改进的疫苗诊断的制作方法

改进的疫苗诊断的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于区分(a)施用嵌合瘟病毒的动物与(b)被野生型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染或用常规BVDV疫苗免疫接种的动物的改进的方法和试剂盒。
【专利说明】改进的疫苗诊断
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于区分(a)施用嵌合瘟病毒的动物与(b)被野生型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染或用常规BVDV疫苗接种的动物的改进的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]已经从若干驯养及野生动物种类中分离出包括牛病毒性腹泻病毒(BVD病毒或BVDV)在内的瘟病毒(pestiviruses)。所鉴定的BVDV的宿主包括野牛、羚羊、驯鹿和各种鹿类，同时已经在长颈鹿和叉角羚中鉴定出独特的瘟病毒种属。BVDV是黄病毒科的小RNA病毒。其与作为绵羊的边界病以及猪的经典猪霍乱的病原体密切相关。
[0003]特别是在牛中由BVDV引发的疾病广泛散布而且经济上能够是破坏性的。牛中的BVDV感染可导致繁殖问题，并且能够引发流产或早产。BVDV能够透过怀孕的牛的胎盘，并可导致分娩出持续感染(PI)的小牛，其对病毒免疫耐受而且余生持续患病毒血症。感染的牛还可表现出“粘膜病”，其特征是温度升高、腹泻、咳嗽和营养粘膜溃疡。这些持续感染的动物在兽群中提供了病毒散布源以及粘膜病的进一步爆发，并且非常易于诱发造成肠道疾病或肺炎的微生物的感染。
[0004]目前可用的BVDV疫苗是含化学灭活的野生型病毒的那些疫苗，或者含修饰性活(ML)BVDV的那些疫苗。BVDV可通过在牛或猪细胞中反复传代或者通过在病毒上提供温度敏感型表型的化学诱导的突变来减弱。然而，现有的灭活和ML疫苗不允许在已接种动物和自然感染的动物之间进行区分。
[0005]可能含有野生型病毒中不存在的其他抗原决定子或者缺乏野生型病毒中存在的抗原决定子的“标记”疫苗可以是用于控制该领域中的BVDV感染的有效工具。美国专利申请2010/0360055 (Luo等，通过参考以其整体并入本文)描述了后者，即一种基于嵌合瘟病毒疫苗的疫苗，其中BVDV的Ems蛋白质被来自叉角羚瘟病毒的Ems蛋白质置换。该嵌合瘟病毒以UC25548保藏于AlXXT ,并赋予ATCCi保藏号PTA-9939。借助适当的诊断测定，利用该嵌合瘟病毒将允许区分施用该病毒的动物与感染野生型BVDV或接种常规BVDV疫苗的动物。

【发明内容】

[0006]在一个实施方式中，提供了一种用于测定动物是否暴露于BVDV或用常规BVDV疫苗免疫接种的方法，其中所述感染了 BVDV或免疫接种了常规BVDV疫苗的动物具有特异性结合存在于BVDV中但是不存在于嵌合痕病毒中的至少一个Ems表位的抗体,该嵌合痕病毒不再表达来自BVDV的Ems蛋白质，但在BVDV中表达叉角羚瘟病毒的Ems蛋白质。
[0007]在一个实施方式中，提供了 一种用于测定特异性结合BVDV Erns蛋白质的抗体存在与否的方法，所述方法包括下述步骤:
[0008]a)从动物获得血清样品；
[0009]b)用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述片段；[0010]c)检测所述样品中所述抗体的存在与否。
[0011]在另一实施方式中，提供了用于测定动物是否暴露于BVDV或用常规BVDV疫苗免疫接种的诊断试剂盒，所述试剂盒包括能够检测存在于BVDV中但不存在于嵌合瘟病毒中的至少一个Ems表位的抗体的试剂，所述嵌合瘟病毒不再表达来自BVDV的Ems蛋白质，但在BVDV中表达叉角羚瘟病毒的Ems蛋白质。
[0012]在进一步的实施方式中，提供了抗体的用途，所述抗体结合BVDV或常规BVDV疫苗中存在的表位，但是该表位在嵌合瘟病毒中不存在，所述嵌合瘟病毒不再表达来自BVDV的Erns蛋白质，但在BVDV中表达叉角羚瘟病毒的Ems蛋白质。
[0013]在另一实施方式中，提供了一种用于测定动物是否具有特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体的方法，所述方法包括下述步骤:
[0014]a)从动物获得血清样品；
[0015]b)用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述片段；
[0016]c)检测所述动物中所述抗体的存在与否。
[0017]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述样品的步骤在检测所述样品中所述抗体存在与否的步骤之前进行。
[0018]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述样品的步骤与检测所述样品中所述抗体存在与否的步骤同时进行。
[0019]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中所述抗体特异性结合在BVDV Erns蛋白质中存在但是在叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在的至少一个表位。
[0020]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中所述抗体的存在说明所述动物已经被BVDV感染或者已经用常规BVDV疫苗免疫接种。
[0021]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中所述抗体的缺乏说明a)所述动物还未被I)BVDV感染，或者2)未用常规BVDV疫苗免疫接种，或者b)所述动物已经用表达叉角羚瘟病毒Ems蛋白质的嵌合瘟病毒免疫接种。
[0022]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中血清样品得自易受BVDV感染的动物。
[0023]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中所述血清样品得自为牛类、羊类、山羊类或猪类的动物。
[0024]在另一实施方式中，提供了一种用于测定特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，其中血清样品得自为牛的动物。
[0025]在另一实施方式中，提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒用于测定特异性结合BVDVEms蛋白质的抗体存在与否，其中所述试剂盒包括促进对叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在的至少一个BVDV Ems表位的抗体的存在与否进行检测的试剂，其中所述试剂之一是叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段。[0026]在另一实施方式中，提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒用于测定特异性结合BVDVEms蛋白质的抗体存在与否，其中所述试剂盒包括促进对叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在的至少一个BVDV Erns表位的抗体的存在与否进行检测的试剂，其中所述试剂之一是特异性结合BVDV或常规BVDV疫苗中存在的表位的抗体，但是该表位在叉角羚瘟病毒Ems蛋白质不存在。
[0027]在另一实施方式中，提供一种诊断试剂盒，所述试剂盒用于测定特异性结合BVDVErns蛋白质的抗体存在与否，其中所述试剂盒包括用于实施选自下述的测定的试剂:酶联免疫吸附测定法(ELISA)、横向流动测定、免疫印记法、PCR、放射免疫测定、固相放射免疫测定、电化发光测定、免疫印记、免疫沉淀作用和免疫染色。
[0028]在另一实施方式中，本发明提供了一种测定动物是否具有特异性结合BVDV Ems蛋白质的抗体的方法，其中所述抗体特异性结合存在于BVDV Erns蛋白质中的表位，但是该表位在叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在。
[0029]发明详述
[0030] 下述定义可用于本发明实施方式描述中所用的术语。下述定义代替通过参考并入本文中的各单独参考文件中所涵盖的任何相反定义。
[0031]除非本文中另外定义，与本发明有关使用的科技术语应具有本领域技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，单数形式将包括复数且复数形式将包括单数。
[0032]“约”或“近似”在结合可测量的数值变量使用时，是指所述的该变量的值在所述值的试验误差内(例如，在平均值的95%置信区间内)或者在所述值的任何一个较大值的10%内。
[0033]如本文所用，术语“动物”意欲包括易受BVDV感染的任何动物，其包括但不限于驯养和野生的牛、绵羊、山羊和猪类。
[0034]如本文所用，术语“抗体(“antibody”或“antibodies”)”是指能够通过表位识别与抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是具有“恒定区”和“可变区”的“轻”和“重”多肽链构成的血清蛋白质，并且可基于恒定区的组成进行分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对给定抗原具有“特异性”的抗体表示该抗体的可变区排外地识别并结合特异性抗原。抗体可以是多克隆混合物或单克隆。抗体可以是源自天然来源或原子重组来源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以多种形式存在，包括例如？^^&13’、？妯’)2，以及以单链存在。抗体可以转化为抗原结合蛋白质，其包括但不限于抗体片段。
[0035]如本文所用，术语“抗原”是指含有一个或多个在暴露于对象之后将诱导对该抗原具有特异性的免疫反应的表位(线型、构象，或二者)的分子。术语“抗原”可指减弱的、灭活的或修改的活细菌、病毒、真菌、寄生虫或其他微生物。如本文所用，术语“抗原”还可以指亚单位抗原，其与整体微生物分离，本质上该抗原与该整体微生物相结合。术语“抗原”还可以指抗体，诸如抗个体基因型抗体或其片段，以及可以指能够模拟抗原或抗原决定子(表位)的合成肽模拟位。术语“抗原”还可以指体内表达抗原或抗原决定子的寡核苷酸或多核苷酸，诸如在DNA免疫接种应用中。
[0036]“缓冲液”指防止另一化学物质浓度变化的化学体系，例如，质子供体和受体体系用作防止氢离子浓度(PH)显著变化的缓冲液。缓冲液的另一实例是含弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。
[0037]术语“BVDV”、“BVDV分离物”或“BVDV菌株”是指牛病毒性腹泻病毒，包括但不限于I型和II型，其由病毒基因组、缔合蛋白质和其他化学成分(诸如脂质)组成。很多I型和II型牛病毒性腹泻病毒是本领域技术人员已知的而且通过例如美国典型菌种收藏所(ATCCX: Manassas, VA20108USA)可得。所述牛病毒性腹泻病毒具有RNA形式的基因组。RNA能够反转录到DNA中用于克隆。因此，本文中对核酸和牛病毒性腹泻病毒序列的提交包括病毒RNA序列和源自病毒RNA序列的DNA序列二者。如本文所用，术语“NADL”是指BVDV的参照株，以VR-534保藏于ATCC。
[0038]如本文所用，术语“细胞系”或“宿主细胞”是指其中病毒可以复制或被保持的原核或真核细胞。
[0039]“细胞免疫反应”或“细胞介导的免疫反应”是通过T-淋巴细胞或其他白细胞或两种介导的反应，并且包括产生细胞因子、化学增活素以及通过活化T-细胞、白细胞或二者而产生的类似分子。
[0040]如本文所用，术语“嵌合的”或“嵌合体”是指微生物，例如病毒，其含有源自超过一种祖先的遗传或物理组分。
[0041 ] 如本文所用，术语“常规BVDV疫苗”是指基于野生型BVDV的疫苗。病毒可以被减弱或灭活。然而，该病毒不是遗传修饰的。
[0042]如本文所用，术语“培养物”是指不存在其他属或类型下生长的细胞或微生物种群。
[0043]如本文所用，术语“DIVA”是指区分感染动物与已接种动物。
[0044]“剂量”是指给予对象的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“引发剂量”是指在第O日给予的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“年剂量”是指在第一剂量之后给予的此类组合物的量，其可以是或者可以不是与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
[0045]如本文所用，术语“表位”是指与T-细胞受体或特异性抗体结合的抗原特异性位点，其通常包括约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基，而且其可以是连续的或不连续的。
[0046]“片段”是指蛋白质或基因的截短部分。“功能片段”和“生物活性片段”是指保留了全长蛋白质或基因的生物性学特性的片段。“免疫原性活性片段”是指引发免疫反应的片段。
[0047]如本文所用，术语“异源的”是指源自不同属或菌株。
[0048]如本文所用，术语“同源的”是指源自相同属或菌株。
[0049]“体液免疫反应”是指至少部分由抗体介导的反应。
[0050]对象中的“免疫反应”是指对抗原发展的体液免疫反应、细胞免疫反应或体液与细胞免疫反应。免疫原性反应对诊断木器或其他试验可以是足够的，或者可以适当地预防疾病症状或体征，包括病原感染引发的不良健康影响或其并发症。
[0051]“免疫原性的”或“免疫原性是指引出特异性指向抗原的免疫反应的能力。
[0052]如本文所用，术语“免疫原性组合物“是指能够被免疫系统识别的组合物，当单独或与药学上可接受的载体一起施用于动物时，其导致产生特异性免疫反应(即，具有免疫原性活性)。
[0053]如本文所用，术语“免疫有效量“是指在动物中有效诱导免疫原性或免疫反应的抗原的量。免疫反应可包括而不限于细胞和/或体液免疫的诱导。
[0054]如本文所用，“分离的“是指从其天然存在的环境中移除。当指微生物时，其可以是单独的或者可以在异源宿主细胞或者染色体或载体中(例如，质粒、噬菌体等)。”分离的细菌“、”分离的厌氧菌“、”分离的细菌菌株“、”分离的病毒“、”分离的病毒株“等是指其中细菌或病毒基本不含其他微生物的组合物，例如，在培养物中，诸如当从其天然存在的环境中分离时。“分离的”当用于描述任何特别定义的物质(诸如多核苷酸或多肽)时，是指与诸如多肽或核酸的物质正常出现的原始细胞环境分离的物质。因此，如本文所用，仅举例而言，用本发明的多核苷酸构建的重组细胞系利用“分离的”核酸。或者，如果特定蛋白质或特异性免疫原性片段被要求保护或被用作疫苗或其他组合物，则会考虑将其分离，原因是与其如何存在于自然界相比，其已经被鉴定、分离而且在一定程度上被纯化。如果蛋白质或其特异性免疫原性片段在产生抗原的重组细菌或真核表达载体中产生，则考虑使其作为分离的蛋白质或核酸存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系利用了“分离的”核酸。
[0055]如本文所用，术语“感染复数”(multiplicity of infection, MOI)是指每个细胞的微生物的数量比例，其详述了多少接种物要用在特定感染中。
[0056]如本文所用，术语“病原体”或“病原菌”是指能够在其宿主动物中诱导或引发疾病、病症或异常状态的微生物，例如病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫。
[0057]如本文所用，术语“瘟病毒(瘟病毒属，pestivirus)”是指来自黄病毒科家族的瘟病毒的RNA病毒。瘟病毒包括但不限于BVDV (I型和2型)、经典猪瘟病毒(CSFV)和边界病病毒(BDV)，以及分离自诸如下述种类的瘟病毒:野猪、野牛、大羚羊、北美野牛、羊马它、普度鹿、玲羊、各种鹿类、长颈鹿、驯鹿、岩玲羊和叉角玲(Vilcek and Nettleton ；VetMicrobiol.116:1-12(2006))。
[0058]“药学上可接受的”是指这样的物质，其在合理医学判断范围内，适合用于接触动物的组织而没有异常毒性、刺激、变态反应等，与合理的益处风险比相当，以及对其预期用途有效。
[0059]术语“防止(“prevent”、“preventing”或“prevention”)”等是指抑制微生物的复制，抑制微生物的传播，或抑制微生物在其宿主中建立自身。如本文使用的这些术语和类似术语还可指抑制或阻断一种或多种感染的症状或体征。
[0060]如本文关于疫苗或其他组合物而使用的术语“保护("Protection"、"protecting",) ”等指该疫苗或组合物预防或减少由衍生出该疫苗或组合物中所用的抗原的生物体引发的疾病症状。术语“保护”和类似术语还指该疫苗或组合物可用于治疗性坠落疾病或者已经存在于对象中的一种或多种疾病症状。
[0061]如本文所用的术语“特异性结合(“specificbinding”、“specifically binds”)”及类似术语被定义为两种或多种分子，其形成在生理或测定条件下可测量且为选择性的复合物。抗体或其他抑制剂可以称为“特异性结合”蛋白质，如果在适当选择的条件下，此种结合基本不被抑制，而同时非特异性基本被抑制的话。特异性结合的特征在于对化合物或蛋白质的高度亲和性和选择性。非特异性结合通常具有的亲和性。在IgG抗体中的结合例如通常特征在于至少约10_7M或更高的亲和性，诸如至少约10_8M或更高，或至少约10_9M或更高，或至少约10,或更高，或至少约10_nM或更高，或至少约10_12M或更高。该术语还可适用例如抗原结合域对未被很多抗原携带的特定表位具有特异性的情况，在该情况，携带抗原-结合域的抗体通常将不结合其他抗原。
[0062]如本文所用，术语“治疗有效量“是指微生物或亚单位抗原或多肽或多核苷酸分子及其组合、或者疫苗或组合物治疗其所施用的对象中的疾病所需的量。
[0063]如本文所用，术语“治疗(“treat”、〃treating〃或“treatment”)”等是指减少或消除微生物的感染。如本文使用的这些术语及类似术语还可指降低微生物的复制、降低微生物的传播或者降低微生物在其素质中建立自身的能力。如本文使用的这些术语及类似术语还可指减少、改善或消除微生物感染的一种或多种症状或体征，或者加速从微生物感染中的恢复。
[0064]如本文所用，术语“免疫接种(“vaccinate”和“vaccinating”)“等是指向动物施用疫苗或免疫原性组合物。
[0065]如本文所用，术语“疫苗”和“疫苗组合物”是指预防或降低感染，或者预防或减少一种或多种感染症状或体征的组合物。通常通过在对象中诱导免疫反应(细胞介导的免疫反应或体液免疫反应，或者二者的组合)来实现疫苗组合物对病原体的预防作用。通常而言，消除或降低感染发生率，减轻症状或体征，或从感染对象中加速消除微生物均代表疫苗组合物的预防作用。本发明的疫苗组合物对由BVDV引起的感染具有预防作用。
[0066]如本文所用，术语“兽医可接受的载体“是指这样的物质，其在合理医学判断范围内，适合用于接触动物的组织而没有异常毒性、刺激、变态反应等，与合理的益处风险比相当，以及对其预期用途有效。
[0067]提供下述描述来帮助本领域技术人员实践本发明。即便如此，该描述不应解释为不恰当地限制本发明，因为本领域技术人员可对本文讨论的实施方式进行修改和变更而不背离本发明的精神或范围。
[0068]检测、诊断方法、试剂盒
[0069]本发明提供了测定动物是否已经通过感染或接种而暴露于特定的瘟病毒的方法。
[0070]利用DIVA疫苗(其允许区分感染动物与接种动物)的接种提供了一种用于评价受试动物暴露史的手段。这种分化可通过多种诊断方法完成，所述诊断方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)(其可以是竞争性的、直接的或间接的)、横向流动测定(lateral flow assay)、免疫印记法、PCR、放射免疫测定、固相放射免疫测定、电化发光(ECL)测定、免疫印记、免疫沉淀作用和免疫染色。这些和其他方法是本领域技术人员容易公认和已知的。
[0071]本文所述的嵌合瘟病毒能够在其基因组组成和所表达蛋白质两者上与野生型BVDV菌株区分开来。这种不同可允许区分接种动物与感染动物。例如，可对下述方面进行测定:在某些实验室试验中对BVDV测试呈阳性的动物是否携带野生型BVDV菌株或已经免疫接种常规BVDV疫苗，或者是否其已经施用了嵌合瘟病毒还是未被感染。
[0072]多种测定法可用于进行该测定。例如，可从对感染测试呈阳性的动物中分离病毒。基于核酸的测定可包括但不限于DNA斑迹法或or北方吸印技术、PCR和序列测定。或者，可以采用基于蛋白质的测定。在基于蛋白质的测定中，可从对BVDV测试呈阳性的动物分离出疑似感染的细胞或组织。可从此类细胞或组织中制得细胞提取物并使其经受例如蛋白质斑迹法，利用抗病毒蛋白质的适宜抗体，该抗体能够区分鉴定先前施用于疫苗中的嵌合瘟病毒或者野生型BVDV的存在。[0073]动物中所诱导的免疫反应的程度和性质可通过利用多种技术进行评估。例如，可从接种动物中收集血清并测试对嵌合体病毒具有特异性的抗体存在与否。
[0074]在进行此类评价时，关键是该动物所产生的抗体在测定中对测试抗原具有特异性，并且不与来自其他瘟病毒的相同抗原交叉反应。不期望识别并结合叉角羚瘟病毒Ems蛋白质的抗体也会与野生型BVDV上存在的Ems蛋白质结合。但是，向牛反复施用嵌合瘟病毒偶尔导致产生对野生型BVDV Ems蛋白质呈现有限交叉反应的抗体。这些交叉反应性抗体能够与结合至平板(即，测试抗原)的野生型BVDV Ems蛋白质结合，产生了可表明先前感染了野生型BVDV或接种了常规BVDV疫苗的结果，即假阳性结果。因此，对改进测定的精确性和特异性存在需求。这可通过在存在叉角羚Ems蛋白质时温育来自动物的血清来完成。蛋白质可以是天然的，即从叉角羚瘟病毒纯化，或者可以是重组表达的。添加叉角羚Ems蛋白质可以在血清添加至测定平板之前进行，或者可以与血清添加至测定平板的同时进行。这在去除Ems交叉反应抗体时是有效的，并产生更精确和可靠的测定。
[0075]本发明的试剂盒可包括一种或多种用于检测和区(I)BVDV-感染动物或常规BVDV疫苗免疫接种动物与(2)施用了嵌合瘟病毒动物的试剂。该试剂盒可包括用于分析样品中是否存在嵌合瘟病毒中不存在的全BVDV或BVDV多肽、表位或多核苷酸序列的存在的试剂。或者，本发明的试剂盒可包括用于分析样品中是否存在野生型BVDV中不存在的嵌合瘟病毒或多肽、表位或多核苷酸序列。可利用抗体、PCR、杂交和本领域技术人员已知的其他检测方法测定病毒、多肽或多核苷酸序列的存在。
[0076]本发明的另一试剂盒可提供用于检测针对特定表位的抗体的试剂。所述表位在嵌合瘟病毒中存在而在野生型BVDV中不存在，或者所述表位在野生型BVDV中存在而在嵌合瘟病毒中不存在。此类试剂用于分析样品中抗体的存在，而且是本领域技术人员容易知晓和得到的。可利用本领域技术人员已知的标准检测方法来测定抗体的存在。
[0077]在某些实施方式中，所述试剂盒可包括一组印刷说明书或标签，其说明该试剂盒用于检测和区分BVDV-感染或BVDV-接种动物与施用嵌合瘟病毒的动物。
[0078]抗体、多种抗体
[0079]抗体可以是单克隆、多克隆或重组体。抗体可针对免疫原或其部分制备。例如，可分离出基于免疫原的氨基酸序列或通过克隆技术重组制备的合成肽或其天然基因产物和/或部分，并将其用作免疫原。通过本领域技术人员熟知的标准抗体产生技术(诸如，Harlowand Lane, “Antibodies:A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, NY, (1988)概括描述的)，免疫原可用来产生抗体。还可通过本领域技术人员已知的方法从抗体制备抗体片段，且其包括Fab、F(ab’)2和Fv。
[0080]在产生抗体时，可通过本领域已知的标准免疫学方法来完成对所需抗体的筛选。一般而言，ELISAs和免疫印记法都是可以使用的免疫测定类型，而且二者均是本领域技术人员熟知的。在测定中可使用多克隆和多克隆抗体。用于结合BVDV Ems蛋白质的抗体可与固体载体底物结合。抗体可与可检测部分或标记缀合。考虑用于本发明的可检测部分可包括但不限于荧光、金属、酶和放射性标记物，其包括但不限于生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酯酶、b-半乳糖苷酶、过氧化物酶、脲酶、荧光素、若丹明、氚、14C和碘化作用。与可检测部分缀合的抗体可结合BVDV Ems蛋白质，如同在竞争性ELISA测定中一般，或者其可以结合来自动物的与BVDV Erns蛋白质结合的抗体，如同在间接ELISA测定中一般。[0081]在常规标记缀合物特异性结合测定技术中，使待测定的液体培养基的样品与各种试剂组合物相结合。此类组合物包括含有与标记合并的结合组分的标记。在测定下缀合物中的该结合组分参与试剂组合物的其他成分(如果有的话)和培养基中的配体，形成结合反应体系，该体系产生两种类型或形式的缀合物，例如，结合种类(缀合复合物)和游离种类(free species)。在结合种类中，缀合物的结合组分通过相应的结合配偶体结合,而在游离种类中，该结合组分并非如此结合。分析物的量与结合缀合物对未结合缀合物的量成比例。
[0082]测定发展的概括描述
[0083]通过应用本文所述的本发明，能够将已经施用了嵌合瘟病毒(其中BVDV的Ems蛋白质已经被来自叉角羚瘟病毒的Ems蛋白质置换)的牛与天然感染了野生型BVDV或免疫接种了常规BVDV疫苗的牛区分开来。各种年龄的牛未被处理，或者施用三剂量活的或灭活的嵌合瘟病毒或者活的或灭活的BVDV，各剂量间约三周。每次施用后2-3周或之后但是在下一次施用之前收集血清样品。为区分接受嵌合瘟病毒的牛或者未接受处理的那些牛与被BVDV野外(野生型)菌株感染或用常规BVDV疫苗免疫接种的那些牛，通过区分诊断测定(differential diagnostic assay)测试血清样品。
[0084]对于竞争性ELISA，野生型BVDV或嵌合瘟病毒Ems蛋白质(天然地、合成地或重组来源的)可用作测定中的抗原来源。如果存在于野生型BVDV上的Ems蛋白质用作测试抗原的话，通过已标记野生型BVDV Ems-特异性mAb的结合的缺乏表明，在牛血清中存在着与野生型BVDV-特异性表位结合的抗体，这预示着自然(野生型)感染或接种了常规BVDV疫苗。相反，来自给予了嵌合瘟病毒的牛的血清不会含有与涂覆平板的野生型BVDV Ems蛋白质结合的抗体。因此，已标记的野生型BVDV Ems-特异性mAb将与已结合蛋白质结合并导致随后的显色。
[0085]在上述测定中，令人惊讶的是，识别并结合叉角羚瘟病毒Ems蛋白质的抗体也会与野生型BVDV上存在的Ems蛋白质结合。因为向牛反复施用嵌合瘟病毒偶尔会导致产生对野生型BVDV Ems蛋白质呈现出有限交叉反应性的抗体，这产生了可表明先前感染了 BVDV或接种了常规BVDV疫苗的结果，因此，对改进测定的精确性和特异性存在需求。
[0086]对于改进的竞争性ELISA，在牛血清添加至测定平板之前或同时，用重组表达的、叉角羚瘟病毒Ems蛋白质温育血清样品。这有效去除了可与叉角羚瘟病毒Ems蛋白质结合但也已经发展了与野生型BVDVEms蛋白质的交叉反应性的抗体。因此，测定中的显色表明动物未经受BVDV暴露或者用嵌合瘟病毒接种，而无显色表明动物暴露于野生型BVDV或接种了常规BVDV疫苗。
[0087]本发明通过下述实施例进一步阐述，但其决不受限于下述实施例。
[0088]实施例
[0089]实施例1
[0090]构建表达BVDV-NADL Erns的重组体杆状病毒。通过PCR从含质粒的全长BVDV-NADL CDNA扩增编码BVDV的C基因的3 ’部分和全长Ems基因的遗传融合物的DNA 分子，引物为 01igo250(SEQ ID N0:1 ;5’ -CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC-3’ )和01igo252(SEQID NO: 2 ;5’ -TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC-3’ )。按照制造商指示，将该 PCR产物克隆到 pENTR?/D-T0P0 (Invitrogen ；Carlsbad, CA)中并转化到 One Shot*' CompetentE.coli (Invitrogen)中。提取重组质粒并通过测序确认插入物。该质粒命名为pENTR_E?s。按照制造商指不，利用pENTR_E?s和BaculoDirect?杆状病毒表达体系(Invitrogen)构建表达BVDV-NADL Ems蛋白质的重组杆状病毒。产生该表达BVDV-NADL Ems蛋白质的重组杆状病毒，噬斑纯化，并贮存于4°C和_80°C。通过免疫荧光染色和蛋白质斑迹法，利用BVDVErns 特异性 MAbl5C5 (Idexx Laboratories Inc.;Westbrook, ME),确认 BVDV-NADL Erns 蛋白质在重组杆状病毒中的表达。
[0091]利用类似的策略在杆状病毒中表达叉角羚瘟病毒Ems蛋白质。通过免疫荧光染色和蛋白质斑迹法，利用抗-His (C-term)MAb (Invitrogen),确认叉角玲Erns蛋白质的表达。
[0092]对于ELISA抗原的产生，使100mL悬浮培养物中的Sf21或Sf9细胞以0.2_5M0I’s的感染重组杆状病毒储液。在27°C温育2-4天之后收获细胞。使细胞低速(约800g)离心lOmin，收集细胞。用天然裂解/结合缓冲液(pH8.0，50mM NaH2PO4,300mM NaCl、10mM咪唑和1% IGEPAL CA-630)裂解细胞。用移液管上下转移混合物，以打碎细胞凝块，然后在_80°C冷冻超过I小时。融化后，通过在SOOOg于4°C离心20分钟，使混合物变澄清。将命名为Baculo-Pronghorn Erns溶胞产物的最终上清液等分并忙存于_80°C。
[0093]在进行该测定时，在4 °C 将 ELISA 板用 100 μ I MAb WB210/ 孔(VeterinaryLaboratory Agency, Surrey, UK)涂覆过夜，MAb WB210 特异性结合结合 BVDVl 型 Ems 蛋白质，在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(PH9.0)中稀释至lug/ml。第二天，用PBST洗涤缓冲液(含
0.05% Tween20的PBS)洗涤该板三次并于37°C用封闭缓冲液(PBST+1%酪素钠盐)温育I小时。随后用PBST将该板洗涤三次，向每个孔中添加100 μ IBaculo-BVDV Erns溶胞产物(在PBS中稀释1:1600)，将板在37°C温育I小时。在该温育期间，将60 μ I牛血清样品添加至6(^1含有封闭缓冲液和预定浓度的8&(:1110-8￥0￥ Ems溶胞产物的样品稀释剂中。见该血清-稀释剂混合物在室温下温育至少30分钟。用PBST洗涤三次之后，将血清-稀释剂混合物转移至ELISA板的孔中。在每个板上留下对个空白孔，用作非竞争性15C5-HRP对照。将板在37°C温育I小时。用PBST洗涤三次之后，在37°C将100 μ I MAbl5C5_HRP缀合物(对BVDV Ems具有特异性；在封闭缓冲液中稀释)添加至各孔中，持续I小时。三次洗涤后，将100 μ IABTS底物(KPL，Gaithersburg, MD)加至各孔，并在室温下温育20-60分钟，以实现显色。在405/490nm的波长下测量光密度(OD)。通过下式计算各血清样品的来自缀合物对照的OD抑制百分比:
[0094]%抑制=(样品的 0D) + (15C5-HRP 对照的平均 0D) χ100%。
[0095]每个处理组中的六头BVDV血清阴性牛被接种灭活BVDV (NADL菌株)、嵌合瘟病毒或无疫苗(NTX)。接种以三周间隔进行。在试验疫苗之前，在各时间点收集血清样品。然后在上述测定中测试样品。
[0096]结果
[0097]表1中呈现的数据代表施用了试验抗原的牛与未处理对照的血清型反应之比较。所呈现的数据利用原始诊断测定和改进的诊断测定(其为本发明)产生。在向牛施用两剂量灭活BVDV或两剂量灭活嵌合瘟病毒之后，收集血清样品。基于若干已知的BVDV阳性和阴性样品，如下计算阳性截断值(“Pos”)、阴性截断值(“Neg”)或不确定截断值(“+/_ “): [0098]<40% = Pos
[0099]40% -50%=+/-[0100]>50% = Neg
[0101]表1
【权利要求】
1.一种用于测定特异性结合牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Ems蛋白质的抗体存在与否的方法，所述方法包括下述步骤: a)从动物获得血清样品； b)用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述片段； c)检测所述样品中所述抗体存在与否。
2.权利要求1所述的方法，其中所述用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述样品的步骤在检测所述样品中所述抗体存在与否的步骤之前进行。
3.权利要求1所述的方法，其中所述用叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段温育所述样品的步骤与检测所述样品中所述抗体存在与否的步骤同时进行。
4.权利要求1所述的方法，其中所述抗体与存在于BVDVEms蛋白质中但是未存在于叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中的至少一个表位特异性结合。
5.权利要求或I或4所述的方法，其中所述抗体的存在表明所述动物已经被野生型BVDV感染或者已经用常规BVDV疫苗免疫接种。
6.权利要求或I或4所述的方法，其中所述抗体不存在表明所述动物还未被I)野生型BVDV感染，或者2)未用常规BVDV疫苗免疫接种，或者所述动物已经用表达叉角羚瘟病毒Ems蛋白质的嵌合瘟病毒免疫接种。
7.权利要求或I或4所述的方法，其中所述动物是易受BVDV感染的动物。
8.权利要求7所述的方法，其中所述动物是牛类、羊类、山羊类或猪类。
9.权利要求8所述的方法，其中所述动物是牛。
10.一种用于实施权利要求1或4所述方法的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包括促进对叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在的至少一个BVDV Ems表位的抗体的存在与否进行检测的试剂，其中所述试剂之一是叉角羚瘟病毒Ems蛋白质或其片段。
11.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂之一是与野生型BVDV或常规BVDV疫苗中存在的表位特异性结合的抗体，但是所述表位在叉角羚瘟病毒Ems蛋白质中不存在。
12.权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于实施选自下述的测定的试剂:酶联免疫吸附测定法(ELISA)、横向流动测定、免疫印记法、PCR、放射免疫测定、固相放射免疫测定、电化发光测定、免疫印记、免疫沉淀作用和免疫染色。
13.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中对显示不存在特异性结合牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Ems蛋白质的抗体的样品进一步测试下述物质的存在与否:(i)非Ems的BVDV蛋白质，或(ii)特异性结合非Ems的BVDV蛋白质的抗体。
14.权利要求13所述的方法，其中测试所述样品中与BVDV蛋白质特异性结合的抗体存在与否，进一步地，其中所述蛋白质选自P80和E2。
【文档编号】G01N33/68GK103917874SQ201280052231
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年8月10日 优先权日:2011年8月24日
【发明者】R.G.安肯鲍尔, L.D.尼尔森, N.L.奥伊恩, S-K.W.维尔科 申请人:佐蒂斯有限责任公司