触发装入胶囊的信号生成物质的激活的方法和利用激活的信号生成物质的仪器的制造方法

触发装入胶囊的信号生成物质的激活的方法和利用激活的信号生成物质的仪器的制造方法
【专利摘要】公开了用于执行生物测定的方法，其包括激活含有信号前体的胶囊，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中其能够生成可检测信号的形式，所述激活包括用热和用酸或碱催化溶液处理所述胶囊，所述热和催化溶液的pH的组合是这样的，以便将所述前体水解为其中其能够生成可检测信号的形式。
【专利说明】触发装入胶囊的信号生成物质的激活的方法和利用激活的信号生成物质的仪器
[0001]本发明涉及例如用于检测食物中的细菌污染，用于检测水中的生物污染物，或用于检测体液例如血液及其组分、鼻咽液、尿或唾液中的物质例如抗体、抗原和核酸的存在的生物测定。需要检测的材料通常一般被称为靶或分析物。
[0002]特别地,本发明涉及这样的生物测定,其使用装入胶囊(encapsulated)的信号生成物质用于指示样品中的靶存在(定性)或用于测定样品中存在的靶量(定量)，且涉及用于控制来自含有信号前体材料的胶囊的信号生成开始的方法，所述信号前体材料可从其中基本上不生成信号的潜伏形式转换为其中能够生成可检测信号的形式。更具体而言，本发明涉及控制信号前体材料从胶囊中的释放且控制其从其潜伏形式转换为信号生成形式。在下文说明书中，这个过程被称为“触发激活”。
[0003]发明背景
生物测定基于至少一种标记的生物分子与待检测的分析物(靶)的相互作用。标记充当标志，指示反应已在靶和在生物分子上有意选择的受体或亲和分子之间发生，所述受体或亲和分子唯一地与靶相互作用且结合。标记可以使用不同技术进行测量:
(i)光学上通过测量染料的吸收或由荧光团发出的荧光，或由发光或化学发光化合物发出的冷光，或测量由凝集胶乳颗粒的光散射引起的浊度；
(ii)放射学上通过测量放射性同位素；
(iii)电化学上通过测量介质或电活性物质；
(iv)磁性地通过测量磁力；或
(V )压电地通过测量质量中的改变。
[0004]众所周知的标记包括如在酶联免疫吸附测定(ELISA)中使用的酶和在放射免疫测定中使用的放射性同位素；其他标记类型包括荧光团、发光体、生色团、脂质体、免疫凝集测定中的胶乳颗粒、染料、介质和金颗粒。
[0005]尽管不是唯一地，本发明特别涉及可使用光学技术检测的标记且涉及控制最大信号输出量的开始，使得可以获得读数，并且在需要时，在信号输出量衰变前或在信号通过稀释和/或扩散变得消散前的时间段过程中重复。
[0006]胶囊在本发明中的目的是双重的:首先，它们充当关于亲和分子或受体的媒介物或底物，所述亲和分子或受体附着至胶囊表面上，并就其特异性识别且结合样品中的靶分子的能力加以选择。其次，胶囊含有信号前体的很多分子(IO7-1O9或更高)。因而，在靶分子与胶囊表面上的亲和分子之一之间的结合后，和在胶囊内的信号前体从其潜伏形式后续转换为其信号生成形式后，单一靶分子的存在可以通过许多上千万或甚至上亿的可检测信号生成分子指示。这是非常有力的扩增技术，其可以扩大生物测定的检测限。
[0007]用于在生物测定中使用的含有有机信号生成物质的胶囊由公开的国际专利申请号TO02/12888 A2已知，所述专利的公开内容整体通过弓I用并入本文。这些已知胶囊通过用两亲物质(例如离子型去污剂)的水溶液处理不带电的固体有机信号生成物质进行制备，所述物质具有低水溶性或是水不溶性的(例如荧光素二乙酸酯(FDA))。两亲物质将自身排列在固体信号生成物质的表面上，对其表面赋予电荷且致使其对用带电荷的聚电解质层，随后为带相反电荷的聚电解质的多个交替层的后续包被敏感。聚合物层借助于静电逐层沉积而自装配到固体信号生成物质(具有其来自两亲物质的感生电荷)上，因此形成围绕固体核的多层聚合壳。
[0008]包被步骤还可以使用荷有官能团的物质单层，而不使用静电沉积进行，所述官能团用于包衣层的共价偶联。
[0009]因此获得的胶囊通过具有附着至其表面的亲和分子进行修饰用于在生物测定中使用，所述亲和分子根据待检测的靶分子类型加以选择。
[0010]在使用上述胶囊的检测方法的第一个步骤中，靶分子的溶液与由亲和分子修饰的胶囊一起温育，所述亲和分子特异性识别靶分子。温育经过足以导致靶-亲和分子复合物的时间段进行；所述亲和分子保持与胶囊结合。
[0011]在检测方法的第二个步骤中，使所得到的靶亲和分子-胶囊复合物与其亲和分子未与靶分子形成复合物的胶囊分开。
[0012]在检测方法的第三个步骤中，例如通过用有机溶剂例如醇、酮、酯、醚等处理胶囊，使其崩解，以将信号生成有机物质释放到溶液内。
[0013]在检测方法的最后一个步骤中，检测且测量通过释放且溶解的信号生成有机物质生成的信号。检测的信号与靶分子的量相关。
[0014]然而，这种已知检测方法的缺点之一是胶囊的崩解和通过信号生成有机物质的信号生成一般很慢，并且可以花费不同时间量。这是不希望的，因为在使用液态可透膜的横向流动测试或使用微流体通道的测试中，例如信号生成分子被释放到经历横向流动的溶剂流内。因此，信号生成分子的缓慢释放可以导致扩散的可检测信号，因为它通过溶剂的流动传播。
[0015]发明概述
现在已开发了这样的方法，其用于控制信号前体从胶囊内的释放，并且用于控制信号前体在短时间段内从其潜伏形式转变为其信号生成形式。信号最大值在数秒内实现，允许获得读数(并且在需要时加以重复)，同时信号处于其峰值，并且在信号强度减弱或信号通过扩散或稀释变得消散前。
[0016]该方法可应用于信号前体，其可通过酸或碱催化的水解从潜伏形式转换为信号生成形式。关键特点是对胶囊(实际上，胶囊/亲和分子/靶复合物)实施具有平衡PH的处理溶液，所述平衡PH正好太高而使显著的基于酸的水解无法发生，或可替代地，正好太低而使显著的碱催化的水解无法发生，并且随后对处理溶液实施一阵热(a burst of heat),以实现在45°C - 65°C范围中的处理溶液温度。这加速反应动力学，触发信号生成的激活:信号前体从其潜伏形式水解为其信号生成形式，并且作为明亮的信号在溶液中变得可检测。在一些情况下，如果生成的信号通过肉眼检测，则它可以是足够的。例如，可通过肉眼检测的强信号对于定性测试可以是足够的，所述定性测试指示靶或分析物存在于样品中。在其他情况下，可以希望检测对于样品中存在的靶或分析物量的定量确定而生成的信号量。在这种情况下，信号的检测可以使用阅读装置电子地执行。
[0017]在依照本发明的横向流动或微流体测试中，最大信号足够迅速地生成，没有扩散或消散效应干扰信号的读数。此外，在加热前处理溶液能够使胶囊以稳定形式维持足够时间段，用于在触发激活步骤实现前，反应物和试剂如预期地沿测试条膜或微流体通道流动。
[0018]本发明的实施方案改善反应动力学，允许结果更迅速地获得。信号输出量是可由用户管理和控制的。在一个实施方案中，最大信号输出量几乎立即实现。这意味着读数可以几乎立即完成，并且重复读数可以在信号输出量开始降解前获得。
[0019]在一个实施方案中，本发明提供了触发生物测定中的信号生成的生成方法，所述生物测定使用含有信号前体的胶囊，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式。该方法包括用处理溶液处理胶囊，所述处理溶液的PH和温度是这样的，其使得不发生信号前体的显著水解，并且随后加热处理溶液中的胶囊，以引起信号前体开始水解为其中能够生成可检测信号的形式。
[0020]在平衡的pH和温度下，信号前体是稳定的，但当加热时水解。超声波振动以及更常规的加热形式可以用于实现加热。
[0021]本发明的另一个实施方案提供了用于使用含有信号前体的胶囊执行生物测定的仪器，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式。该仪器包括用于加热含有胶囊的环境温度的平衡PH的溶液的工具。
[0022]本发明的另一个实施方案提供了用于检测来自生物测定装置的信号输出量的仪器，所述生物测定装置使用含有信号前体的胶囊，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式，所述仪器包括:
(i )用于照亮胶囊在其中用溶液处理的反应区带的光源，所述溶液的温度是这样的，使得基本上不发生信号前体的水解，并且所述溶液的pH是这样平衡的，使得:
(a)pH太高而使信号前体不能在环境温度下经历显著的酸催化的水解，但在所述pH下信号前体在高温下经历显著水解；
或.(b)pH太低而使信号前体不能在环境温度下经历显著的碱催化的水解，但在所述pH下信号前体在高温下经历显著水解；
(i i )用于检测由生物测定装置发出的光的光学检测器，和
(iii)用于将反应区带中的溶液加热至在其下信号前体经历水解的温度的加热装置。
[0023]在本发明的另外一个实施方案中，提供了使用含有信号前体的胶囊执行生物测定的方法，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式转换为能够生成可检测信号的形式，其中所述检测步骤包括用环境温度平衡PH溶液处理胶囊，并且随后加热溶液以促使信号前体从其潜伏形式转换为其信号生成形式。
[0024]附图简述
图1是依照本发明的实施方案的生物测定检测方法的图示，所述检测方法使用装入胶囊的信号前体分子用于检测靶分子(分析物);
图2是在不同pH和温度条件下，用于研究装入胶囊的信号前体的激活触发的实验仪器的图示；
图3是图2中所述的实验仪器的部分的示意图，显示温度控制的样品管架的细节；
图4是图2中所述的实验仪器的部分的示意图，显示激发光源与温度控制样品管架的联接和光电二极管检测器与管架的联接；
图5是显示关于在胶囊中的荧光二乙酸酯(FDA)的热激活实验数据的多种特征的曲线图，所述胶囊在具有pH 10.1 (正好低于FDA水解为荧光素所需的值)的碱性处理溶液中；图6至9是进一步的曲线图，显示不同温度和不同pH值对在第一种类型的胶囊的碱性处理溶液中的FDA激活为荧光素的作用；
图10至13是曲线图，显示不同温度和不同pH值对在第二种类型的胶囊的碱性处理溶液中的FDA激活为荧光素的作用；
图14是横向流动测试条和适合于接受测试条的阅读装置的示意性透视图；
图15是沿线15' -15'截取的图14中所示的阅读器的示意性横截面视图，并且在剖面中显示完全插入阅读器内的测试条的侧面；
图16是可替代的横向流动测试条的示意性平面图；
图17是图16的可替代的横向流动测试条及其相关读数仪器的示意性透视图；
图18是沿线18' -18'截取的图17中所示的阅读器的示意性横截面视图，并且在剖面中显示完全插入阅读器内的测试条的侧面；
图19是显示关于使用含有信号前体的胶囊的可替代免疫测定的步骤顺序的简图；
图20是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行免疫测定的另一个可替代方案的部分的简图；
图21是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行杂交测定的另外一个可替代方案的部分的简图；和
图22是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行杂交测定的另一个方案的部分的简图。
[0025]发明详述
参考图1，这显示根据本发明实施方案的生物测定检测方法例子的步骤的图示，所述检测方法使用标记的胶囊以与靶分子或分析物结合，所述胶囊含有从胶囊中释放的可转换为信号生成形式的信号前体。
[0026]步骤1-在靶分子和胶囊表面上的亲和分子之间的复合物形成
在第一个步骤中，将怀疑含有分析物10的测试样品在溶液中与含有信号前体材料30的胶囊20混合。胶囊的壁可以例如由具有疏水头21和亲水尾22的脂质形成。胶囊在其表面上具有亲和分子40，其就其与分析物特异性相互作用且与之结合的能力加以选择。如果存在的话，分析物将经由亲和分子的中间阶段变得与胶囊结合，以形成复合物50。
[0027]步骤2-复合物的固定
在第二个步骤中，将复合物50固定到底物60上，所述底物60具有附着至其表面的捕获分子70。捕获分子70也就其与分析物10特异性结合的能力加以选择，因此未变得与分析物结合的胶囊将不与捕获分子70相互作用且将变得不固定。固定复合物在固定位点处形成“夹心”，包含固定的捕获分子70、分析物10和亲和分子40 (其保持附着至胶囊20)。
[0028]步骤3-信号前体至信号生成形式的转换-触发激活
在第三个步骤中，固定的复合物在处理溶液中进行处理，以将信号前体30转换为其信号生成形式，其中个别信号生成分子80从胶囊中释放到溶液内用于通过信号检测工具(未示出)检测。
[0029]这个第三个步骤通过在平衡pH溶液中处理固定复合物至加热步骤来进行。平衡PH溶液是其中pH略微太高而使信号前体不能经历酸催化的水解成为其信号生成形式的溶液，或其中PH略微太低而使信号前体不能经历碱催化的水解成为其信号生成形式的溶液。胶囊在平衡PH的处理溶液中是稳定的，并且胶囊中含有的信号前体不经历任何明显量的水解。然而，当施加另外的热时，改变反应动力学，并且发生信号前体的水解，以将其转换为信号生成形式。
[0030]在本发明的可替代实施方案中，当在处理溶液加入固定复合物和水解开始(激活触发)之间需要很少的间隔或不需要间隔时，可以使用强酸性或强碱性处理溶液，并且不需要加热步骤。
[0031 ] 在不同的pH和温度条件下，装入胶囊的信号前体的激活触发的实验测定
现在参考图2至5，将描述在不同的pH和温度条件下，用于评估装入胶囊的信号前体的激活触发的实验设置。
[0032]图2是总体实验设置的示意图，所述总体实验设置包括用于控制实验的计算机201、数据采集卡202、经由光导纤维209将激发光供应给待测试的样品的激发光源203，所述样品包含在置于温度控制的管架204中的样品管205中。在计算机201的控制下，温度控制器206调节管架204的温度。第二根光导纤维209将发射光供应给检测器207，并且光功率计208将检测到的发射光转换为反馈给计算机201的数字读出。
[0033]图3是显示温度控制的样品管架204的细节的示意图。管架包括样品管205可插入其内的热块301和绝缘块302。在热块301的背部，存在用于加热管205中的样品的珀耳帖(Peltier)装置303。热块301将热从珀耳帖装置303转移到管205中的样品；绝缘块302使系统绝缘，防止热从组件中逃出且防止外部环境空气添加或去除热。将珀耳帖装置303安装在具有散热片305的冷板304上。强制冷却可以由扇306提供。温度控制的管架组件安装在散热器支架307上。
[0034]现在参考图4，将描述光学设置。温度控制的管架204配备两根光导纤维209，其基本上彼此成直角，并且当管205置于架中时，处于方向上与管205的长轴接近垂直的平面中。光导纤维209之一连接到过滤光源401，其可以是例如LED。来自源401的光经过准直透镜402，随后经过激发滤光片403，其滤出不促成其激活待触发的信号生成分子激发的波长，并且经过耦合透镜404，至光导纤维209。第二根光导纤维用于将来自样品管205的发射光传送到光学过滤的高灵敏度光功率计(208，参见图2)，用于测量由样品管中的激发分子发出的光量。来自这个第二根光导纤维209的光经过准直透镜405，随后经过滤出非所需发射波长的发射滤光片406，并且经过聚焦透镜407，至光电二极管408。激发滤光片403和发射滤光片406两者均为10 nm宽的带通滤光片。
[0035]下述部分用于构建实验仪器:
温度控制器-管和溶液加热(TE Tech，型号；TC-36-25-RS232)
24V DC 电源(Mean Well，型号;SP-320_24)
数据米集装置(Measurement Computing,型号；USB_1280FS)
高倍 LED 驱动器(Luminus 型号；DK-114N_3)
检测器头(Newport Corp.,型号；918D)
光导纤维(PVC加套的，IOOOum芯，NA=.50)
珀耳帖模块(TE Tech，型号；TE 63-1.0-1.3)
调整对珀耳帖装置的电压的电阻网络纤维联接的LED头(定制为使联接最大化)
温度控制的管架:
a.纤维适配器块(定制为使绝缘最大化)
b.热管块(定制为使热质量最大化)
c.热交换组件(冷板、散热片、扇)
不透光的盖
当进行实验时，仪器在不透光的盖(未示出)下遮蔽。
[0036]如上所述，温度控制的管架204、激发光源203和光功率计208各自连接到计算机201，其控制何时施加热，何时打开激发光并且光功率计何时收集发射数据。
[0037]在每个实验开始时，将已知体积的pH调整的激活溶液置于充当样品管205的微离心管内，所述微离心管依次又置于温度控制的管架204内。计算机收集来自仅含有激活溶液的管的连续发射数据流。这提供了关于其中不存在信号前体和信号生成分子的情况的基线。 [0038]当确定稳定基线时，将已知数量的含有荧光素二乙酸酯(FDA)作为信号前体的胶囊溶液分配到含有温度控制的激活溶液的管205内。胶囊的溶液处于与管架204中的样品管205中的激活溶液相同的温度。荧光素二乙酸酯是非荧光的，但可水解为在激发下强烈发突光的突光素。
[0039]计算机201随后开始下述循环:获得不含激发的发光的“暗”阅读，随后打开激发光并且获得激发荧光的阅读。存入的数据含有三部分信息:循环数、暗阅读和荧光激发阅读。
[0040]每个循环长I秒。每个阅读由在光功率计208的光电二极管408上收集的入射光的1000份个别样品的平均值组成。这个循环在加热实验自始至终继续。在某一循环数(代表所需时间延迟)后，并且不破坏循环，计算机201打开珀耳帖加热器303，其将反应体积的温度在数秒内升高至其升高的设定点。一旦加热器已打开并且温度升高至所需水平，温度就对于实验的剩余部分保持恒定。数据在实验自始至终连续存入。
[0041]当胶囊引入激活溶液内时，发生一些水解并且开始自动发光和自猝灭的过程。来自溶液的光输出量的基线增加，并且检测器电流从大约ιο_η安培上升到10_9安培，并且随后保持相当恒定直到施加热时。
[0042]在“半稳定”/ “时间延迟”实验期过程中，在激发过程中检测到的光的读数始终高于在相同时间存入的暗阅读光水平。这个差异归于两个原因:
(i)少量激发光经过发射滤光片406。这在激发光中的一些变得联接到发射收集纤维209内时发生。尽管具有在发射滤光片的通带(pass-band)外的三个十进位(103)光排斥，仍检测到这个激发光。
(ii)当激发时，在起始水解事件过程中释放的荧光素中的一些发出超过溶液自猝灭能力的荧光。检测到这个荧光。
[0043]与使用哪个读数(激发或非激发的)无关，在溶液中的荧光素量和通过发射滤光片检测到的光量之间存在直接相关。荧光素自猝灭，即由于其宽激发带而吸收其自身荧光，这是众所周知的现象。一旦施加热，检测到的光中的降低就显示当荧光素浓度增加时，溶液自猝灭的能力也增加。这将在下文参考图5更详细地说明。[0044]热激活实验数据的表征
图5是显示关于来自胶囊的光输出量的一般痕迹的曲线图，所述胶囊由脂质DSPE-PEG2000 Amine和十二烷基硫酸钠(SDS)形成，并且含有FDA作为信号前体。将胶囊置于具有PH 10.1的激活溶液中，所述pH正好低于在其下这类胶囊中的FDA无需另外的热将经历水解成为荧光素的pH值。在下述说明书中,将说明在点A到G处的行为。
[0045]A.在时间零时，将胶囊加入pH 10.1的室温激活溶液中。在数秒内，荧光素的量被释放到溶液内。
[0046]B.在激发曲线5e中，在前30秒过程中在溶液中荧光素的快速增加产生检测到的荧光中的爆发，所述荧光由激发不足的附近荧光素分子主动猝灭。
[0047]C.在非激发曲线5n中，自猝灭中的同时增加减少可检测的自动发光。溶液的可检测总发光输出量朝向半稳定的平衡。随着时间过去，这个基线即使没有热的添加也增加。
[0048]D.在激发曲线5e中，在激发阅读过程中记录的基线值始终部分地高于不使用激发光获得的阅读。不希望受理论束缚，这被认为部分是由于下述两种因素:
Ca)通过发射滤光片的可检测的激发光渗漏
(b)少量可检测的受激荧光发射。
[0049]E.在非激发曲线5n中，存在并未自猝灭的可检测的自动发光的基线值。
[0050]F.在激发曲线5e中，在施加热将温度升高到65°C后，由于胶囊中的FDA水解，在荧光输出量中存在可检测的增加。(总光=刺激的荧光+自动发光-自猝灭的)。
[0051]G.在非激发曲线5n中，由于溶液中的荧光素浓度快速增加，在自动发光的自猝灭中存在可检测的增加。(总光=自动发光-自猝灭的)。
[0052]在不同条件下的激活触发
现在参考图6至9，这些是显示如在上文描述的图5评估中使用的，含FDA胶囊的行为的一系列曲线图，所述胶囊由DSPE-PEG2000 Amine和十二烷基硫酸钠(SDS)形成。
[0053]图6是显示来自在具有低pH值9.5的处理溶液中的胶囊的光输出量的曲线图，在250秒后，对所述处理溶液施加热，以将处理溶液的温度从室温(23 °C )升高到45°C。未发生激活；激发曲线6e和非激发曲线6n在热施加后继续其基本上平行的痕迹。胶囊在45°C下在pH 9.5下是稳定的。
[0054]图7是显示来自在具有高pH值11.0的处理溶液中的胶囊的光输出量的曲线图。如之前，在250秒后，将溶液温度从室温(23°C)升高到45°C，但高pH引起在胶囊加入溶液后且在加热步骤前几乎立即的激活开始。激发曲线7e和非激发曲线7n在约25秒后广泛分离。
[0055]图8是显示来自在具有pH值10.1的平衡处理溶液中的胶囊的光输出量的曲线图，在300秒后，对所述处理溶液施加热，以将处理溶液的温度从室温(23°C)升高到65°C。在加热后发生强激活。激发曲线Se和非激发曲线Sn在胶囊加入处理溶液后50秒到300秒的时间段过程中靠拢。这证实胶囊在这些PH条件下在室温下是稳定的，但激活可以通过加热触发。
[0056]图9是显示来自在具有高pH值的处理溶液中的胶囊的光输出量的另一个曲线图；在这个实验中，pH是12.5。在250秒后，将溶液温度从室温(23°C)升高到65°C，但高pH引起在胶囊加入溶液后且在加热步骤前几乎立即的激活开始。激发曲线9e和非激发曲线9n在约25秒后广泛分离，并且尽管在250秒时升高温度后，在激发曲线9e中可见荧光输出量中的轻微增加，但这并非显著增加。这个实验证实高PH自身可以用于触发激活而无延迟。这在其中希望立即激活并且在激活触发前不需要稳定平衡的时期的情况下可以是有用的。
[0057 ]现在参考图10至13，这些是显示在指定pH和温度条件下，不同类型的含FDA胶囊的行为的一系列曲线图。这批含FDA胶囊使用如公开的国际专利申请号W002/12888 A2中所述的聚电解质的逐层沉积进行制备。
[0058]图10是显示来自在具有低pH值10.5的处理溶液中的胶囊的光输出量的曲线图，在250秒后，对所述处理溶液施加热，以将处理溶液的温度从室温(23°C)升高到45°C。未发生激活；激发曲线IOe和非激发曲线IOn在热施加后继续其基本上平行的痕迹。这些胶囊在45°C下在pH 10.5下是稳定的。
[0059]图11是显示来自在具有pH值11的平衡处理溶液中的胶囊的光输出量的曲线图，在300秒后，对所述处理溶液施加热，以将处理溶液的温度从室温(23°C)升高到45°C。在加热后发生强激活。激发曲线lie和非激发曲线Iln在胶囊加入处理溶液后约75秒到300秒的时间段过程中靠拢。这证实胶囊在这些PH条件下在室温下是稳定的，但激活可以通过仅中等加热而快速触发。
[0060]图12是类似于图10那种的曲线图，显示来自在具有甚至更低的pH值10.0的处理溶液中的胶囊的光输出量，但在250秒后，对所述处理溶液施加更多的热，以将处理溶液的温度从室温(23°C)升高到65°C。再次，未发生激活；激发曲线12e和非激发曲线12η保持靠拢，并且在热施加后继续其基本上平行的痕迹。这些胶囊在ΡΗ10.0下甚至在65°C下是稳定的。
[0061 ] 图13是类似于图11那种的曲线图，显示来自在具有pH值11的平衡处理溶液中的胶囊的光输出量，在250秒后，对所述处理溶液施加热，以将处理溶液的温度从室温(23°C)升高到45°C。在加热后发生强激活。激发曲线13e和非激发曲线13η在胶囊加入处理溶液后约75秒到250秒的时间段过程中靠拢。这证实胶囊在这些pH条件下在室温下是稳定的，但激活可以通过加热而快速触发。
[0062]这个实验还证实激活的触发通过温度增加而引起。热在这个实验中比图11情况下早50秒施加，并且激活相应地早50秒发生。因此，激活的开始可归于温度增加，而不归于在平衡PH溶液中的温育持续时间。
[0063]激活溶液的平衡pH的测定
根据研究在不同的PH和温度条件下，装入胶囊的信号前体的激活触发的上文实验，本发明人注意到不同胶囊类型需要将PH调整至不同值用于实现所需平衡。这将是预期的，因为不同胶囊类型将对激活溶液具有不同通透性、不同孔径、不同壁厚度等。这些都是可以影响胶囊内含有的信号前体的水解速率的因素。此外，改变信号前体将最可能意指水解在不同PH下发生。因此，对于胶囊类型和信号前体类型的每个组合，必须测定平衡pH。
[0064]这通过实验容易地完成:
对于胶囊类型和信号前体类型的任何选择的组合，制备一系列不同PH的室温溶液，并且随后将一份胶囊加入每种溶液中。将溶液用激发光照射，并且如果检测到强烈信号，则溶液注明为落在平衡pH范围外。如果未检测到信号，则将溶液从45°C加热到65°C，并且再次用激发光照射。发出强烈信号的加热溶液注明为落在平衡PH范围内。仍不发出信号的加热溶液注明为落在平衡pH范围外。
[0065]需要时，可以通过制备对pH范围内的pH具有小增量改变的一系列溶液进行细调，所述pH范围已注明为来自上述第一轮实验的关键pH范围。
[0066]总之，平衡pH可以通过下述进行测定:
Ca)将含有信号前体的一份胶囊加入一系列不同pH的环境温度溶液中；
(b)用激发光照射该系列的环境温度溶液；
(c)拒绝在环境温度下发出强烈信号的溶液；
Cd)加热在环境温度下基本上不发出信号的溶液；
Ce)拒绝在加热后基本上不发出信号的溶液，和
Cf)将在加热后发出强烈信号的一种或多种溶液的PH值注明为限定平衡pH。
[0067]优选地，将激活或处理溶液缓冲，以在其与测定系统中的其他溶液混合时维持其pH。
[0068]优选地，平衡pH激活或处理溶液的pH对于信号前体经历显著酸催化的水解成为其信号生成形式过高至多达0.5，或对于信号前体经历显著碱催化的水解成为其信号生成形式过低至多达0.5。更优选地，激活或处理溶液的pH对于信号前体经历显著酸催化的水解成为其信号生成形式过高至多达0.2，或对于信号前体经历显著碱催化的水解成为其信号生成形式过低至多达0.2。甚至更优选地，激活或处理溶液的pH对于信号前体经历显著酸催化的水解成为其信号生成形式过高至多达0.1，或对于信号前体经历显著碱催化的水解成为其信号生成形式过低至多达0.1。
[0069]用于加热步骤的温度范围
400C -70°C、优选45°C - 65°C的温度范围是测试溶液应升高到的温度。已选择40°C为使用的最低“升高的”温，因为在大多数地理位置中，这远远超过占优势的环境温度，并且因此可以与未加热条件区分。低于40°C，完全激活可以花费极长时间，导致本发明意图克服的信号消散的问题。选择70°C的上限是因为它很热，但未热至对于用手触摸危险的程度。甚至更高的温度可以引起化学系统中不需要的不稳定性。另外，本发明人考虑简单手提式阅读装置变得如此热将是不实际的。
[0070]在45°C -65°C的优选温度范围中，能够在检测到信号最大值前经过时间延迟实现控制措施。这归于本发明的通用性。
[0071]用于实现本发明的示例仪器
参考图14和15，显示了在横向流动测试中用于实现本发明的仪器的例子。
[0072]图14是横向流动测试条1410和阅读装置1401的示意性透视图，所述阅读装置1401适合于接受测试条1410且处理其，如下文更详细地描述的。
[0073]阅读器1401包括壳体1402。在一个端部处，壳体具有狭槽1403，如由箭头1418指示的，测试条1410可通过所述狭槽1403插入。狭槽导向在壳体1402的内部空间中提供的托盘1404，该托盘充当在测试条1410插入阅读器内时所述测试条1410的引导。置于托盘下方的是加热装置1406，并且置于托盘上方与加热装置1406的位置一致的是光学系统1407，用于用激发光照亮插入的测试条且用于接受和处理发射光。壳体1402的上表面具有小孔或观察窗1408，通过其可观察来自光学系统1407的读出。托盘1404具有斜切角1405。
[0074]测试条1410包括防渗细长支持基底1411，其可以由热塑性树脂例如聚氯乙烯、聚丙烯等等形成，在其上安装由吸水材料例如硝酸纤维素或玻璃纤维形成的多孔膜1412，所述吸水材料能够通过毛细管作用、芯吸或简单湿润运输水溶液。测试条1410具有切角1413，其被构造成对应于阅读器1401中的托盘1404的斜切角1405。这个特点意图防止用户将测试条1410在错误方式上插入阅读器1401内，因为测试条1410仅在测试条如此定向时才可以完全插入，使得它的切角1413与托盘1404的斜切角1405协作。
[0075]在其具有切角1413的端部处，测试条具有芯吸垫1414，当流体如附图中所示的在从左到右的方向沿由多孔膜1412限定的流动路径经过时，所述芯吸垫1414充当用于积累流体的储库。芯吸垫1414可以是例如包含轻度交联的聚丙烯酸盐的吸着剂或超吸着剂材料，所述聚丙烯酸盐能够吸收其自身重量许多倍的水。在测试条1410的另一个端部处或附近，在多孔膜1412上存在样品施加区带1415，在其中施加怀疑含有目的分析物的样品。样品施加区带1415预装载有含有信号前体材料的胶囊，该胶囊在其表面上具有用于与待检测的分析物特异性结合的亲和分子。
[0076]在样品施加区带1415和芯吸垫1414之间是在其中固定捕获分子的测试区带1416，该捕获分子也具有与意图检测的分析物特异性结合的能力。依照本领域众所周知的方法，可以使用吸附、吸收或者离子或共价偶联将捕获分子固定在测试区带1416处。
[0077]测试区带1416的下游是对照区带1417，其包括非特异性捕获分子，即不与分析物特异性结合但能够与流动经过测试区带1416的游离胶囊结合的捕获分子。对照区带不是必需的，但作用于证实测试已正确操作，例如通过指示测试条已正确湿润并且溶液流动已沿测试条从样品施加区带1415经过测试区带1416。
[0078]尽管附图显示如沿流动路径连续设置的测试区带1416和对照区带1417，但测试和对照区带可以可替代地肩并肩或以其他特定关系设置。
[0079]芯吸垫1414的高吸着力促进液体沿测试条流动且确保溶液流经测试区带1416。
[0080]图15是沿图14中的线15' -15'截取的阅读器1401的示意性横截面视图，但在剖面中显示经由狭槽1403完全插入托盘1404内的测试条1410的侧面。为清楚起见，显示由托盘1404的上表面轻微升高的测试条1410。
[0081]如由这个侧视图上明确可见的，完全插入的测试条1410的测试区带1416和对照区带1417覆在加热装置1406上面，并且直接设置在光学系统1407下方。
[0082]现在将描述图14和15中举例说明的仪器的使用。
[0083]首先，将怀疑含有待检测的分析物的测试样品溶液施加于测试条1410的样品施加区带1415。已预装载在样品施加区带中的测试条上的胶囊在施加的样品溶液中吸收，并且通过胶囊表面上的亲和分子的中间阶段与存在的任何分析物相互作用。如先前所示，亲和分子与分析物特异性结合。
[0084]由芯吸垫1414的作用拉动，溶液如附图中所示的在从左到右的方向沿膜1412流动。溶液中夹带的是在分析物分子和附着至胶囊的亲和分子之间形成的复合物，以及不具有与之结合的分析物的游离胶囊。
[0085]当复合物经过固定在测试区带1416中的膜上的捕获分子时，它们通过分析物和捕获分子之间的相互作用从溶液中去除。不具有与之结合的分析物的游离胶囊继续在溶液流中，经过测试区带且流过对照区带。
[0086]缓冲洗涤溶液可以施加于测试区带1416上游的膜，以确保超出测试区带洗涤不具有与之结合的分析物的游离胶囊。
[0087]当对照区带1417显示测试已正确操作时，将平衡pH的处理溶液施加于测试区带上游的膜1412。
[0088]平衡pH的处理溶液可以在测试条1410插入阅读器1401内之前施加于膜1412。可替代地，平衡PH的处理溶液可以在测试条1410已插入阅读器1401内之后添加，在所述情况下将它施加于膜1412突出在阅读器1401外的部分(参见图15)。
[0089]与其中测试条1410插入阅读器1401内并且平衡pH的处理溶液施加于膜1412的次序无关，在加热装置1406致动以促使在加热装置的位置上方的处理溶液体积的温度中的增加前，允许足够的时间用于平衡PH的处理溶液流动到测试区带1416。因为仅小体积的溶液涉及此类测试，所以处理溶液的温度增加至升高的设定点值是非常快速的。
[0090]在胶囊内的信号前体的激活触发在加热步骤的数秒或几分之一秒内发生，并且个别信号生成分子从胶囊中释放。
[0091]接下来，致动光学系统1407。将例如来自LED的激发光导向测试区带上，以促使信号生成分子发荧光并且检测发出的荧光。检测的荧光读出可通过观察窗1408观察。
[0092]如上所述，仅涉及小体积的流体，因此装置1406无需是非常强力的。同样地，光学系统1407不具有大能量需求，因此阅读器1401可以通过在壳体1402内包括电池(未示出)而制成自包含的，以给加热装置1406和光学系统1407供电。可替代地，阅读器可以外部供电。
[0093]可替代仪器的例子
在上文描述的例子中，测试条1410预装载有胶囊，所述胶囊含有信号前体材料，并且在其表面上具有亲和分子用于与分析物特异性结合。当然，能够代替地在将测试溶液施加于样品施加区带1415前，将胶囊加入测试溶液的样品中。
[0094]参考图16至18，显示了用于执行横向流动测试的仪器的可替代形式，其中测试条掺入在可破裂储库中的测试中使用的溶液，并且其中阅读器具有致动器用于破裂储库以释放溶液。
[0095]图16是测试条1610的示意性平面图，所述测试条1610包括流体不透性屏障基底1611，其可以由热塑性树脂例如聚氯乙烯、聚丙烯等等形成。在基底1611上安装由吸水材料例如硝酸纤维素或玻璃纤维形成的窄条多孔膜1612。该多孔膜1612限定用于通过毛细管作用、芯吸或简单湿润运输水溶液的流体通路。
[0096]在如附图中所示的其右手端部处，测试条具有芯吸垫1614，当流体如附图中所示的在从左到右的方向沿由多孔膜1612限定的流动路径经过时，所述芯吸垫1614充当用于积累流体的储库。芯吸垫1614可以是例如能够吸收其自身重量许多倍的水的吸着剂或超吸着剂材料。
[0097]在测试条1610的另一个端部处，在其右手边缘处存在具有供给线1621的可破裂的缓冲载体溶液储库1620。在供给线1621紧下游，存在与多孔膜1612流体连通的样品施加区带1615，用于接受怀疑含有目的分析物的样品。样品施加区带1615预装载有含有信号前体材料的胶囊；该胶囊在其表面上具有用于与待检测的分析物特异性结合的亲和分子。
[0098]样品施加区带1615下游是第二条供给线1623，其将多孔膜1612连接至可破裂的封闭剂储库235。进一步下游是第三条供给线1625，其将多孔膜1612连接至可破裂的激活溶液储库1624。
[0099]在第三条供给线1625和芯吸垫1614之间是在其中固定捕获分子的测试区带1616，该捕获分子也具有与意图检测的分析物特异性结合的能力。依照众所周知的方法，可以使用吸附、吸收或者离子或共价偶联将捕获分子固定在测试区带1616处。
[0100]现在参考图17，此处显示了以示意性透视图的准备用于插入阅读仪器1601内的测试条1610，所述阅读仪器1601也以示意性透视图显示。阅读器1601包括壳体1602，所述壳体1602如附图中所示的在其左手端部处具有狭槽1603，用于接受测试条1610。狭槽导向在壳体1602的内部空间中提供的托盘1604，其充当在测试条1610插入阅读器内时所述测试条1610的引导。置于托盘下方的是加热装置1606，并且置于托盘上方与加热装置1606的位置一致的是光学系统1607，用于用激发光照亮插入的测试条且用于接受和处理发射光。壳体1602的上表面具有观察窗1608，通过其可观察来自光学系统1607的读出。
[0101]阅读器1601还具有致动器1632、1633和1638，其可从壳体上表面的外部操作，以分别破裂在测试条1610上的可破裂储库1620、1622和1624之一，如下文将更详细地描述的。致动器1632与在其上端处的按钮1631 —起提供，所述按钮1631突出穿过壳体1602的上表面。凹陷1630围绕按钮。类似地，致动器1635具有在其上端处的按钮1634，其由在壳体1602的上表面中形成的凹陷1633围绕。同样地，致动器1638具有在其上端处的按钮1637，其由在壳体1602的上表面中形成的凹陷1636围绕。
[0102]图18是沿图17中的线18' -18'截取的阅读器1601的示意性横截面视图，但在剖面中显示经由狭槽1603完全插入托盘1604内的测试条1610的侧面。为清楚起见，显示由托盘1604的上表面轻微升高的测试条1610。
[0103]如由这个侧视图上明确可见的，完全插入的测试条1610的测试区带1616覆在加热装置1606上面，并且直接设置在光学系统1607下方。另外，可见致动器1632设置在可破裂的缓冲载体溶液储库1620上方，致动器1635设置在可破裂的封闭剂储库1622上方，并且致动器1638设置在可破裂的激活溶液储库1624上方。
[0104]现在将描述图16和18中举例说明的仪器的使用。
[0105]首先，将测试条1610穿过狭槽1603插入阅读器1601内。随后，致动器1635通过将按钮1634向下按压，用于破裂可破裂的封闭剂储库1622。这释放封闭剂，其通常由PBS/BSA组成，并且它经由供应线1623流动到多孔膜1612。由芯吸垫1614的吸吮力拉动，封闭剂如附图中所示的在从左到右的方向沿多孔膜1612流动。封闭剂经过捕获分子固定在其中的测试区带1616。封闭剂预湿润和/或封闭未装载有捕获分子的反应位点。这确保此类反应位点被中和，使得它们不能与测试下的样品相互作用。
[0106]随后，测试条1610从反应器1601轻微缩回，以暴露其样品施加区带1615。随后将怀疑含有待检测的分析物的测试样品溶液施加于样品施加区带1615，并且将测试条再次完全插入阅读器1601内。已预装载在样品施加区带中的测试条上的胶囊在施加的样品溶液中吸收，并且通过胶囊表面上的亲和分子媒介与存在的任何分析物相互作用。如先前所示，亲和分子与分析物特异性结合。
[0107]由芯吸垫1614的作用拉动，溶液如附图中所示的在从左到右的方向沿膜1612流动。溶液中夹带的是在分析物分子和附着至胶囊的亲和分子之间形成的复合物，以及不具有与之结合的分析物的游离胶囊。[0108]接下来，致动器1632通过将按钮1631向下按压，用于破裂可破裂的缓冲载体溶液储库1620。这释放缓冲载体溶液，其经由供应线1621流动到多孔膜1612。由芯吸垫1614的吸吮力拉动，缓冲载体溶液如附图中所示的在从左到右的方向沿多孔膜1612流动，并且将在分析物分子和附着至胶囊的亲和分子之间形成的复合物，以及游离胶囊携带至测试区带。
[0109]当复合物经过固定在测试区带1616中的膜上的捕获分子时，它们通过分析物和捕获分子之间的相互作用从溶液中去除。缓冲载体溶液超出测试区带洗涤不具有与之结合的分析物的任何游离胶囊。
[0110]接下来，致动器1638通过将按钮1637向下按压，用于破裂激活溶液储库1624。激活溶液储库含有平衡PH的激活溶液。当储库1624破裂时，这释放平衡pH的激活溶液，其经由供应线1625流动到多孔膜1612。由芯吸垫1614的吸吮力拉动，平衡pH的激活溶液如附图中所示的在从左到右的方向沿多孔膜1612流动。
[0111]在加热装置1606打开以促使在加热装置的位置上方的激活溶液体积的温度中的增加前，允许足够的时间用于平衡PH的激活溶液流动到测试区带1616。因为仅小体积的溶液存在于加热装置1606上方的多孔膜1612中，所以激活溶液的温度增加至升高的设定点值是非常快速的。
[0112]在胶囊内的信号前体的激活触发在加热步骤的数秒或几分之一秒内发生，并且个别信号生成分子从胶囊中释放。
[0113]接下来，致动光学系统1607。将例如来自LED的激发光导向测试区带上，以促使信号生成分子发荧光并且检测发出的荧光。检测的荧光读出可通过观察窗1608观察。
[0114]在上述方法的变体中，如果测试条在分配到最终用户前用封闭溶液预处理，则可以省略使用封闭剂来封闭未装载有捕获分子的反应位点的步骤。在这些情况下，测试条无需包括可破裂的封闭剂储库，并且在测试条1610首先插入阅读器1601内之前，可以将测试样品溶液施加于样品施加区带1615。
[0115]加热器变体
多个类型的加热装置可以用于实现激活溶液的所需加热以触发激活，包括但不限于电阻、辐射、微波或感应加热装置。另一个例子是例如在上述实验中使用的珀耳帖装置，用于研究含信号前体胶囊在不同的PH和温度条件下的行为。还能够通过超声的施加来加热激活溶液。例如，激活溶液可以通过施加在20 - 60 kHz范围中的低频超声进行加热。可替代地，激活溶液可以通过施加在1- 8 MHz范围中的高频超声进行加热。
[0116]在触发激活后的胶囊行为和胶囊变体
触发激活的胶囊壁的结局看起来不影响买方测定的性能。在W002/12888 A2中，据报道胶囊崩解，但现在已实现胶囊行为的更好理解，并且已知某些类型的胶囊在信号前体已激活从封装中释放的信号生成分子后保持完整。
[0117]如果胶囊壁是表面活性剂，则装入胶囊的前体材料的水解导致通过水解的信号生成分子扩散出，与胶束等价的空表面活性剂胶囊，或胶囊由于表面活性剂的浓度低于临界胶束浓度而散开。
[0118]另一方面，如果胶囊壁是与聚合物偶联的表面活性剂，则胶囊可以保持完整。参见Caruso, F.Langmuir 2000，16，1485-1488。[0119]可以与本发明结合用于制备用于封装信号前体的胶囊的表面活性剂包括:
(i)阳离子型表面活性剂:
DSPE-PEG (2000)胺苯扎氯铵(DSPE-PEG(2000) Amine Benzalkonium chloride)、苄索氯铵、Bronidox、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基氯化铵、二甲基双十八烷基氯化铵、月桂基甲基葡糖醇聚醚-10羟丙基二甲基氯化铵、四甲基氢氧化铵。
[0120](ii)阴离子型表面活性剂:
月桂基硫酸铵、二辛基磺基琥珀酸钠、全氟丁基磺酸、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸、全氟辛酸、月桂基硫酸钾、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月桂基醚硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠、肉豆蘧醇聚醚硫酸钠、棕榈油酸钠、烷醇聚醚硫酸钠、硬脂酸钠、牛脂酸钠。
[0121](iii)两性离子型表面活性剂:
两亲化合物、CHAPS去污剂、椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、卵磷脂、月桂酰两性基乙酸钠。
[0122](iv)非离子型表面活性剂:
聚西托醇1000、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、椰油酰胺DEA、椰油酰胺MEA、癸基葡糖苷、月桂酸甘油酯、异鲸蜡醇聚醚-20、月桂基葡糖苷、窄范围的乙氧基化物、Nonidet P-40 (注册商标)、壬苯醇醚-9、壬苯醇醚、NP-40、聚辛乙二醇单十二烷基醚、辛基葡糖苷、油醇、戊乙二醇单十二烷基醚、泊洛沙姆、泊洛沙姆407、聚甘油聚蓖麻醇酯、聚山梨醇酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇三硬脂酸酯、硬脂醇、Triton X-100 (注册商标)。
[0123](V)极性不带电荷的分子:
固醇、碳水化合物等。
[0124]可以与本发明结合用于制备用于封装信号前体的胶囊的聚合物包括:
(Vi)碱性聚合物:
PAH聚(烯丙胺盐酸盐)，PVP (聚乙烯吡咯烷酮)，PEI (聚乙烯亚胺)，PEG (聚乙二醇)，聚赖氨酸，多肽包括组蛋白、核糖体蛋白、鱼精蛋白，
(vii)酸性聚合物:
PSS聚(4-苯乙烯磺酸钠)、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、核酸等。
[0125]胶囊还可以使用表面活性剂和聚合物的组合进行制备。
[0126]生物测定的其他变体
在前述中，已参考图1描述了生物测定程序，其中在第一个步骤中，将怀疑含有分析物10的测试样品在溶液中与含有信号前体材料30的胶囊20混合。当然充分理解这不一定必须是进行生物测定中的第一个步骤。现在将参考图19至22简要描述可替代程序。
[0127]图19是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行免疫测定的步骤顺序的简图。
[0128]使用包含固定在基底192上的特异性捕获抗体191的装置。固定在基底192上的捕获抗体191可以例如对应于在例如上文与图14至18结合描述的横向流动测试仪器中的测试区带中的固定捕获分子。捕获抗体191对于抗原195具有亲和力，并且能够与抗原195特异性结合，所述抗原195是在免疫测定中待检测的靶种类。
[0129]在第一个步骤中(未示出)，通过用在磷酸盐缓冲盐水中的牛血清白蛋白溶液(PBS/BSA)处理，使具有固定在其表面上的捕获抗体191的基底192预湿润和/或封闭，以确保在基底192上的任何反应位点被中和，使得它们不能与以后施加的抗原相互作用。未封闭的反应位点否则可能导致假读数。
[0130]在附图的左上方中所示的第二个步骤中，使怀疑含有抗原195的溶液在装置上流动。如果抗原存在，则其中至少一些将通过变得与捕获抗体191结合而被捕获。为简单起见，图19显示变得与单一捕获抗体191结合的单一抗原195。在实践中，装置的捕获区带将具有固定在基底192上的很多捕获抗体191，并且这些捕获抗体中的任何一种将能够与抗原195结合。由于抗体/抗原结合位点几何学的高特异性性质，捕获抗体191各自仅能够与单一抗原195结合。
[0131]在第三个步骤中，使胶囊193溶液在装置上流动，所述胶囊193含有信号前体30，并且在其表面上具有以抗体194形式的亲和分子。如同捕获抗体191，在胶囊193的表面上的抗体194对于抗原195具有亲和力，并且也能够与抗原195特异性结合。为了方便起见，在其表面上具有抗体194的胶囊被称为Ab偶联胶囊196。由于抗体194充当胶囊193的亲和分子，并且由于抗体194对于抗原195的亲和力，Ab偶联胶囊196变得与抗原195结合，所述抗原195已由捕获抗体191捕获。因此形成捕获的复合物197。
[0132]在第四个步骤中，洗涤具有其捕获的复合物197的装置，以去除任何未捕获的Ab偶联胶囊，并且随后将平衡PH的处理溶液施加于装置。在所需温育期后，将处理溶液加热以实现胶囊激活的触发。使信号前体30水解，并且以信号生成物质的个别分子80的形式从胶囊中释放。
[0133]在最后一个步骤中(未示出)，用激发光照射信号生成分子80，并且检测且测量发射光(生成的信号)。
[0134]图20是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行免疫测定的另一个可替代方案的部分的简图。
[0135]在这个可替代方案中，使用标记的检测抗体207，其与固定在检测装置的基底202上的捕获抗体201结合。通过使用能够与捕获抗体201结合的合适标记(在附图中由下标L指示)，相同的捕获抗体201可以用于许多不同测定，因为测定特异性来源于检测抗体207。
[0136]在第一个步骤中(未示出)，通过用在磷酸盐缓冲盐水中的牛血清白蛋白溶液(PBS/BSA)处理，使具有固定在其表面上的捕获抗体201的基底202预湿润和/或封闭，以确保在基底202上的任何反应位点被中和，使得它们不能与以后施加的抗原相互作用。未封闭的反应位点否则可能导致假读数。
[0137]在第二个步骤中，将怀疑含有抗原205的溶液与Ab偶联胶囊206和标记的检测抗体207预混合。Ab偶联胶囊206由胶囊203形成，所述胶囊203含有信号前体30，具有在其表面上的以抗体204形式的亲和分子。抗体能够与抗原205结合。同样地，标记的可检测抗体207也能够与抗原205结合。当抗原205存在时，这个预混合步骤导致夹心复合物208的形成。抗原205在Ab偶联胶囊206的抗体204之一和标记的检测抗体207之一之间变得“夹心”。
[0138]在下一个步骤中，使夹心复合物208的预混合溶液在装置上流动。由于标记的检测抗体207的标记L对于固定的捕获抗体201的亲和力，夹心复合物208作为捕获复合物209变得被捕获。
[0139]在第四个步骤中，洗涤具有其捕获的复合物209的装置，以去除任何未捕获的夹心复合物208。在洗涤后，将平衡pH的激活溶液施加于装置，并且随后在所需温育期后，将激活溶液加热以实现胶囊激活的触发。使信号前体30水解，并且以信号生成物质的个别分子80的形式从胶囊中释放。
[0140]在最后一个步骤中(未示出)，用激发光照射信号生成分子80，并且检测且测量发射光(生成的信号)。
[0141]在图20中所述的方案具有下述要求。首先，将捕获抗体201固定在基底202上。这可以通过化学偶联或可替代地通过允许捕获抗体变得直接吸附在塑料基底例如聚苯乙烯上来完成。其次，胶囊203必须与作为亲和分子的抗体204偶联，所述抗体204能够与待检测的靶结合。第三，需要对于标记“L”特异性的抗体，其也必须能够与待检测的靶结合。标记“L”可以是任何通常可用的针对抗体的缀合物，例如DNP、地高辛或多种染料。
[0142]图21是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行杂交测定的另外一个可替代方案的部分的简图。在这个方案中，检测装置具有固定在基底212上的核酸片段(寡核苷酸)211。核酸片段211以和上文与图19和20结合描述的捕获抗体191和201大致相同的方式起作用，可以视为在例如上文与图14至18结合描述的横向流动测试装置的捕获区带中的捕获分子的例子。
[0143]在第一个步骤中(未示出)，通过用在磷酸盐缓冲盐水中的牛血清白蛋白溶液(PBS/BSA)处理，使具有固定在其表面上的寡核苷酸211的基底212预湿润和/或封闭，以确保在基底212上的任何反应位点被中和，使得它们不能与以后施加的含有互补核酸序列的靶溶液相互作用，因为未封闭的反应位点可能是假读数的原因。
[0144]在分开的步骤中，制备含有信号前体的胶囊213的溶液，所述胶囊213缀合至待检测的寡核苷酸214。为了方便起见，缀合至寡核苷酸的胶囊被称为核酸复合物216。
[0145]下一个步骤显示于附图中；使核酸复合物216的溶液在装置上流动。通过两种互补寡核苷酸211和214的杂交，具有寡核苷酸214 (其与在基底212上的固定寡核苷酸211互补)的这些复合物216将变得被捕获，因此形成捕获的复合物215。洗涤具有其捕获的复合物215的装置，以去除任何未捕获的核酸复合物216。
[0146]在附图中所示的第二个步骤中，将平衡pH的激活溶液施加于装置，并且随后在所需温育期后，将激活溶液加热以实现胶囊激活的触发。使信号前体30水解，并且以信号生成物质的个别分子80的形式从胶囊中释放。
[0147]在最后一个步骤中(未示出)，用激发光照射信号生成分子80，并且检测且测量发射光(生成的信号)。
[0148]在图21中所述的杂交方案具有下述要求。首先，将寡核苷酸211固定在基底212上。这要求一些形式的化学偶联和方向性控制，使得5' -3'方向对于每种固定的寡核苷酸是相同的，并且是从寡核苷酸214如何固定在胶囊213上的相反方向。其次，将寡核苷酸214缀合至胶囊213，再次具有控制的方向性。第三，寡核苷酸211必须对于待检测的寡核苷酸214具有互补性。
[0149]图22是显示关于使用含有信号前体的胶囊执行杂交测定的另一个方案的部分的简图。
[0150]在这个方案中，检测装置具有固定在基底222上的第一种核酸片段(寡核苷酸)221，与图21中所述的杂交方案中使用的装置大致相同。因此，寡核苷酸221可以视为在例如上文与图14至18结合描述的横向流动测试装置的测试区带中使用的捕获分子的例子。
[0151]如之前，通过用PBS/BSA处理，使包含固定在基底222上的第一种寡核苷酸221的检测装置预湿润和/或封闭，以确保在基底222上的任何反应位点被中和，以消除假读数。
[0152]在附图中所示的第一个步骤中，制备含有信号前体的胶囊223的溶液，所述胶囊223缀合至待检测的寡核苷酸224。对于其加入(to this is handed)含有第三种核酸片段(寡核苷酸)的溶液，所述第三种核酸片段在此处被称为“桥接”寡核苷酸227。桥接寡核苷酸227与缀合至胶囊223的寡核苷酸224杂交，形成具有尾部228的桥接寡核苷酸复合物226，所述尾部228能够进一步杂交。
[0153]在下一个步骤中，使桥接寡核苷酸复合物226的溶液在装置上流动。复合物226的尾部228与在基底222上的固定寡核苷酸221互补，并且因此发生进一步的杂交，并且复合物226通过这种进一步杂交变得在装置上被捕获，形成捕获的复合物215。洗涤具有其捕获的复合物225的装置，以去除任何未捕获的核酸复合物226。
[0154]在下一个步骤中，将平衡pH的激活溶液施加于装置，并且随后在所需温育期后，将激活溶液加热以实现胶囊激活的触发。使信号前体30水解，并且以信号生成物质的个别分子80的形式从胶囊中释放。
[0155]在最后一个步骤中(未示出)，用激发光照射信号生成分子80，并且检测且测量发射光(生成的信号)。
[0156]在图22中所述的杂交方案具有下述要求。首先，寡核苷酸221必须固定在基底222上。这要求一些形式的化学偶联和方向性控制，使得5' -3'方向对于每种固定的寡核苷酸是相同的，并且与缀合至胶囊223的寡核苷酸224的5' -3'方向相同。其次，寡核苷酸224必须缀合至胶囊223，再次具有控制的方向性。第三，寡核苷酸221必须对于桥接寡核苷酸227具有互补性，所述桥接寡核苷酸227自身必须对于待检测的寡核苷酸224具有互补性。
[0157]用于在胶囊上使用的不同亲和分子类型的例子及其缀合方法 根据待检测的靶分子，亲和分子必须是选自下述材料组的生物识别分子:
(a)选自下述的肽或蛋白质:抗体、遗传修饰的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、受体、抗原、凝集素、抗生物素蛋白、寡肽、脂蛋白、糖蛋白、肽激素和变应原或其部分；
(b)选自下述的核酸:DNA、RNA、寡核苷酸、适体及其部分；
(c)选自下述的碳水化合物:单糖、寡糖和多糖，糖脂，蛋白聚糖及其部分；或
(d)选自下述的低分子量配体:生物素、生物素衍生物、固醇、激素、辅因子、激活物、抑制剂、药物、变应原或半抗原。
[0158]亲和分子可以例如通过范德华力、氢键或静电相互作用与胶囊的外表面缀合，或者它们可以直接或经由接头分子与胶囊的外表面共价结合。接头分子通常为生物分子，优选抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、凝集素或低分子交联剂。
[0159]尽管本发明已在上文参考具体实施方案和例子进行描述，但这些是非限制性的，并且本领域技术人员应当理解其他变化和修饰是可能的，而不背离如由下述权利要求限定的本发明的范围。
【权利要求】
1.一种使用含有信号前体的胶囊控制生物测定中的信号生成开始的方法，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式，所述胶囊在其外表面上具有亲和分子，用于特异性识别且结合待测定的样品中的任何靶分子，以允许形成IE -胶囊复合物，所述方法包括: (i )用溶液处理所述胶囊，所述溶液的温度使得基本上不发生所述信号前体的水解，并且所述溶液的PH是这样平衡的，使得: (a)所述pH太高而使所述信号前体不能在环境温度下经历显著的酸催化的水解，但在所述PH下所述信号前体在升高的温度下经历显著水解； 或.(b)所述pH太低而使所述信号前体不能在环境温度下经历显著的碱催化的水解，但在所述PH下所述信号前体在升高的温度下经历显著水解； 和 (?)随后加热所述处理溶液中的胶囊，以引起所述信号前体开始水解为其中能够生成可检测信号的形式。
2.根据权利要求1的方法，其中所述平衡PH通过下述进行预测定: Ca)将含有所述信号前体的一份所述胶囊加入一系列不同pH的环境温度溶液中； (b)用激发光照射所述系列的环境温度溶液； (c)拒绝在环境温度 下发出强烈信号的溶液； Cd)加热在环境温度下基本上不发出信号的溶液； Ce)拒绝在加热后基本上不发出信号的溶液，和 Cf)将在加热后发出强烈信号的一种或多种溶液的PH值注明为限定所述平衡pH。
3.一种执行生物测定用于检测样品中的一种或多种靶分子的方法，所述方法包括: (i)将多种捕获分子附着在基底上，所述捕获分子对于所述靶分子具有亲和力； (ii)使在溶液中的所述样品与含有信号前体的胶囊混合，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式，所述胶囊在其外表面上携带亲和分子，用于特异性识别且结合所述样品中的任何靶分子，以使得能够形成靶-胶囊复合物； (iii)使所述溶液与在所述基底上的捕获分子接触，并且允许任何靶-胶囊复合物与所述捕获分子结合； (iv)使未与靶分子复合的胶囊和与所述捕获分子结合的任何靶-胶囊复合物分离； (V)用处理溶液处理与所述捕获分子结合的任何靶-胶囊复合物，所述处理溶液的温度和PH依照权利要求1的步骤(i)进行平衡； (vi)依照权利要求1的步骤(ii)，加热与所述平衡pH的处理溶液中的所述捕获分子结合的任何靶-胶囊复合物； (vii)在所述基底上的捕获分子附近，用激发光照射所述平衡pH的处理溶液，和 (viii)检测任何生成的信号。
4.根据任何前述权利要求的方法，其中加热所述处理溶液中的胶囊的所述步骤包括将所述处理溶液加热至在40°C - 75°C的范围中的温度。
5.根据权利要求1- 3中任一项的方法，其中加热所述处理溶液中的胶囊的所述步骤包括将所述处理溶液加热至在45°C - 65°C的范围中的温度。
6.根据任何前述权利要求的方法，其中加热所述处理溶液中的胶囊的所述步骤包括使用选自下述的加热装置加热所述处理溶液:电阻加热装置、辐射加热装置、微波加热装置、感应加热装置和珀耳帖装置。
7.根据权利要求1- 5中任一项的方法，其中加热所述处理溶液中的胶囊的所述步骤包括通过超声加热。
8.根据权利要求7的方法，其中所述超声是在20- 60 kHz范围中的低频超声。
9.根据权利要求7的方法，其中所述超声是在1- 8 MHz范围中的高频超声。
10.根据任何前述权利要求的方法，其中在所述处理溶液加入所述胶囊后100秒至500秒的间隔后，进行加热所述处理溶液中的胶囊的所述步骤。
11.根据任何前述权利要求的方法，其中包含在所述胶囊中的所述信号生成物质是有机材料。
12.根据任何前述权利要求的方法，其中所述胶囊含有IO7-1O9个所述信号前体分子/月父囊。
13.根据任何前述权利要求的方法，其中所述信号前体选自可水解的荧光团、可水解的发光体、可水解的生色团、可水解的生物发光蛋白质和可水解的荧光蛋白质。
14.根据权利要求13的方法，其中所述信号前体是可水解的荧光团。
15.根据权利要求13的方法，其中所述信号前体是荧光素二乙酸酯。
16.一种执行生物测定的方法，其包括激活含有信号前体的胶囊，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式，所述激活包括用热和用酸或碱催化溶液处理所述胶囊，所述热和所述催化溶液的PH的组合是这样的，以便将所述前体水解为其中能够生成可检测信号的形式。
17.根据权利要求16的方法，其中所述激活进一步包括使所述胶囊暴露于激发辐射。
18.一种用于检测来自生物测定装置的信号输出量的仪器，所述生物测定装置使用在其外表面上具有亲和分子的胶囊，用于特异性识别且结合待测定的样品中的任何靶分子，以允许形成靶-胶囊复合物，所述胶囊含有信号前体，所述信号前体可从其中基本上不生成信号的潜伏形式水解为其中能够生成可检测信号的形式，所述仪器包括: 用于照亮反应区带的光源，在所述反应区带中所述胶囊可通过用热和用酸或碱催化溶液处理所述胶囊激活，所述热和所述催化溶液的PH的组合是这样的，以便将所述前体水解为其中能够生成可检测信号的形式，和 用于将所述反应区带中的溶液加热至在其下信号前体经历水解的温度的加热装置。
19.根据权利要求18的仪器，其进一步包括用于检测由所述生物测定装置发出的光的光学检测器。
20.根据权利要求18或权利要求19的仪器，其中所述加热装置能够将所述溶液加热至在40°C _75°C的范围中的温度。
21.根据权利要求18或权利要求19的仪器，其中所述加热装置能够将所述溶液加热至在45°C - 70°C的范围中的温度。
22.根据权利要求18- 21中任一项的仪器，其中所述加热装置选自电阻加热装置、辐射加热装置、微波加热装置、感应加热装置和珀耳帖装置。
23.根据权利要求18- 21中任一项的仪器，其中所述加热装置是能够对所述处理溶液实施在20 - 60 kHz范围中的低频超声的超声波发生器。
24.根据权利要求18- 21中任一项的仪器，其中所述加热装置是能够对所述处理溶液实施在1- 8 MHz范围中的高频超声的超声波发生器。
25.根据权利要求18- 24中任一项的仪器，其中所述反应区带在基底上形成流体流动通道的部分。
26.根据权利要求18- 24中任一项的仪器，其中所述反应区带在横向流动测试装置中的流体可透膜上。
27.一种控制根据权利要求1的生物测定中的信号生成开始的方法,并且基本上如本文参考图1、19、20、21或22中的任何一个所述。
28.—种执行根据权利要求3的生物测定的方法，并且基本上如本文参考图1、19、20、21或22中的任何一个所述。
29.—种执行根据权利要求16的生物测定的方法，并且基本上如本文参考图1、19、20、21或22中的任何一个所述。
30.一种用于检测来自根据权利要求18的生物测定装置的信号输出量的仪器，并且基本上如本文参考图 14至18中的任何一个所述。
【文档编号】G01N33/58GK104024855SQ201280051866
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年8月30日 优先权日:2011年8月30日
【发明者】N.J.康普贝尔, K.E.莫拉维克, J.D.彭尼曼, B.J.理查森 申请人:超新星诊断公司