和
[0021]b)检测分析部件中的抗体与其在B7-H6多肽上的表位结合的检测器。
[0022]在本发明装置的一个优选实施方案中，所述样品是组织或体液样品。
[0023]最后，本发明涉及用于诊断癌症或炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体、以及优选地用于检测所述抗体与其在B7-H6多肽上的表位结合的试剂。
[0024]附图简述
[0025]图1显示B7-H6_Ig融合蛋白的核酸和氨基酸序列。斜体的核酸和氨基酸序列标示限制性酶切位点。人B7-H6胞外域的核酸和氨基酸序列以粗下划线标示，其中所述Fcm的序列以点下划线标示。
[0026]图2显示人B7-H6多肽胞外域的氨基酸序列，并标示出了 IgV样结构域和IgC样结构域。
[0027]图3显示，使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)，抗B7-H6克隆1.18与B7-H6反应。
[0028]图4a显示，使用荧 光激活细胞分选术(FACS)，抗B7-H6克隆1.18与转染子(BA/F3-B7-H6)上的B7-H6结合。图4b显示，抗B7-H6克隆1.18与细胞系(造血和实体肿瘤起源)上的B7-H6结合而不与健康的外周血单核细胞(PBMCs)结合。
[0029]图5显示，B7-H6的IgV结构域的一部分参与抗B7-H6克隆1.18的结合。
[0030]图6显示，不同细胞系中由荧光激活细胞分选(FACS)测定的B7-H6的细胞表面表达以及mRNA表达。图6a显示造血起源的肿瘤细胞系中B7-H6的表达。图6b显示实体瘤起源的肿瘤细胞系中B7-H6的表达。
[0031]图7显示，在BA/F-3-B7-H6转染子的细胞离心涂片(cytospins)(冷冻切片)上抗 B7-H6mAbl.18 检测 B7-H6。
[0032]图8显示，原代自然杀伤(NK)细胞在与BA/F3-B7-H6转染子共培养后脱粒。
[0033]发明详述
[0034]本发明涉及抗体，所述抗体特异性结合至由B7-H6多肽胞外域的一部分形成的表位，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的氨基酸序列。优选地，所述序列为IgV样结构域。
[0035]术语“抗体”指，特异性结合至包含在B7-H6多肽胞外域的一部分中的表位上的所有类型的抗体。优选地，本文所提及的表位由长7至15个，优选8至11个连续氨基酸的区段定义。然而，依据本发明的表位也可以由某种三维结构形成，这样的结构性表位也包括在本文中。在上下文中，“特异性结合”指，本发明的抗体基本上结合至表位而与B7-H6多肽或其它多肽上的其它表位无显著的交叉反应性(即，结合)。可以通过本领域熟知的技术确定特异性结合。优选地，抗体特异性结合至所述表位。上述表位应位于B7-H6多肽胞外域的一部分中。优选地，B7-H6多肽具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，所述胞外域对应于所述序列的第58至300位氨基酸(也见图1和2)。应理解的是，B7-H6多肽也可以是SEQ ID NO: 2的变体序列，该变体序列由于取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸而不同。这样的变体序列可以是来自其它物种的直系同源氨基酸序列以及上述特定B7-H6的旁系同源序列或其它同源序列。优选地，变体序列与SEQ ID NO: 2在SEQ ID NO: 2的全长或至少50%上具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。本文中使用的术语“序列同一性”指，两个或更多个多肽序列(即参考序列和待与参考序列进行比较的给定序列)之间的关系。可以在给定序列和参考序列进行最优比对以广生最闻程度的序列相似性后，通过比较给定序列和参考序列，确定序列同一性，其中最高程度的序列相似性可以通过这些序列的区段之间的匹 配来确定。所述比对可以由本领域技术人员无需过度劳动而完成。由此，序列同一性提供了与所述匹配的总数有关的信息。优选地，可以使用可公开获取的计算机程序，计算序列同一性，所述计算机程序为技术人员所知，例如BLAST和FASTA。本发明考虑的其它序列变体是由如下核酸分子编码的序列，所述核酸分子能够在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1中所示的编码B7-H6的核酸序列杂交。优选地，B7-H6多肽由SEQID NO:1中所示的核酸序列编码。依据本发明，严格杂交条件相当于:在7%十二烷基硫酸钠(SDS), 0.5M NaP04, ImM EDTA 中于 50°C杂交，在 IX SSC, 0.1%SDS 中于 50°C或 65°C洗涤，其中使用包含SEQ ID NO:1或其反向互补序列的至少100，更优选至少150，甚至更优选至少200，最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子探针。应理解的是，在这些序列变体中，胞外域的第一个和最后一个氨基酸可以不同于以上针对SEQ ID N0:2指示的位置。然而，胞外域将开始和结束于与所述位置对应的位置。技术人员可以使用序列分析工具容易地确定这样的对应位置。
[0036]优选地,本发明所述的抗体包括单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体或这些抗体的具有上述结合特性的任何片段或衍生物。本文中使用的术语“抗体”所涵盖的片段和衍生物包括合成抗体、Fab、F (ab) 2Fv或scFv片段，或这些抗体之任一的化学修饰衍生物。本发明考虑的化学修饰优选包括旨在将抗体偶联到可检测标记(见本说明书其它地方所详述)的修饰。通常，可以通过使用例如Harlow和Lane《抗体，实验室手册》("Antibodies, ALaboratoryManual")，CSH出版社，Cold Spring Harbor, 1988中描述的方法,获得抗体或其片段。
[0037]有利地，本发明的抗体以高亲和力特异性结合至B7-H6。在支持本发明的研究中发现，与现有技术中描述或提出的其它抗B7-H6抗体(Brandt2009，J.Exp.Med.206(7):1495-1503和US2011/0081346)相比较，本发明的抗体尤其适用于体内应用诸如FACS分选和细胞培养、以及体外应用(包括免疫组织化学(在例如冷冻组织切片上))。由于本发明，基于确定B7-H6的癌症诊断将得到改进。此外，旨在将抗肿瘤药物靶向B7-H6阳性细胞的治疗方法变得可行。
[0038]在本发明抗体的一个优选实施方案中，所述抗体包含SEQ ID N0s:5、7、9、15、17和19 中所示的互补决定区(CDRs)。根据 MGT-0NT0L0GY(见 Giudicelli 和 Lefrancl999, Bioinformaticsl5:1047-1054),对上述Q)Rs的核酸序列进行了注释。
[0039]本文中使用的术语“互补决定区”或“CDR”指抗体中负责抗原结合的特异性的可变区。通常，抗体包含3个⑶Rs (⑶R1，⑶R2和⑶R3)。这些⑶Rs以非连续的方式排列。由于抗体的抗原识别部分通常由重链和轻链上的两个可变区组成，在结合时6个CDRs与抗原接触。可以通过诸如 CDR 移植(见 Ewert2004，Methods34 (2):184-199;Benny K.C.Lo inAntibody Engineering - Methods in Molecular Biology2004, Volume248, II, 135-159, DO110.1385/1-59259-666-5:135)等常规分子生物学技术，将CDRs从一种抗体转移到另一种抗体上。
[0040]从上文应理解的是，在另一个优选实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。
[0041]优选地，可以通过给动物(优选小鼠)施用具有如上表征的胞外域部分的免疫原性多肽，制备这样的单克隆抗体。更优选地，将免疫原性多肽与载体蛋白，诸如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)缀合。取决于宿主种类，可以使用各种佐剂来增强免疫应答。佐剂优选包括弗氏佐剂(Freund’s adjuvant),矿物凝胶,例如氢氧化招，以及表面活性剂物质,例如溶血卵磷脂,多聚醇(pluronic polyols),聚阴离子,肽,油乳,钥孔虫戚血蓝蛋白和二硝基酚。随后，可以使用熟知的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术，制备依据本发明的单克`隆抗体。关于制备本发明抗体的更多详情描述于以下的实施例。
[0042]在本发明抗体的一个更优选实施方案中，所述抗体是由“德国癌症研究中心(Deutsches Krebsforschungszentrum) ”(德国，Heidelberg)、根据布达佩斯条约、于2011年2月2日以保藏号DSM ACC3117保藏在“DSMZ-德意志微生物和培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，，(德国，Braunschweig, 38124)的抗体、或是由相应的杂交瘤细胞克隆产生的抗体。
[0043]上述抗B7-H6mAb应包含至少一条重链和至少一条轻链。优选地，抗B7_H6mAb具有SEQ ID NO:3中所示的重链(IGHV/IGHD/IGHJ)氨基酸序列，其中分泌形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1)示于SEQ ID NO: 11，膜结合形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1)示于SEQ ID NO: 12。重链的构架1-4的核酸序列示于SEQ ID NO: 4, 6，8和10中，重链的⑶Rsl_3的核酸序列示于SEQ ID NO:5, 7和9中。此外，所述抗体具有SEQ ID NO: 13中所示的轻链(IGLV/IGLJ)氨基酸序列，其中IGLV/IGLJ/IGLC的序列示于SEQ ID NO:21中。轻链的构架1_4的核酸序列示于SEQ ID NO: 14, 16，18和20中，轻链的CDRsl-3的核酸序列示于SEQ ID NO: 15, 17和19中。应理解的是，抗B7-H6mAb也可以由上述SEQ ID NOs:3_21的变体序列代表，所述变体序列由于取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸而不同。这样的变体序列可以是来自其它物种的直系同源氨基酸序列、以及上述特定B7-H6mAb的旁系同源序列或其它同源序列。优选地，变体序列在SEQ ID NOs:3-21的全长或其至少50%上与所述序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。说明书的其它地方已对术语“同一性”进行了定义，作必要修改后适用于此。
[0044]本发明还涉及本发明的抗体用于癌症的治疗或诊断中。
[0045]本文中所用术语“治疗”涵盖:对本文所述疾病或其症状的改善，以及治愈疾病，即在具有疾病或其症状的受试者中重建健康状况。本文中，“改善”指，相对于疾病或疾病的症状，显著改进健康状况。优选地，该显著改进在例如为了调查受试者而使用的分期或分级系统中是临床上明显的。如本领域技术人员将理解的是，本文中所使用的“治疗”通常不旨在指，在给定的治疗下对于所有(即100%)的受试者都正确。然而，该术语要求统计上显著部分的受试者(例如群组研究中的群组)可以被治疗。本领域技术人员可以使用各种熟知的统计计算工具，例如置信区间的确定、P值的确定、Student t检验、Mann-Whitney检验等，无需过度劳动而确定“部分”是否是统计上显著的。详细描述可以见于Dowdy和ffearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New Yorkl983 中。
[0046]优选地，用于治疗癌症的本发明抗体与细胞毒性剂或抗肿瘤剂偶联，或能够募集适于治疗癌症的药剂。本文中所使用的术语“药剂/剂”指，元素、化合物或其它分子实体(例如药物化合物、治疗性化合物或药理化合物)。药剂可以是天然的、合成的或其组合。本文中所使用的术语“治疗剂”指，单独或与其它药剂组合时，对细胞或组织显示出治疗效果或有益效果的药剂。优选地，依据本发明的治疗剂应包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光激活剂或色素、和放射性同位素。本领域技术人员熟知用于将治疗剂与多肽例如抗体偶联的技术(例如，Amon 等，1985，"Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy, ^((Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy〉〉(ReisfeId等编辑，Alan R.Liss，Inc.,1985))。本文中所使用的术语“细胞毒性剂”指，对细胞具有细胞毒性或细胞抑制效应的药剂，由此耗竭细胞群体中的细胞或抑制其生长。优选地，依据本发明的细胞毒性剂应包括抗微管蛋白剂(例如多拉司他汀(dolastatins)、长春花碱(vinca alkaloids)、鬼曰毒素(podophyllatoxins)、紫杉醇(taxanes)、衆果赤霉素衍生物(baccatin derivatives)、cryptophysins、美登素类化合物(maytansinoids)和考布他汀(combretastatins)), DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烧化剂(例如钼复合物)、蒽环类药物(anthracyclines)、抗生素、抗叶酸剂(antifolates)、抗代谢物(antimetabolites)、化疗增敏剂(chemotherapy sensitizers)、duocarmycins、依托泊苷(etoposides)、氟化U密P定(fluorinated pyrimidines)、离子载体(ionophores)、lexitropsins、亚硝基服(nitrosoureas)、platinols、预形成的化合物(pre-forming compounds)、嘌呤抗代谢物(purineantimetabolites)、嘌呤霉素(puromycins)、放射增敏剂(radiation sensitizers)、类固醇(steroids)、紫杉醇(taxanes)、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitors)、长春花碱(vinca alkaloids)等等。本文中所使用的术语“抗肿瘤剂”指,对癌细胞具有细胞毒性或有害效应的药剂，由此阻止肿瘤中癌细胞的生长，优选导致细胞死亡。优选地，本发明的抗体结合至靶细胞(例如癌细胞)和表达所述抗体的受体的特定效应细胞(例如，自然杀伤细胞、单核细胞、粒细胞)，从而导致靶细胞死亡。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的抗体通过接头与细胞毒性剂或抗肿瘤剂偶联。优选地，依据本发明的接头包括在细胞内条件下可切开的接头(例如，可被细胞内蛋白酶切开的肽接头、二肽接头、二硫化物接头、和在例如小于5.5的pH可水解的可水解接头)。然而，由于其对B7-H6的阻断和结合特性，本发明的抗体也可以用于治疗癌症，作为涉及癌症的信号级联的调节剂。
[0047]本文中所使用的术语“诊断”指，评估受试者是否患有本文所述的疾病。如本领域技术人员将理解的是，这样的评估通常不旨在对于所有(即100%)的待检受试者都正确。然而，该术语要求统计上显著部分的受试者可以被鉴别(例如群组研究中的群组)。本领域技术人员可以使用各种熟知的统计计算工具(本文中其它地方提及)，无需过度劳动，确定“部分”是否是统计上显著的。根据本发明的诊断包括将方法应用于监测、确认和亚分类相关疾病中。
[0048]此外，本文中，诊断的建立也包括建立对受试者的预后。预后是预测性指标，指示疾病在未来时窗(即预测窗)中的进一步发展。因此，优选地，本文中所使用的诊断包括:预测受试者在将来在疾病或疾病症状上是否将得到改善、或疾病或症状是否将恶化。因此，本发明的抗体也可以用于风险分层方法，并因此用于确定患有本文所述疾病的受试者个体所需的特别护理和住院治疗的量。
[0049]优选地，用于诊断的本发明抗体与检测剂偶联、或能够募集这样的试剂。本文中使用的“检测剂”涵盖放射性同位素(例如碘、锝的放射性同位素)、荧光或化学发光试剂(例如FITC、罗丹明)、能够通过转化底物来产生可检测信号的酶(例如辣根过氧化物酶、萤火虫萤光素酶、或β半乳糖苷酶)、荧光蛋白(例如绿色、蓝色或红色荧光蛋白)。合适的检测试剂在本领域熟知。还优选地，应用于本发明方法中的抗体可以与能够吸引检测试剂的试剂偶联。这样的试剂可以是生物素。在这种情况下，可以使用抗生物素蛋白或链霉亲和素偶联的检测试剂，其在与所结合的抗体上的生物素结合后可以用作可检测标记物。在这种情况下，合适的可检测标记物是以上提及的可检测标记物，更优选地，在这种情况下，酶用作可检测标记物。此外，可以使用第二抗体检测第一抗体，第一抗体即待在本发明方法中应用的与样品中的Β7-Η6多肽结合的抗体。第二抗体应与以上描述的可检测标记物偶联。因此，在后一情况下，第二抗体将在与第一抗体结合后产生可检测信号，并由此使得能够检测所结合的第一抗体。以第二抗体检测所结合的抗体的原理在本领域公知，并常规用于例如确定结合在组织切片上的抗体。取决于可检测标记物的类型，可以应用不同的检测方法，使用针对可检测标记物产生的信号的读取器系统。这样的系统包括自动化信号读取装置，诸如ELISA或RIA读取器，也包括用于手动或自动检测可检测信号的显微装置。此外，读取器系统可以确定样品的额外信息，例如显微系统可以光学展示组织切片的细胞，或者自动化信号读取器还可以确定样品包含的其它生物标记物。
[0050]本文中所使用的术语“癌症”指任何恶性肿瘤。恶性肿瘤指，生物中因受损细胞的不需要的生长、侵袭、和在某些条件下的转移而导致的疾病。导致癌症的细胞在遗传上受损，且通常已失去了控制细胞分裂、细胞迁移行为、分化状态和/或细胞死亡机器的能力。大多数癌症形成肿瘤,但一些造血系统癌症例如白血病不形成肿瘤。依据本发明,癌症应包括表达如本文中其它地方详述的Β7-Η6多肽的癌细胞。优选的癌症类型选自:Τ细胞淋巴癌、髓性白血病、结 肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。不同癌症的症状和分期系统在本领域公知并描述于标准病理教科书中。本文中所使用的“癌症”涵盖癌症的任何时期、等级、形态学特征、侵袭性、攻击性或恶性、或由此受染的组织或器官。
[0051 ] 本发明还涉及本发明的抗体用于治疗或诊断炎性疾病。
[0052]优选地，用于治疗炎性疾病的本发明抗体与抗炎剂偶联，或能够募集这样的药剂(如本文中其它地方所详述的)。然而，由于其对B7-H6的阻断和结合特性，本发明的抗体也可以用于炎性疾病，作为涉及炎性疾病的信号级联的调节剂。
[0053]优选地，用于诊断的本发明抗体与检测试剂结合、或如本文中其它地方所详述的，能够募集这样的试剂。
[0054]本文中所使用的术语“炎性疾病”指，响应组织损伤或破坏而出现的组织反应，涉及炎性细胞因子和炎性细胞浸润。依据本发明，炎性疾病应包括病毒感染和细菌感染。此外，还包括诸如糖尿病、多发性硬化和炎症性肠病等自身免疫性疾病。
[0055]从上可知，本发明还涉及用于在疑似患有癌症的受试者的样品中诊断癌症的方法，包括:
[0056]a)在允许本发明抗体结合至其在B7-H6多肽上的表位的条件下，将样品与本发明的抗体接触；和
[0057]b)确定抗体与所述表位的结合，由此诊断癌症。
[0058]本文中所使用的术语“诊断”指，评估受试者是否患有本文中提及的疾病。如本领域技术人员将理解的是，这样的评估通常不旨在对所有(即100%)待鉴别的受试者都正确。然而，该术语要求统计上显著部分的受试者可以被鉴别(例如群组研究中的群组)。本领域技术人员可以使用本文中其它地方提及的各种熟知的统计计算工具，容易地确定部分是否是统计上显著的。根据本发明的诊断包括:将方法应用于相关疾病的监测、确认和亚分类中。此外，本文中，诊断的建立也包括`建立对受试者的预后。预后是预测性指标，指示疾病在未来时窗(即预测窗)中的进一步发展。因此，优选地，本文中所使用的诊断包括:预测受试者在将来在疾病或疾病症状上是否将得到改善、或疾病或症状是否将恶化。因此，本发明的抗体也可以用于风险分层方法，并因此用于确定患有本文所述疾病的受试者个体所需的特别护理和住院治疗的量。
[0059]优选地，上述用于在受试者的样品中诊断癌症的方法还包括步骤:基于由该方法获得的诊断结果，向受试者建议抗癌疗法。本文中所使用的术语“建议”指，向受试者提出抗癌疗法的建议或排除(即不推荐)某种抗癌疗法。这样的建议应可选地与其它信息(例如来自组织病理学调查的信息)一同作为临床医生对受试者个体应用或不应用某种抗癌疗法的基础。基于本发明的诊断，即癌症或非癌症的诊断，作出抗癌疗法的建议。应理解的是，仅在通过本发明方法确定了癌症的诊断情况下，才应进行抗癌疗法的推荐。在基于本发明方法没有癌症被确诊的情况下，建议将是避免抗癌疗法。如上文所提出的，还可以使用来自样品来源的受试者的其它信息来完善建议。在一方面，如果本发明方法鉴别到癌细胞，但如果例如通过组织病理学分析在所调查的癌症中检测到了本发明方法没有鉴别到的其它癌细胞，则可以建议组合抗癌疗法，例如与不同的抗肿瘤药物组合。
[0060]术语“样品”指，分离的细胞样品或来自组织或器官的样品。组织或器官样品可以获自任何组织或器官，例如通过活检获得。分离的细胞可以自诸如淋巴液、血液、血浆、血清、液体等体液、或自组织或器官、通过诸如离心或细胞分选等分离技术而获得。优选地，样品是表达或产生本文中所述多肽的组织或体液样品。可以通过本领域技术人员熟知的常规技术从受试者获取样品，例如开放性活检(open biopsy),包括从受试者抽吸组织或细胞材料。对于那些通过开放性活检不容易到达的区域，可以进行外科手术，优选微创外科手术。
[0061]本文中所使用的术语“受试者”涉及动物，优选哺乳动物和更优选人。本发明的方法适用于疑似患有癌症的受试者。疑似患有癌症的受试者是在表现出临床上明显的癌症症状的受试者、或是患癌症的倾向性增加的受试者。在大规模诊断筛选试验中，疑似患有癌症的受试者甚至可以是健康的受试者，即没有显示疾病症状的受试者或没有疾病倾向性的受试者。
[0062]本文中所使用的术语“接触”和“接触样品”指，使抗体和样品进行物理接触，由此允许抗体特异性结合至B7-H6多肽(如果样品中包含的话)上的表位。应理解的是，本文中所指的接触以足够允许抗体特异性结合至B7-H6多肽的时间和条件进行。取决于样品的性质，可能需要预处理步骤，以释放B7-H6多肽或使B7-H6多肽中的表位去隐藏，以便抗体可以接近和特异性结合。此外，取决于样品的类型，处理方式也可能不同。例如，优选地，待分析其中是否存在B7-H6多肽的组织样品优选被均质化，并例如通过SDS PAGE或本领域技术人员所知的其它蛋白质分离方法，分离组织中包含的蛋白质。通过使用上文中定义的抗体，进行诸如Western印迹等免疫学方法，分析所分离的蛋白质中是否存在B7-H6多肽。这些方法还包括允许抗体特异性结合至B7-H6多肽的孵育步骤。为了增加特异性，可以进行洗涤步骤。本领域技术人员熟知怎样实施这些措施。如果使用组织切片作为样品(即组织切片样品)，应理解的是，可以考虑不仅分析是否存在B7-H6多肽，还可以分析其细胞或亚细胞定位。因此，在抗体结合前或后，组织应保持完整并可使用组织化学染色技术对其进行染色。本领域技术人员熟知进行组织切片免疫染色的合适技术。取决于组织切片样品是否已经被包埋在诸如石蜡等包埋介质中，可能需要除去所述包埋介质。相关技术在本领域公知。
[0063]本文中所使用的术语“确定”指，检测与样品中包含的B7-H6多肽(如果有的话)特异性结合的抗体。与抗原特异性结合的抗体的检测方法在本领域公知。优选地，可以将待在本发明方法中应用的抗体本身与可检测标记物偶联，所述可检测标记物例如放射性同位素(例如碘、锝的放射性同位 素)、荧光或化学发光试剂(例如FITC、罗丹明)、能够通过转化底物来产生可检测信号的酶(例如辣根过氧化物酶、萤火虫萤光素酶或β半乳糖苷酶)、荧光蛋白(例如绿色、蓝色或红色荧光蛋白)。合适的可检测标记物在本领域熟知。还优选地，应用于本发明方法中的抗体可以与能够吸引检测试剂的试剂偶联。这样的试剂可以是生物素。在这种情况下，可以使用抗生物素蛋白或链霉亲和素偶联的检测试剂，所述试剂在与结合后的抗体上的生物素结合后将充当可检测标记物。在这种情况下，合适的可检测标记物是以上提及的可检测标记物，更优选地，在这种情况下，将酶用作可检测标记物。此外，可以使用第二抗体检测第一抗体，第一抗体即待在本发明方法中应用的与样品中的Β7-Η6多肽结合的抗体。第二抗体应与以上描述的可检测标记物偶联。因此，在后一情况下，第二抗体将在与第一抗体结合后产生可检测信号，并由此使得能够检测所结合的第一抗体。以第二抗体检测所结合的抗体的原理在本领域公知，并常规用于例如确定结合在组织切片上的抗体。取决于可检测标记物的类型，可以应用不同的检测方法，使用针对可检测标记物产生的信号的读取器系统。这样的系统包括自动化信号读取装置，诸如ELISA或RIA读取器，也包括用于手动或自动检测可检测信号的显微装置。此外，读取器系统可以确定样品的其它信息，例如显微系统可以光学展示组织切片的细胞，或者自动化信号读取器还可以确定样品包含的其它生物标记物。
[0064]在本发明方法的一个优选实施方案中，癌症是T细胞淋巴癌、髓性白血病、结肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。
[0065]本发明还提供了在疑似患有炎性疾病的受试者的样品中诊断炎性疾病的方法，其包括:
[0066]a)在允许本发明抗体结合至其在B7-H6多肽上的表位的条件下，将样品与本发明的抗体接触；和
[0067]b)确定抗体与所述表位结合，由此诊断炎性疾病。
[0068]除非在下文中另有说明，否则，与癌症诊断方法或本文其它地方的其它实施方案结合所进行的术语解释，经适当修改后，也适用于上述方法中的术语。
[0069]本文中所使用的术语“受试者”涉及动物，优选哺乳动物和更优选人。本发明的方法适用于疑似患有炎性疾病的受试者。疑似患有炎性疾病的受试者是表现出临床上明显的炎性疾病症状的受试者、或是患炎性疾病的倾向性增加的受试者。在大规模诊断筛选试验中，疑似患有炎性疾病的受试者甚至可以是健康的受试者，即没有显示疾病症状的受试者或没有疾病倾向性的受试者。
[0070]如本文中其它地方所述及的，以上所提及的炎性疾病优选是病毒感染。
[0071]本发明还涉及用于在样品中诊断癌症或炎性疾病的装置，其包含:
[0072]a)包含本发明抗体的分析部件；和
[0073]b)检测分析部件中抗体与其在B7-H6多肽上的表位结合的检测器。
[0074]本文中所使用的术语“装置”涉及，至少包含可操作地互相连接的上述分析部件和评估部件的系统。如何以操作方式连接装置的部件将取决于装置中所包括的部件的类型。例如，在采用样品自动分析部件时，通过所述自动操作分析部件获得的数据可以经例如计算机程序处理，以通过评估部件获得期望的结果。优选地，在这样的情况下，这些部件包含在单个装置中。分析部件可以包含固定在固体支持物上的抗体。这样的分析部件对液体样品特别有用。待以本发明装置调查的样品优选是组织样品，更优选是组织切片样品。因此，在另一方面，抗体可以包含在检测溶液中，所述检测溶液可以由分析部件施加于诸如组织切片的组织样品上。检测溶液可以保存在分析部件中或分开的小瓶中，甚至保存在装置之外。评估部件，优选计算机或数据处理装置，包含执行规则，即算法，用于评估由分析部件确定的结合，由此根据信号的类型、强度和(在组织样品的情况下)信号在组织中的位置，评估结合是否显著。对于经评估显示非显著结合的样品，将确立不是癌症的诊断。如果经评估得到显著结合，则将确立是癌症的诊断。
[0075]优选地，装置在其评估部件中还包含附带算法的执行专家系统，该系统适应于根据所确立的诊断给出合适的疗法或治疗的建议(见本文中其它地方的详细描述)。
[0076]在本发明装置的一个优选实施方案中，所述样品为组织或体液样品。
[0077]最后，本发明涉及用于诊断癌症或炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗体和优选地用于检测所述抗体与其在B7-H6多肽上的表位的结合的试剂。
[0078]本文中所使用的术语“试剂盒”指，以即用形式提供的、用于在样品中诊断癌症的上述抗体和用法说明的集合。优选地，在单个容器中提供抗体和用法说明。优选地，试剂盒还包含进行诊断所必需的其它组件。这样的组件可以是检测抗体结合必需的辅助剂、用于预处理待分析样品的试剂或校正标准。
[0079]本说明书引用的所有参考文献，就其全部公开内容以及在本说明书中特别提到的公开内容，而特此并入作为参考。
实施例
[0080]以下实施例仅对本发明进行举例说明。无论在什么情况下，它们都不应解释为限制本发明的范围。
[0081]实施例1:获得抗B7-H6单克隆抗体(mAb) 1.18的免疫方法:
[0082]用完全弗氏佐剂中的IOOyg B7-H6_Ig融合蛋白皮下(s.c.)注射到4个不同部位，免疫6周龄的BALB/c小鼠，所述B7-H6-1g融合蛋白由B7-H6的胞外域融合至IgGl-Fc域组成(B7-H6-1g-FP)(见图1中所示)。3周后，以PBS中的100 μ g B7-H6_Ig-FP进行腹膜内(1.P.)注射。3周后，以PBS中的BA/F3(pro-B细胞)-Β7-Η6转染子(2xl07个细胞)进行腹膜内注射。2个月后，以PBS中的IOOyg B7-H6_Ig-FP进行腹膜内注射。3周后，以PBS中的BA/F3-B7-H6转染子(2xl07个细胞)进行腹膜内注射，5天后，将脾细胞与Ag8小鼠骨髓瘤细胞融合。以流式细胞仪筛选910个杂交瘤细胞，选择所产生的免疫球蛋白与BA/F3-B7-H6细胞结合的杂交瘤细胞。此外，以ELISA，基于与B7-H6_Ig-FP的结合，对480个克隆进行筛选。选择抗B7-H6克隆1.18用于进一步研究，原因是其以高水平染色BA/F3-B7-H6转染子而不染色对照载体转导的BA/F3细胞、并且其以高水平结合内源性表达B7-H6的细胞系。
[0083]实施例2:通过ELISA检测抗B7-H6mAbl.18与B7-H6_Ig-FP的结合以及通过流式细胞仪检测与BA/F3-B7-H6转染细胞的结合:
[0084]ELISA检测:将B7-H6_Ig-FP `(3 μ g/ml)固定在ELISA板上，与所示浓度的抗B7-H6mAbl.18孵育，用HRP缀合的mAbs进行显色。
[0085]流式细胞仪检测:以抗B7-H6mAbl.18 (2 μ g/ml)、同种型对照、NKp30_FP以及对照FP和PE缀合的第二 mAbs，染色BA/F3或BA/F3-B7-H6转染子。
[0086]数据描述了通过ELISA检测的抗B7-H6mAbl.18与B7-H6_Ig-FP的结合、以及通过流式细胞仪检测的与BA/F3-B7-H6转染细胞的结合。
[0087]实施例3:抗B7-H61.18mAb的结合涉及B7-H6的IgV域:
[0088]基于pcDNA3.1制备以下带⑶8引导肽和C末端HA标签、编码B7-H6的以下部分的下述构建体:
[0089]B7-H6_l (氨基酸 24_4δ4)
[0090]Β7-Η6_2 (氨基酸 83_4δ4)
[0091 ] Β7-Η6_3 (氨基酸 141-454)
[0092]B7-H6_4 (氨基酸 190_4δ4)
[0093]Β7-Η6_5 (氨基酸 239_4δ4)
[0094]将得到的质粒瞬时转染到HEK细胞中，随后以实施例2中描述的抗Β7-Η61.18mAb染色。如图5可见，抗B7-H61.18mAb与B7_H6_1(氨基酸24-454)和B7_H6_2(氨基酸83-454)结合，而不与B7-H6_3(氨基酸141-454)结合，表明B7-H6的氨基酸83-141 (O)HQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVV，如 SEQ ID NO:22 和图1与2中所示)参与抗B7-H6mAbl.18的结合。表达了所有截短的B7-H6蛋白，其均可以通过western印迹使用抗HA标签mAb检测到。
[0095]实施例4:抗B7-H6mAbl.18与不同来源细胞系的结合:
[0096]如实施例2中所述，以抗B7-H6mAbl.18染色不同来源的细胞系并以流式细胞仪进行分析。数据揭示了抗B7-H6mAbl.18与不同来源细胞系的结合。
[0097]实施例5:定量实时PCR测定B7_H6mRNA表达:
[0098]使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从肿瘤细胞系中提取RNA，使用TURBO DNA酶(Ambion)去除污染的DNA,使用ProtoScript M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(NEB)反转录 RNA。使用 SYBR Green I Master 和 LightCycIer480 (Roche)进行定量实时PCR0使用针对B7-H6的特异引物(GACCTGGAGCCATTGTGTCT，如SEQ ID N0:23中所示，和AAGCTGGACTGTTCCCTGTG，如SEQ ID N0:24中所示)和针对看家基因GAPDH的特异性引物(GCAMTTCCATGGCACCGT JBSEQ IDN0:25 中所示，和 TCGCCCCACTTGATTTTGG，如 SEQ ID NO: 26中所示)，以计算B7-H6mRNA相对于GAPDH的表达水平。数据显示了，以抗B7-H6mAbl.18染色的不同来源细胞系以不同量表达B7-H6mRNA。
[0099]实施例6:B7-H6在Ba/F3_B7_H6转染子的细胞离心涂片上的免疫组织化学染色: [0100]使用Dual Envision+System-HRP (Dako)，对 Ba/F3 和 Ba/F3-B7_H6 细胞 1:1 混合物的丙酮固定细胞离心涂片，进行染色。在阻断内源过氧化物酶活性后，以10%的山羊血清和0.lmg/ml人IgG,封闭细胞离心涂片。在Dako抗体稀释液中细胞离心涂片与5 μ g/ml抗B7-H6mAbl.18或小鼠IgGl同种型对照(克隆11711，R&D)孵育，洗涤，并与山羊抗小鼠和山羊抗兔免疫球蛋白缀合的Dako过氧化物酶标记的聚合物孵育。在与3，3’ - 二氨基联苯胺(3,3，-diaminobenzidine) (DAB)底物溶液孵育后，以苏木精(Hematoxylin)对细胞核进行复染色，以光学显微镜分析封装后的细胞离心涂片。数据揭示，在细胞离心涂片上，抗B7-H6mAbl.18 染色 B7-H6Ba/F3-B7_H6 转染子。
[0101]实施例7:原代NK细胞在与转导了 B7-H6的BA/F3细胞共培养后的脱粒:
[0102]以IL-2 扩增 14 天的 NK 细胞，与 BA/F3、BA/F3-B7-H6 (NKp30 的配体)或 BA/F3-MICA (激活受体NKG2D的配体)细胞，在培养基中，于存在PE缀合的抗CD107mAb的条件下，培养5小时。在共培养后，以流式细胞仪，按CD107阳性NK细胞的比例确定NK细胞的脱粒。误差条表示三次重复培养的平均值+/-SD。数据揭示，BA/F3-B7-H6细胞诱导原代NK细胞的脱粒。
【权利要求】
1.特异性结合至由B7-H6多肽的胞外域的一部分形成的表位的抗体，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含SEQID NOs: 5, 7，9，15，17和19中所示的互补决定区(⑶Rs)。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
4.权利要求1至3之任一的抗体，其中所述抗体是根据布达佩斯条约、于2011年2月2日以保藏号DSM ACC3117保藏在德国不伦瑞克DSMZ的抗体。
5.权利要求1至4之任一的抗体用于癌症的治疗或诊断。
6.权利要求4的抗体，其中癌症是T细胞淋巴癌、髓性白血病、结肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。
7.权利要求1至4之任一的抗体用于炎性疾病的治疗或诊断。
8.权利要求7的抗体，其中炎性疾病是病毒感染。
9.用于在疑似患有癌症的受试者的样品中诊断癌症的方法，包括: a)在允许权利要求1至4之任一的抗体结合至其在B7-H6多肽上的表位的条件下，将样品与所述抗体接触；和 b)确定抗体与所述表位的结合，由此诊断癌症。
10.权利要求9的方法，其中癌症是T细胞淋巴癌、髓性白血病、结肠癌、B细胞淋巴癌、黑素瘤或宫颈癌。`
11.用于在疑似患有炎性疾病的受试者的样品中诊断炎性疾病的方法，包括: a)在允许权利要求1至4之任一的抗体结合至其在B7-H6多肽上的表位的条件下，将样品与所述抗体接触；和 b)确定抗体与所述表位的结合，由此诊断炎性疾病。
12.权利要求9至11之任一的方法，其中所述样品是组织或体液样品。
13.用于在样品中诊断癌症或炎性疾病的装置，其包含: a)包含权利要求1至4之任一的抗体的分析部件；和 b)检测分析部件中抗体与其在B7-H6多肽上的表位的结合的检测器。
14.权利要求13装置，其中所述样品是组织或体液样品。
15.用于诊断癌症或炎性疾病的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至4之任一的抗体、以及优选地，用于检测所述抗体与其在B7-H6多肽上的表位的结合的试剂。
【文档编号】G01N33/483GK103797032SQ201280044703
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年9月10日 优先权日:2011年9月13日
【发明者】A·塞勒温卡, G·莫尔登豪尔 申请人:德国癌症研究中心